miR-497-5p靶向VEGFA抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究

申 利，劉 佳，林星光

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院a.附屬梨園醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430077； b.附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430030)

子宮內(nèi)膜癌是常見的婦科腫瘤，位居世界腫瘤的第6位，近年來(lái)其發(fā)病率逐年增加，對(duì)女性生命健康已構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1-2]。微小RNAs(miRNAs)可通過與靶基因mRNA 3′UTR區(qū)不完全互補(bǔ)調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，參與子宮內(nèi)膜癌進(jìn)程[3-4]。miR-497-5p是miR-15家族成員，被證實(shí)在胃癌、卵巢癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中低表達(dá)，被認(rèn)為是一種重要的抑癌因子[5-7]。近年有研究[8]發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌組織中miR-497-5p異常低表達(dá)，且其表達(dá)水平與臨床分期、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但miR-497-5p在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用未見報(bào)道。本研究以子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞為研究對(duì)象，探討miR-497-5p對(duì)Ishikawa細(xì)胞侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的影響，旨在初步了解miR-497-5p在子宮內(nèi)膜癌發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶和LipofectaminTM2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)BD公司，Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司，聚偏氟乙烯(poly vinylidene fluorid，PVDF)膜購(gòu)于美國(guó)Hybond公司，青-鏈霉素購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。RIPA裂解液、結(jié)晶紫和多聚甲醇購(gòu)于中國(guó)碧云天，N-cadherin、Vimentin和E-cadherin單抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：6781-50、6771-100、AF0131，VEGFA、GAPDH單抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，貨號(hào)：MAB0294、10494-1-AP。辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠/兔IgG多抗購(gòu)于北京中杉金橋公司，貨號(hào)：ZB-2301。miR-497-5p mimic、miR-497-5p inhibitor及陰性對(duì)照、VEGFA慢病毒表達(dá)載體pLV-VEGFA質(zhì)粒、VEGFA 3′-UTR的野生型(VEGFA-WT)與突變型(VEGFA-MUT)雙熒光素酶質(zhì)粒均是由上海吉瑪制藥公司設(shè)計(jì)合成。Trizol Reagent、Real time PCR試劑和總RNA提取試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Applied Biosystems公司，雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce公司，ECL發(fā)光試劑盒和CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo公司，實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)于德國(guó)Biometra公司，熒光倒置顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染

將子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞(上海中科院細(xì)胞庫(kù))接種于含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為CO2體積分?jǐn)?shù)5%、濕度飽和和溫度37 ℃。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ishikawa細(xì)胞分為：對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-497-5p mimics陰性對(duì)照)、miR-497-5p組(轉(zhuǎn)染miR-497-5p mimics)、pLV-VEGFA組(轉(zhuǎn)染pLV-VEGFA質(zhì)粒)和miR-497-5p+VEGFA組(轉(zhuǎn)染miR-497-5p mimics和pLV-VEGFA質(zhì)粒)，參照LipofectaminTM2000說(shuō)明書步驟將miR-497-5p mimics陰性對(duì)照、miR-497-5p mimics和pLV-VEGFA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.3 Real-time PCR檢測(cè)miR-497-5p和VEGFA mRNA的表達(dá)

收集對(duì)照組、miR-NC組和miR-497-5p組轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，參照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書步驟提取各組Ishikawa細(xì)胞的總RNA。測(cè)定總RNA濃度和純度，隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，miR-497-5p引物(F：5′-CGCCAGC AGCACACTGTGG-3′；R：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′)和VEGFA引物(F：5′-CGAAGTGGTGGTCATGGATG-3′；R：5′-TT-CTGTATCAGTCTTTCCTGGTGAG-3′)是由上海吉?jiǎng)P生物公司合成。2-ΔΔCt計(jì)算miR-497-5p和VEGFA mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-497-5p和VEGFA的靶向關(guān)系

參照雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟，將VEGFA-WT與VEGFA-MUT雙熒光素酶質(zhì)粒分別與miR-497-5p mimics或miR-497-5p mimics陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h。棄培養(yǎng)液后，先以磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞，再加入細(xì)胞裂解液。裂解15 min后，離心收集上清液進(jìn)行檢測(cè)。以螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性的比值表示細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.5 Western blot檢測(cè)VEGFA、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)

收集miR-NC組、miR-497-5p組、pLV-VEGFA組和miR-497-5p+VEGFA組轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，RIPA裂解法液提取總蛋白。定量后，每孔加載60 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳完畢后，轉(zhuǎn)PVDF膜。5%去脂奶粉封閉2 h后，加入一抗(VEGFA 1:500，N-cadherin 1:1000，Vimentin 1:1000，E-cadherin 1:1000，GAPDH 1:1000)4 ℃下孵育24 h，次日加入二抗(1:2000)常溫下孵育1.5 h。化學(xué)發(fā)光顯影后，Quntity One軟件分析各條帶灰度值。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH條帶灰度值。

1.6 Transwell小室檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞的侵襲和遷移

用適量的無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞濃度至2×104個(gè)·mL-1。侵襲實(shí)驗(yàn)：在下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基500 μL，Transwell小室(包被基質(zhì)膠)上室中加入上述細(xì)胞懸液200 μL。置于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h后，小心擦去上室內(nèi)側(cè)細(xì)胞，分別用4%多聚甲醛、0.5%結(jié)晶紫對(duì)Transwell小室膜底部細(xì)胞進(jìn)行固定和染色。以顯微鏡下隨機(jī)選取的5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)均值表示侵襲細(xì)胞數(shù)量。遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell小室不需要鋪基質(zhì)膠模擬人工基底膜，其余步驟和侵襲實(shí)驗(yàn)一致。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)miR-497-5p對(duì)Ishikawa細(xì)胞中VEGFA mRNA表達(dá)的影響

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-497-5p組細(xì)胞中miR-497-5p的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，而VEGFA mRNA的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；miR-NC組細(xì)胞中miR-497-5p和VEGFA mRNA的表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 對(duì)照組、miR-NC組和miR-497-5p組細(xì)胞中miR-497-5p和VEGFA mRNA的表達(dá)水平

2.2 VEGFA是miR-497-5p的潛在靶基因

TargetScan生物學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，VEGFA 3′UTR與miR-497-5p序列存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)(表2)。檢測(cè)熒光素酶活性顯示，與VEGFA-WT共轉(zhuǎn)染的miR-497-5p組細(xì)胞的熒光素酶活性與miR-NC組比較明顯降低(P<0.05)，而同VEGFA-MUT共轉(zhuǎn)染的miR-497-5p組細(xì)胞的熒光素酶活性與miR-NC組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表2 VEGFA 3′UTR與miR-497-5p互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)

表3 miR-NC組和miR-497-5p組細(xì)胞熒光素酶活性的比較

2.3 miR-497-5p可負(fù)向VEGFA蛋白的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-497-5p組細(xì)胞VEGFA蛋白的表達(dá)水平與miR-NC組比較明顯降低，pLV-VEGFA組細(xì)胞中VEGFA蛋白表達(dá)與miR-NC組比較明顯升高(P<0.05)；然而，與pLV-VEGFA組比較，miR-497-5p+VEGFA組細(xì)胞中VEGFA蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見圖1。

A：Western blot檢測(cè)VEGFA蛋白水平；B：各組細(xì)胞中VEGFA蛋白表達(dá)水平比較。*P<0.05與miR-NC組比較，#P<0.05與pLV-VEGFA組比較。

2.4 miR-497-5p靶向VEGFA抑制Ishikawa細(xì)胞的侵襲和遷移

Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果(圖2)顯示，miR-497-5p組中的侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)與miR-NC組比較均明顯減少，而pLV-VEGFA組中的侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)與miR-NC組比較均明顯增多(P<0.05)；但與pLV-VEGFA組比較，miR-497-5p+VEGFA組中侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均明顯減少(P<0.05)。

A：Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力；B：各組侵襲細(xì)胞數(shù)比較；C：Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力；D：各組遷移細(xì)胞數(shù)比較。*P<0.05與miR-NC組比較，#P<0.05與pLV-VEGFA組比較。

2.5 miR-497-5p靶向VEGFA抑制Ishikawa細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-497-5p組細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)與miR-NC組比較明顯升高，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)水平與miR-NC組比較明顯降低(P<0.05)；同時(shí)，pLV-VEGFA組細(xì)胞中E-cadherin蛋白的表達(dá)水平明顯低于miR-NC組，而N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)明顯高于miR-NC組(P<0.05)。但是，miR-497-5p+VEGFA組細(xì)胞中E-cadherin蛋白的表達(dá)明顯高于pLV-VEGFA組，而N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)明顯低于pLV-VEGFA組(P<0.05)，見圖3。

A：Western blot檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平；B：各組細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)的比較。*P<0.05與miR-NC組比較，#P<0.05與pLV-VEGFA組比較。

3 討論

miR-497-5p是一種由MIR497HG基因編碼的miRNA，可通過多種途徑或機(jī)制調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程[9-10]。miR-497-5p已被證實(shí)在宮頸癌組織中呈低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可通過靶向IKCa1抑制腫瘤細(xì)胞惡性增殖[11-12]。卵巢癌中miR-497表達(dá)水平降低與患者總生存率縮短關(guān)系密切，外源性miR-497可通過靶向Smad泛素化調(diào)節(jié)因子1(Smad ubiquitination regulatory factor 1,SMURF1)抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲[13]。提示，miR-497-5p可能抑制婦科腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，但在子宮內(nèi)膜癌中的作用鮮有報(bào)道。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-497-5p mimics成功上調(diào)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中miR-497-5p表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，Ishikawa細(xì)胞的侵襲、遷移能力以及間質(zhì)表型標(biāo)記蛋白N-cadherin、Vimentin的表達(dá)水平均明顯降低，而上皮表型標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)升高。EMT是賦予腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的一種過程，也是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因[14]。E-cadherin、N-cadherin和Vimentin三者是EMT發(fā)生的重要標(biāo)志，在腫瘤細(xì)胞的侵襲、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用[15-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，miR-497-5p在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要的抑制作用。這與以往關(guān)于miR-497-5p抑制婦科腫瘤進(jìn)展的研究相符。

為探究miR-497-5p在子宮內(nèi)膜癌中的作用機(jī)制，本研究采用TargetScan生物學(xué)信息學(xué)軟件和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，VEGFA是miR-497-5p的直接靶基因。VEGFA在子宮內(nèi)膜癌組織中異常高表達(dá)，與腫瘤分期、病理分級(jí)有關(guān)，而靶向抑制其表達(dá)能夠明顯抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[18-19]。有研究[20]發(fā)現(xiàn)，miR-497可通過靶向VEGFA抑制大腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究通過轉(zhuǎn)染VEGFA慢病毒表達(dá)載體成功上調(diào)VEGFA表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，miR-497-5p對(duì)Ishikawa細(xì)胞侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用明顯減弱。提示，miR-497-5p可通過靶向VEGFA抑制Ishikawa的侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

綜上所述，miR-497-5p在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要的抑制作用，這可能是通過靶向下調(diào)VEGFA表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。