延胡索乙素聚乳酸納米粒的制備及其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

荊 玲，范炎峰，鄒夢夢，劉寬浩

(1.黃河科技學(xué)院，河南 鄭州 450063；2.鄭州市第六人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

延胡索乙素是從罌粟科紫堇屬植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 中提取出的生物堿成分［1］,具有鎮(zhèn)痛、降血壓、抗心律失常、抗腫瘤等多種藥理活性［2］。但該成分體內(nèi)不穩(wěn)定［3］,體外溶出低,水溶性差,口服吸收的生物利用度不理想(僅為6.59%)［4］,導(dǎo)致臨床應(yīng)用受限。

隨著人類活動(dòng)增加及外來物種入侵,延胡索生長環(huán)境惡化,進(jìn)而瀕臨滅絕［5］,故提高該資源使用效率及生物利用度具有重要意義,目前已有將其制成自微乳、脂質(zhì)體的報(bào)道［6-7］。其中,自微乳雖可顯著促進(jìn)藥物吸收,但處方中需加入大量表面活性劑,具有潛在溶血風(fēng)險(xiǎn)［8］；脂質(zhì)體雖可保護(hù)藥物不被降解,提高藥物體內(nèi)穩(wěn)定性、生物利用度,但存在包封率較低、貯存穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)［9］。

聚合物納米粒能有效控制藥物釋放,提高穩(wěn)定性,改善生物利用度,正日益受到相關(guān)學(xué)者的關(guān)注。聚乳酸作為藥物輔料被收錄進(jìn)《美國藥典》,是納米給藥系統(tǒng)的載體,與難溶性藥物制成納米粒后可顯著促進(jìn)后者體內(nèi)吸收,提高其生物利用度［10-14］。本實(shí)驗(yàn)采用改良的自乳化溶劑擴(kuò)散法制備延胡索乙素聚乳酸納米粒,對其基本性質(zhì)、體外溶出進(jìn)行研究,并考察體內(nèi)藥動(dòng)學(xué),以期為相關(guān)口服制劑的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

AR2240 型電子天平［梅特勒托利多儀器(上海) 有限公司］；U3000 型高效液相色譜儀(美國戴安公司)；MYP13-2S 型磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)；JC-220A 型氮?dú)獯祾邇x(浙江創(chuàng)聚環(huán)保有限公司)；UVS-1 型渦旋振蕩器(北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司)；Millipore 超濾離心管(南京裕成實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；TENLIN型實(shí)驗(yàn)室超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(江蘇天翔儀器有限公司)；Master-sizer 型粒度分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)。

延胡索乙素原料藥 (批號180615,純度98.0%,上海中藥制劑有限公司)；延胡索乙素對照品(批號110726-201604,純度99.2%,中國食品藥品檢定研究院)。聚乳酸(PLA,相對分子質(zhì)量15 000,批號171013,上海市協(xié)泰化工有限責(zé)任公司)。透析袋(美國Sigma 公司,分子量8～14 kDa)；泊洛沙姆188 (批號WPE1566D,德國BASF 公司)。SD 大鼠,雌雄兼具,體質(zhì)量約為300 g,購于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK (豫) 2016-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 延胡索乙素聚乳酸納米粒制備 取延胡索乙素30 mg、聚乳酸450 mg,加到30 mL 有機(jī)溶劑(乙醇-丙酮比例1 ∶1) 中,超聲溶解,作為有機(jī)相；配制泊洛沙姆188 溶液(5 g/L) 80 mL,作為水相,在磁力攪拌下將有機(jī)相緩慢滴到水相中,恒溫?cái)嚢?5 min 后在40 ℃下減壓旋蒸30 min (每2 min排氣1 次),除去有機(jī)溶劑,立即置于冰水混合物中固化15 min,補(bǔ)充水相至80 mL,即得。同法制備不加延胡索乙素的空白納米?；鞈乙?。

2.2 延胡索乙素含量測定

2.2.1 色譜條件 Thermo C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相乙腈-0.1%乙酸(三乙胺調(diào)pH 值至6.0)(55 ∶45)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長281 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 供試品溶液制備 精密量取延胡索乙素聚乳酸納米粒1.0 mL,置于25 mL 量瓶中,丙酮超聲處理2 min,靜置至室溫后流動(dòng)相定容至刻度,12 500 r/min 離心10 min,取上清液,即得。

2.2.3 線性關(guān)系考察 稱取延胡索乙素對照品10 mg,溶于10 mL 乙腈中,得到1 000 μg/mL 貯備液,精密量取2.5 mL,置于50 mL 量瓶中,流動(dòng)相定容,得到50 μg/mL 對照品溶液,流動(dòng)相依次稀釋至25.0、12.5、5.0、0.5、0.05 μg/mL,在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下各取10 μL 進(jìn)樣測定。以延胡索乙素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸,得方程為Y=2.108 5X+0.100 9 (r=0.999 7),在0.05～25.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 方法學(xué)考察 取供試品溶液,于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,測得延胡索乙素峰面積RSD 為0.62%,表明溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取 25.0、12.5、0.05 μg/mL對照品溶液,在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次,測得延胡索乙素峰面積RSD 分別為0.26%、0.21%、0.38%,表明儀器精密度良好。按“2.2.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液,在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,測得延胡索乙素峰面積RSD 為0.83%,表明該方法重復(fù)性良好。精密量取4 mL “2.2.3” 項(xiàng)下貯備液,置于10 mL 量瓶中,乙腈定容,得到400 μg/mL 對照品溶液。取1.0 mL 空白納米?；鞈乙?置于25 mL量瓶中,加入上述對照品溶液0.5、1.0、1.5 mL后丙酮超聲處理2 min,流動(dòng)相定容至刻度,在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測定6 次,測得延胡索乙素平均加樣回收率分別為99.59%、100.31%、100.05%,RSD 分別為0.64%、0.82%、1.24%。

2.3 包封率、載藥量測定 精密量取1.0 mL 延胡索乙素聚乳酸納米?；鞈乙?置于超濾離心管(10 kD) 中,12 500 r/min 離心20 min,取濾液,HPLC 法測定游離延胡索乙素量(m游離)；精密量取延胡索乙素聚乳酸納米粒1.0 mL,置于25 mL量瓶中,丙酮超聲處理2 min,靜置至室溫后流動(dòng)相定容,12 500 r/min 離心10 min,HPLC 法測定延胡索乙素總量 (m總),計(jì)算載藥量、包封率,公式分別為載藥量=［(m總-m游離)/m總脂質(zhì)］ ×100%、包封率=［(m總-m游離)/m總］ ×100%,其中m總脂質(zhì)表示納米粒總質(zhì)量,平行3 份,測定兩者平均值分別為 (76.64 ± 0.23)%、(5.01 ±0.12)%。

2.4 延胡索乙素聚乳酸納米粒表征

2.4.1 Zeta 電位、粒徑 取延胡索乙素聚乳酸納米?；鞈乙?00 μL,置于2 mL 蒸餾水中,測定其Zeta 電位、粒徑,結(jié)果見圖1～2。由此可知,3 批納米粒平均Zeta 電位為(-11.1±1.5) mV,粒徑為(176.18±5.21) nm,PDI 為0.081±0.011。

圖1 延胡索乙素聚乳酸納米粒Zeta 電位Fig.1 Zeta potential of tetrahydropalmatine polylactic acid nanoparticles

圖2 延胡索乙素聚乳酸納米粒粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of tetrahydropalmatine polylactic acid nanoparticles

2.4.2 形態(tài) 取適量延胡索乙素聚乳酸納米?；鞈乙?滴加至碳膜的銅網(wǎng)上,1.0% 磷鎢酸染色,干燥后置于透射電鏡(TEM) 下觀察其形態(tài),結(jié)果見圖3。由此可知,納米粒粒徑與粒度分析儀測定結(jié)果基本一致,它基本呈球形,之間無粘連。

圖3 延胡索乙素聚乳酸納米粒TEM 圖Fig.3 TEM image for tetrahydropalmatine polylactic acid nanoparticles

2.5 凍干粉制備及表征 取3 mL 延胡索乙素聚乳酸納米粒混懸液,置于西林瓶中,加入3%甘露醇作為凍干保護(hù)劑,振蕩混勻,置于-55 ℃冷凍干燥機(jī)中預(yù)凍48 h 后抽真空,6 h 內(nèi)升溫至-20 ℃后保持12 h,3 h 內(nèi)升溫至0 ℃后保持2 h,3 h 內(nèi)升溫至25 ℃后保持12 h,即得,密封。凍干粉復(fù)溶后,測得其平均粒徑為(226.91±7.81) nm,Zeta 電位為(-7.5±1.2) mV,包封率下降至 (70.14±1.02)%,載藥量為(4.23±0.23)%。

2.6 體外釋藥研究 取適量延胡索乙素聚乳酸納米粒凍干粉末(含延胡索乙素20 mg),加入3 mL 1.0%SDS 溶液制成釋放液,置于透析袋(分子量8 000～12 000 Da) 中,尼龍繩兩端扎緊。以900 mL 1.0%SDS 溶液為釋放介質(zhì),設(shè)置溶出儀溫度為37 ℃,轉(zhuǎn)速為100 r/min,于0、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36 h 各取樣3 mL,同時(shí)補(bǔ)加3 mL 1.0%SDS 溶液,另取適量延胡索乙素混懸液(分散于1.0% SDS 溶液中) 置于透析袋中,含藥量均為20 mg,在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,結(jié)果見圖4。由此可知,原料藥釋放非常緩慢,12 h 內(nèi)累積釋放度僅為26.39%,12～36 h 內(nèi)幾乎無釋放,可能與延胡索乙素水溶性差、藥物顆粒較大有關(guān)；聚乳酸納米粒在各時(shí)間點(diǎn)的累積釋放度均高于原料藥,體外釋藥與Weibull 模型擬合度最高(r=0.988 4),見表1。

圖4 延胡索乙素體外釋藥曲線Fig.4 In vitro drug release curves for tetrahydropalmatine

表1 模型擬合結(jié)果Tab.1 Results of model fitting

2.7 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.7.1 分組、給藥與采血 12 只大鼠隨機(jī)分為2 組,每組6 只,給藥12 h 前禁食不禁水,按20 mg/kg劑量分別灌胃給予延胡索乙素0.5%CMCNa 混懸液(2.0 mg/mL)、延胡索乙素聚乳酸納米粒凍干粉溶液(2.0 mg/mL)。乙醚麻醉大鼠后,于0、0.25、0.5、1、2.0、2.5、3、4、6、8、10、12 h 眼眶采血各約0.3 mL,3 000 r/min 離心2 min,血漿樣品置于-20 ℃冰箱中保存。

2.7.2 血漿樣品預(yù)處理 吸取大鼠血漿100 μL,置于10 mL 具塞玻璃離心管中,加入1 mol/L NaOH 溶液50 μL,渦旋2 min,加入4.0 mL 乙醚繼續(xù)渦旋3 min,3 000 r/min 離心15 min,取上層有機(jī)相,氮?dú)饩徛蹈?100 μL 乙腈復(fù)溶,3 000 r/min 離 心5 min,取20 μL 上清液,在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。

2.7.3 線性關(guān)系考察 制備2 000 ng/mL 對照品溶液,乙腈依次稀釋至1 000、500、250、100、25 ng/mL,分別精密量取500 μL,35 ℃氮?dú)饩徛党袡C(jī)溶劑,加入500 μL 空白血漿,渦旋5 min,得到25、100、250、500、1 000、2 000 ng/mL血漿對照品溶液,按 “2.7.2” 項(xiàng)下方法處理后在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以延胡索乙素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸,得方程為Y=0.206 9X+0.071 3 (r=0.993 8),在25～2 000 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.4 方法學(xué)考察取 “2.7.3” 項(xiàng)下25、1 000、2 000 ng/mL 血漿對照品溶液,在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測定6 次,測得延胡索乙素峰面積RSD 分別為10.88%、7.03%、5.92%,表明儀器精密度良好。取上述3 種質(zhì)量濃度的血漿對照品溶液,在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,將測定含量與實(shí)際含量比較,測得延胡索乙素加樣回收率在86.47%～92.72%之間,RSD 分別為6.38%、7.16%、5.06%。取血漿樣品適量,于0、1、2、3、4、5 h 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,測得延胡索乙素峰面積RSD 為3.54%,表明樣品在5 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取“2.7.3” 項(xiàng)下25 ng/mL血漿對照品溶液,逐步稀釋后在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,測得定量限(S/N=10)、檢測限(S/N=3) 分別為5、2 ng/mL。

2.7.5 結(jié)果分析 圖5、表2 顯示,與原料藥比較,聚乳酸納米粒tmax、t1/2延長(P＜0.05,P＜0.01),Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P＜0.01),相對生物利用度增加至2.41 倍。

圖5 延胡索乙素血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.5 Plasma concentration-time curves for tetrahydropalmatine

表2 延胡索乙素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（， n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for tetrahydropalmatine （， n=6）

表2 延胡索乙素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（， n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for tetrahydropalmatine （， n=6）

注:與延胡索乙素比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

3 討論

在制備難溶性藥物納米給藥系統(tǒng)(如固體脂質(zhì)納米粒、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體、納米混懸劑等)時(shí),一般需借助高壓均質(zhì)機(jī)、超聲儀等設(shè)備［4-5］,而且常使用二氯甲烷等有毒試劑［14］,導(dǎo)致其推廣應(yīng)用受到限制。本實(shí)驗(yàn)采用改良的溶劑擴(kuò)散法制備延胡索乙素聚乳酸納米粒,可避免使用有毒試劑或高能設(shè)備,具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

延胡索乙素生物利用度較低,可能與其體內(nèi)不穩(wěn)定［3］、體外溶出低、水溶性差［4］等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中體外溶出結(jié)果顯示,延胡索乙素聚乳酸納米粒在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累積溶出度均高于原料藥混懸液；體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示,延胡索乙素聚乳酸納米粒tmax顯著延后,可能是由于其粒徑較小,口服后容易吸附在腸壁,甚至進(jìn)入絨毛間隙,增加滯留時(shí)間,從而延緩吸收［15-16］。同時(shí),延胡索乙素半衰期顯著延長,體內(nèi)消除速度變慢,循環(huán)時(shí)間變長,其原因一方面可能是納米粒改善了藥物可潤濕性；另一方面,泊洛沙姆188 吸附在納米粒表面,在增加潤濕性的同時(shí)也產(chǎn)生了空間位阻效應(yīng),可減少單核吞噬系統(tǒng)的吞噬,最終降低體內(nèi)消除速度。另外,該成分相對生物利用度提高至2.41 倍,可能是由于(1) 納米載體聚乳酸包裹藥物后,有助于提高藥物體內(nèi)穩(wěn)定性［15-18］；(2) 消除半衰期顯著延長,增加藥物體內(nèi)循環(huán)時(shí)間；(3) 納米級別的藥物更容易通過腸道peyer’s patch 結(jié)進(jìn)入血液循環(huán),最終提高生物利用度［19］。今后,本實(shí)驗(yàn)將著重于延胡索乙素聚乳酸納米粒藥效學(xué)方面的考察［20-22］,以期為相關(guān)研究提供更為全面的資料。