枇杷花多酚對脂肪酶的抑制作用

黃桂麗　王毓寧　馬佳佳　隋思瑤　孫靈湘

摘要： 以枇杷花為原料，提取枇杷花多酚，并通過大孔樹脂AB-8純化，得到枇杷花多酚提取物，然后從抑制率、抑制機理、抑制類型和熒光淬滅效應(yīng)幾個方面探究枇杷花多酚對脂肪酶的抑制作用。結(jié)果表明，枇杷花多酚對脂肪酶具有很好的抑制效果，半抑制質(zhì)量濃度為（66.1±6.36） μg/ml，以可逆混合性方式抑制脂肪酶的活性。枇杷花多酚能與脂肪酶生成復合物，結(jié)合位點數(shù)為1。

關(guān)鍵詞： 枇杷花多酚;脂肪酶;抑制作用

中圖分類號： TS201.2 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）01-0192-05

Inhibitory effect of loquat flowers polyphenolics on lipase activity

HUANG Gui-li， WANG Yu-ning， MA Jia-jia， SUI Si-yao， SUN Ling-xiang

（Suzhou Academy of Agricultural Sciences， Suzhou 215105， China）

Abstract：The total polyphenolics were extracted and purified by AB-8 macroporous resin from loquat flowers. To investigate the inhibitory kinetics and mechanism of polyphenolics from loquat flowers on lipase， the inhibitory rate， inhibitory mechanism， inhibition type and fluorescence quenhing effect were explored. The results indicated that polyphenolics from loquat flowers showed a remarkable inhibitory effect on lipase activity with half-maximal inhibitory concentration （IC50） value of （66.1±6.36） μg/ml in a mixed-type manner. Loquat flowers polyphenolics can form complex with lipase， and the number binding sites is one.

Key words： loquat flowers polyphenolics;lipase;inhibitory effect

隨著生活環(huán)境的變化和社會經(jīng)濟的發(fā)展，世界范圍內(nèi)肥胖癥[體質(zhì)量指數(shù)（BMI）≥30 kg/m2]患病率急劇上升。2018年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計的全球成人肥胖患病率男性和女性分別為11%和15%[1]。肥胖已成為世界性的健康問題。肥胖可能導致許多慢性疾病，如心血管疾病、糖尿病、癌癥和代謝性綜合征[2-3]。臨床肥胖患者體質(zhì)量減輕5%～10%可顯著降低患肥胖相關(guān)疾病的風險，改善包括血糖、血脂和血壓在內(nèi)的異常危險因素，甚至能改善一些早期代謝并發(fā)癥[4]。肥胖產(chǎn)生的根本原因是膳食中脂肪被脂肪酶水解為游離脂肪酸、甘油二酯、甘油單酯和甘油，然后被小腸吸收利用[5]。在這一過程中脂肪酶起著關(guān)鍵的作用。因此，通過抑制脂肪酶活性來阻礙膳食脂肪的吸收被認為是一種潛在的減肥策略。目前，研究和開發(fā)脂肪酶天然抑制劑受到廣泛關(guān)注。

植物多酚廣泛分布于植物的各器官中，是植物的次生代謝產(chǎn)物，與植物的生長、代謝、繁殖、抗逆等密切相關(guān)[6-7]。近年來，隨著天然活性成分研發(fā)的興起，植物多酚的多方面開發(fā)利用成為人們關(guān)注的熱點。植物多酚具有抗氧化、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗病毒、抑菌等多種活性作用[8]。

枇杷[Eriobotrya japonica（Thunb.） Lindl.]為薔薇科植物，原產(chǎn)于中國東南地區(qū)，主要分布在長江以南各省，是一種具有藥用價值的常綠果樹。作為傳統(tǒng)的中草藥，枇杷花用于治療咳嗽化痰?，F(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，枇杷花具有抑菌、抗氧化、止咳、化痰、抗炎、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等藥用價值[9]。枇杷花具有很好的藥效主要源于其含有豐富的多酚類物質(zhì)。在枇杷栽種過程中，為了達到枇杷果實的優(yōu)質(zhì)增產(chǎn)，大量枇杷花被疏除，這為枇杷花的利用提供了充足的原材料。目前對枇杷花的開發(fā)利用主要有枇杷花茶、枇杷花醋、枇杷花酒、枇杷花露、蜜煉枇杷膏等產(chǎn)品[10]。吳媛琳等[11]研究發(fā)現(xiàn)，枇杷花的多酚含量高于葉。然而，枇杷花多酚對脂肪酶的作用鮮有報道。鑒于此，本研究擬通過酶抑制動力學和熒光淬滅等試驗研究枇杷花多酚與脂肪酶的相互作用情況，以揭示枇杷花多酚抑制脂肪酶的分子機制，為推動枇杷花多酚在食品領(lǐng)域的應(yīng)用，以及開發(fā)新型降脂功能性產(chǎn)品提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷花采集于江蘇省洞庭東山枇杷采摘示范園。脂肪酶（毛霉菌）、對硝基苯酚棕櫚酸酯（4-NPP）和二甲基亞砜（DMSO）為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100高速多功能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品;ME104E電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品;UV-800紫外分光光度計，美國貝克曼公司產(chǎn)品;Cary Eclipse熒光分光光度計，美國Agilent公司產(chǎn)品;KQ-250V型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司產(chǎn)品;TGL-16M臺式高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 枇杷花多酚的提取、純化及含量測定 參照我們前期的試驗方法進行枇杷花多酚的提取和含量測定[12]。枇杷花烘干至恒質(zhì)量，粉碎，過60目篩。稱取50 g枇杷花粉末，按照料液比1 g∶50 ml加入50%乙醇溶液，在61 ℃超聲提取9 min，重復提取3次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮。過AB-8大孔樹脂純化，濕法裝柱（20 mm×300 mm），枇杷花多酚粗提液以每小時1倍柱床體積的流速上樣，吸附平衡后用4倍柱床體積的去離子水洗脫去除水溶性蛋白質(zhì)、還原糖和多糖等雜質(zhì)，再用50%的乙醇溶液以每小時1.5倍柱床體積的流速洗脫，減壓濃縮，冷凍干燥得到純化的枇杷花多酚。用福林酚法測定枇杷花多酚含量。

1.3.2 枇杷花多酚對脂肪酶活性的影響 脂肪酶活性測定參照Liu等[13]的方法，具體步驟如下：枇杷花多酚溶于DMSO，以7.5 mmol/L的4-NPP為底物，在0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.8）的3 ml測定體系中，加入0.3 ml不同質(zhì)量濃度的枇杷花多酚溶液，最后加入0.05 ml脂肪酶水溶液，立刻混勻，在37 ℃條件下測定波長405 nm下的脂肪酶活性。脂肪酶的終質(zhì)量濃度為2 μg/ml，消光系數(shù)按ε=12 010.7 （mol/L）-1cm-1計算。以酶的相對剩余活性對枇杷花多酚濃度作圖，計算脂肪酶的半抑制濃度（IC50）。

1.3.3 枇杷花多酚對脂肪酶活性的抑制試驗 以7.5 mmol/L的4-NPP為底物，在0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.8）的3 ml測定體系中，改變加入脂肪酶的量，測定不同質(zhì)量濃度枇杷花多酚對脂肪酶催化4-NPP活性的影響。以剩余脂肪酶活性對加入的酶量作圖，由此判斷枇杷花多酚對脂肪酶的抑制作用機理。

1.3.4 枇杷花多酚對脂肪酶活性的抑制作用類型試驗 在脂肪酶活性測定體系中，固定脂肪酶的濃度，改變底物4-NPP濃度，測定不同質(zhì)量濃度枇杷花多酚對脂肪酶活性的影響，其中4-NPP的濃度分別為0.125 mmol/L、0.140 mmol/L、0.160 mmol/L、0.200 mmol/L、0.250 mmol/L，枇杷花多酚質(zhì)量濃度分別為0 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml。通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，判斷枇杷花多酚的抑制類型并求出酶抑制動力學常數(shù)[14]。

1.3.5 枇杷花多酚對脂肪酶作用的熒光發(fā)射光譜分析 熒光淬滅試驗可以用來分析蛋白質(zhì)和配體之間的相互關(guān)系[15]。參照Chai等[16]的方法進行試驗。激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)和發(fā)射波長的光帶寬度為5 nm，測定290～450 nm波長處脂肪酶溶液的熒光發(fā)射光譜[17-18]。在測定體系中，枇杷花多酚的質(zhì)量濃度分別為0 μg/ml、1 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、6 μg/ml、8 μg/ml、10 μg/ml。根據(jù)Stern-Volmer方程F0/F=1+Kqτ0[I]=1+Ksv[I][19]，將熒光淬滅試驗結(jié)果進行作圖。對于靜態(tài)淬滅，根據(jù)lg[（F0-F）/F]對lg[I]的線性方程lg[（F0-F）/F] = lgKA+n lg[I][20]求得結(jié)合常數(shù)（KA）和結(jié)合位點數(shù)（n）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗重復3次，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用Prism 6進行試驗數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷花多酚對脂肪酶的抑制作用

圖1顯示，枇杷花多酚對脂肪酶具有很好的抑制效果，并且呈質(zhì)量濃度梯度依賴性。隨著枇杷花多酚質(zhì)量濃度的升高，脂肪酶的活性快速降低，但沒有完全受到抑制。枇杷花多酚引起脂肪酶活性50%喪失的質(zhì)量濃度（IC50）為（66.1±6.36） μg/ml。

2.2 枇杷花多酚對脂肪酶的抑制機理

固定底物濃度，改變反應(yīng)體系中脂肪酶量，以剩余酶活性對酶量作圖，得到一組通過原點的直線（圖2）。由圖2可知，隨著枇杷花多酚質(zhì)量濃度的升高，直線的斜率降低，說明枇杷花多酚對酶的抑制是可逆過程，它是通過降低脂肪酶的催化效率，導致脂肪酶活性的下降，而不是使脂肪酶變性失活[21]。

2.3 枇杷花多酚對脂肪酶的抑制類型

經(jīng)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，得到以反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/V）對底物濃度的倒數(shù)（1/[S]）的線性回歸關(guān)系（圖3a）。隨著抑制劑枇杷花多酚質(zhì)量濃度的上升，直線的斜率上升，且這些直線相交于第二象限，表明枇杷花多酚對脂肪酶的抑制類型為混合型抑制[22]。這個結(jié)果還揭示枇杷花多酚既能與脂肪酶結(jié)合也能與脂肪酶-底物復合體結(jié)合。枇杷花多酚對脂肪酶的抑制常數(shù)（KI）可以通過以直線的斜率對枇杷花多酚質(zhì)量濃度作圖得到（圖3b），枇杷花多酚對脂肪酶-底物復合物的抑制常數(shù)（KIS）可以通過以直線和縱軸的截距對枇杷花多酚質(zhì)量濃度作圖得到（圖3c）。KI和KIS的值分別為95.84 μg/ml和208.63 μg/ml。枇杷花多酚對脂肪酶的KIS大于KI，說明枇杷花多酚對脂肪酶的結(jié)合能力大于對脂肪酶-底物復合物的結(jié)合能力[23]。

2.4 枇杷花多酚作用于脂肪酶的熒光光譜分析

2.4.1 熒光淬滅光譜 以熒光淬滅試驗分析枇杷花多酚與脂肪酶之間的相互作用。如圖4a所示，枇杷花多酚對脂肪酶有很強的抑制活性。隨著枇杷花多酚質(zhì)量濃度的升高，脂肪酶的熒光強度逐漸降低。當枇杷花多酚的質(zhì)量濃度達到10 μg/ml時，脂肪酶的相對熒光強度降到49.58%（圖4b）。

2.4.2 熒光淬滅Stern-Volmer曲線 根據(jù)枇杷花多酚對脂肪酶熒光淬滅的Stern-Volmer曲線（圖5），計算得到枇杷花多酚對脂肪酶的KSV（Stern-Volmer方程的淬滅常數(shù)）為1.134×10-1μg/ml，Kq（生物分子淬滅速率常數(shù)）為1.134×107μg/（ml·s）。

2.4.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù) 根據(jù)lg[（F0-F）/F]對lg[I]的雙對數(shù)曲線（圖6），計算得到枇杷花多酚與脂肪酶的結(jié)合常數(shù)（KA）為0.113 6 μg/ml，結(jié)合位點數(shù)為0.944。說明枇杷花多酚與脂肪酶之間僅有1個結(jié)合位點。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助乙醇溶液提取方法從枇杷花粉末中提取得到枇杷花多酚粗提物，然后通過大孔樹脂AB-8純化得到枇杷花多酚純化物，用純化的枇杷花多酚對脂肪酶進行抑制效果分析。結(jié)果表明，枇杷花多酚對脂肪酶活性具有很好的抑制作用，半抑制率（IC50）為（66.10±6.36） μg/ml，抑制類型為可逆混合型抑制。熒光淬滅分析結(jié)果表明，枇杷花多酚能與脂肪酶結(jié)合生成復合物，結(jié)合位點數(shù)為1。枇杷花多酚能抑制脂肪酶活性，從而阻礙膳食中脂肪的消化和吸收，減少脂肪的攝取，因此具有開發(fā)成天然降脂產(chǎn)品的應(yīng)用價值。

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（責任編輯：張震林）

收稿日期：2020-04-30

基金項目：蘇州市科技計劃項目（SNG201909）; 江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項目[CX（17）3029]

作者簡介：黃桂麗（1986-），女，河南潢川人，博士，助理研究員，研究方向為食品保鮮與加工。（E-mail）huanggl2015@163.com

通訊作者：王毓寧， （E-mail）wyn705@163.com