淫羊藿中抗骨關(guān)節(jié)炎成分的分子對接研究

郭小華，朱燕亮，吳龍火

（1.贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000；2.上猶縣中醫(yī)院藥劑科，江西 上猶 341200）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是世界上最常見的關(guān)節(jié)疾病，主要臨床癥狀包括慢性疼痛、關(guān)節(jié)不穩(wěn)定、僵硬、關(guān)節(jié)畸形和關(guān)節(jié)間隙狹窄等?，F(xiàn)代研究提出了幾個與OA 相關(guān)的致病因素，包括遺傳、衰老、肥胖和關(guān)節(jié)失調(diào)等，但OA 的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。OA 的發(fā)病率正在逐年上升，致殘率也在不斷攀升，且發(fā)病率與年齡有關(guān)［1-2］。OA 已經(jīng)給家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，為此國內(nèi)外學(xué)者對骨關(guān)節(jié)炎的治療進(jìn)行了大量的研究，但由于骨關(guān)節(jié)炎的靶點眾多，靶點網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，故對其治療基本停留在對癥治療，緩解疾病癥狀上，對骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制還在不斷探索當(dāng)中［3-4］。中藥因為成分復(fù)雜，作用多靶點較多，用于治療靶點復(fù)雜的骨關(guān)節(jié)炎已經(jīng)成為一種共識。

淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物，味辛甘，性溫，歸肝經(jīng)、腎經(jīng)。在我國主要分布于陜西、山西、甘肅、青海、四川、寧夏等省，有40多個品種，但中國藥典僅收錄了5 種［5-6］。作為一味傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥，淫羊藿最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有強(qiáng)筋骨，補(bǔ)腎陽及祛風(fēng)化濕的功效［7］。不同品種、不同產(chǎn)地、不同采收部位和不同采收時間的淫羊藿，其有效成分也有差異。目前研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿中共有200 余種化學(xué)成分，主要為黃酮、木質(zhì)素和生物堿等類別化合物［8］。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為，淫羊藿能夠祛風(fēng)濕除痹痛，現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究表明，淫羊藿對骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死有預(yù)防和治療作用，同時對骨關(guān)節(jié)炎有積極的治療作用［9］。淫羊藿苷是淫羊藿中研究較多的一種有效成分，被認(rèn)為能夠提高骨髓細(xì)胞活性，同時參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥抑制通路，對多種炎癥因子或炎癥靶點有抑制作用，從而保護(hù)軟骨，治療骨關(guān)節(jié)炎［10］。

淫羊藿的化學(xué)成分較多，且與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的作用靶點也較復(fù)雜，因此從分子水平上探討淫羊藿治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制難度不小。章曉云等［11］利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對淫羊藿中抗骨關(guān)節(jié)炎主要成分，以及抗骨關(guān)節(jié)炎主要成分的主要作用靶點進(jìn)行了篩選，從淫羊藿中獲得廣玉蘭內(nèi)酯等21個潛在的抗骨關(guān)節(jié)炎成分，篩選出JUN、AKT1、RELA、MAPK1、IL6、CXCL8、MAPK8、MAPK14、FOS 及IL1B等10 個潛在的核心作用靶點。這些潛在核心靶點分布于NF-κB 信號通路、白細(xì)胞介素受體信號通路、T 細(xì)胞受體信號通路及破骨細(xì)胞分化通路等不同的信號通路［12-13］。由此可見，淫羊藿抗骨關(guān)節(jié)炎作用呈現(xiàn)出多成分、多途徑、多靶點等作用特點。

然而，通過網(wǎng)絡(luò)藥理篩選出的抗骨關(guān)節(jié)炎活性成分對各潛在核心靶點是否有選擇性，活性成分與核心靶點的相互作用方式及作用強(qiáng)弱如何尚不清楚。為此，本文旨在通過分子對接的方法，模擬網(wǎng)絡(luò)藥理篩選出的淫羊藿中21 個潛在的抗骨關(guān)節(jié)炎活性成分與6 個潛在的抗骨關(guān)節(jié)炎潛在核心靶點（選取各信號通路的代表靶點）的相互作用，從分子水平上探討活性成分抗骨關(guān)節(jié)炎虛擬活性的強(qiáng)弱，及其對各靶點的選擇性和可能的作用機(jī)制，為今后對這類化合物的結(jié)構(gòu)修飾和進(jìn)一步的藥理實驗提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料實驗所需硬件是一臺電子計算機(jī)，所需軟件、在線程序及其用途見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 分子對接計算前處理

1.2.1.1 配體化合物的選取及對接前處理本研究選取淫羊藿中廣玉蘭內(nèi)酯等21 個潛在的抗骨關(guān)節(jié)炎成分（化合物1～21，圖1）作為分子對接的配體分子，以6 個潛在的抗骨關(guān)節(jié)炎核心靶點中的原始配體為陽性對照，比較21 個配體化合物、各原始配體與相應(yīng)靶蛋白的對接數(shù)據(jù)。

表1 對接實驗使用的軟件、在線程序及用途

圖1 淫羊藿中潛在的21個抗骨關(guān)節(jié)炎成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)

將21 個活性成分的平面結(jié)構(gòu)在線轉(zhuǎn)化成三維結(jié)構(gòu)，并在Chimera 程序中將其置于對接靶蛋白的活性位點處，保存為pdb 格式文件。再將此pdb 格式文件的配體分子置于AutoDockTools（ADT）軟件中加上電荷和非極性氫，保存為pdbqt格式文件。

1.2.1.2 受體分子的選取及對接前處理從Brookheaven 蛋白數(shù)據(jù)庫中獲取6 個核心靶點蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，在Chimera 程序中將蛋白晶體結(jié)構(gòu)中的水分子、原始配體等剔除，保存為pdb 格式文件。再將此pdb格式文件的受體分子置于ADT軟件中加上電荷和非極性氫，保存為pdbqt格式文件。

1.2.2 分子對接實驗運(yùn)算在ADT 軟件中，設(shè)置pdbqt格式文件的配體分子和受體分子的網(wǎng)格，并運(yùn)行AutoGrid 生成必要的圖像文件，最后運(yùn)行AutoDock進(jìn)行分子對接計算實驗運(yùn)算。

以估計抑制常數(shù)（inhibit constant，Ki）和結(jié)合自由能（binding energy，△Gbind）為參考指標(biāo)，以各靶點的原始配體為陽性對照，獲取各活性成分與各靶蛋白對接的Ki 值和△G 值，并從最佳構(gòu)象上分析各對接化合物與靶蛋白的結(jié)合模式，從分子水平探討它們的結(jié)合模式和相互作用。

2 結(jié) 果

2.1 分子對接結(jié)果淫羊藿中21個抗骨關(guān)節(jié)炎成分與潛在的6個抗骨關(guān)節(jié)炎靶點對接的Ki值和△Gbind值見表2。

通過分子對接運(yùn)算，從21個對接化合物與相應(yīng)靶蛋白的分子對接數(shù)據(jù)上看，大部分對接化合物與RELA 蛋白對接的Ki 值都達(dá)到了納摩爾水平，其中化合物4 對接的Ki 值最小，為6.84 nmol·L-1；化合物4、化合物6 及化合物13 對接的Ki 值整體上要小于其他化合物，其中化合物4 與FOS 蛋白和RELA 蛋白的Ki值分別為13.23 nmol·L-1和6.84 nmol·L-1，明顯小于各自原始配體對接的Ki值。

表2 配體化合物與各靶點的對接數(shù)據(jù)

3 討 論

3.1 分子對接數(shù)據(jù)分析從21 個對接化合物與6個靶蛋白的對接數(shù)據(jù)上看，化合物與RELA 蛋白對接的Ki值基本達(dá)到納摩爾級水平，要小于與其他幾個靶蛋白的對接數(shù)據(jù)，對接數(shù)據(jù)最優(yōu)的是化合物4，Ki 值為6.84 nmol·L-1，我們推測淫羊藿中抗骨關(guān)節(jié)炎成分發(fā)揮抗炎作用主要是與RELA 蛋白結(jié)合，對RELA蛋白的選擇性高于其他幾個蛋白。

比較21個對接化合物的對接數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，化合物4、化合物6 及化合物13 的對接數(shù)據(jù)整體上優(yōu)于其他化合物，和各靶蛋白對接的Ki值基本小于其他化合物，其中化合物4 與FOS 蛋白和RELA 蛋白的Ki值分別為13.23 nmol·L-1和6.84 nmol·L-1，也明顯小于各自原始配體對接的Ki 值。表現(xiàn)出與潛在核心蛋白很強(qiáng)的結(jié)合能力，虛擬抑制活性較強(qiáng)。由此我們推斷，淫羊藿中發(fā)揮抗骨關(guān)節(jié)炎作用的主要成分可能為化合物4、化合物6及化合物13。

對接數(shù)據(jù)最不理想的是化合物11，從構(gòu)象上看應(yīng)該是長直鏈化合物11 空間上不匹配各靶蛋白的活性位點，與靶蛋白結(jié)合不牢固，結(jié)合構(gòu)象不穩(wěn)定。

綜上所述，我們初步推測淫羊藿中21個潛在抗骨關(guān)節(jié)炎成分發(fā)揮抗炎作用的主要為化合物4、化合物6 及化合物13；各化合物與RELA 蛋白的對接數(shù)據(jù)最優(yōu)，表現(xiàn)出對該核心靶點較高的選擇性，可能是淫羊藿抗炎作用的最重要的靶點。

為更直觀體現(xiàn)化合物與靶蛋白的結(jié)合作用，我們選取RELA 蛋白為代表靶點，從分子對接構(gòu)象上探討分析對接數(shù)據(jù)較好的化合物4和對接數(shù)據(jù)較差的化合物11與RELA蛋白的結(jié)合方式和相互作用。

3.2 分子對接構(gòu)象分析

3.2.1 化合物4 與RELA 蛋白對接構(gòu)象分析RELA 蛋白是NF-κB 信號通路中的一個關(guān)鍵蛋白，對骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用，晶體結(jié)構(gòu)衍射實驗顯示，RELA 蛋白的活性位點主要由三個活性口袋，分別是A口袋、B口袋和C口袋（圖2）。A口袋由VAL300、HIS252、LEU153、PHE299等氨基酸構(gòu)成，而LEU253、GLU154、GLY298等氨基酸則構(gòu)成了B 口袋，C 口袋則由ILE249、ASN251 及ALA73 等氨基酸構(gòu)成。

圖2 化合物4與RELA蛋白對接最佳構(gòu)象圖

分子對接實驗時，化合物4能夠完全占據(jù)RELA蛋白中的三個活性口袋（圖2），化合物4中的黃酮母核結(jié)構(gòu)占據(jù)了A 口袋，母核上的兩個羥基分別與VAL300和HIS252兩個氨基酸形成了兩個氫鍵相互作用力；化合物4 中氧萘母核落在由LEU253、GLU154、GLY298 等氨基酸構(gòu)成的B 口袋；而氧萘母核上的支鏈取代則伸入到RELA 蛋白的C 口袋?；衔? 中的三部分結(jié)構(gòu)剛好完美地嵌入在RELA 蛋白中的三個不同活性口袋，并通過與周圍氨基酸形成一定相互作用力牢固結(jié)合在一起，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的虛擬活性。

3.2.2 化合物11與RELA 蛋白對接構(gòu)象分析化合物11 是一個鏈狀化合物，從對接數(shù)據(jù)上看，化合物11 與各核心靶點的對接數(shù)據(jù)是最差的。從對接的最佳構(gòu)象圖可以看出（圖3），化合物11 主要占據(jù)RELA 蛋白的B 口袋和C 口袋，其中酯基端伸入B 口袋，烷基端嵌入C 口袋，但未能占據(jù)RELA 蛋白的A口袋。

圖3 化合物11與RELA蛋白對接最佳構(gòu)象圖

通過比較化合物4和化合物11與RELA 蛋白的對接數(shù)據(jù)和對接構(gòu)象（化合物4 和化合物11 的疊加構(gòu)象見圖4），我們可初步推斷，RELA 蛋白中的A 活性口袋在整個活性位點中扮演著重要的角色，淫羊藿中抗骨關(guān)節(jié)炎活性成分要發(fā)揮抗炎作用，首先要占據(jù)RELA蛋白的A活性口袋。

圖4 化合物4和化合物11與RELA蛋白對接的疊加構(gòu)象圖

本研究利用分子對接的方法模擬了淫羊藿中21個抗骨關(guān)節(jié)炎活性化合物與6個潛在抗骨關(guān)節(jié)炎核心靶點的結(jié)合模式和相互作用。結(jié)果顯示，21 個活性成分中大部分與各蛋白的對接數(shù)據(jù)較好，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的虛擬抗骨關(guān)節(jié)炎活性。對接數(shù)據(jù)表明，淫羊藿中抗骨關(guān)節(jié)炎活性成分對潛在核心靶點有一定的選擇性，主要是通過抑制RELA 蛋白發(fā)揮抗炎作用。化合物4、化合物6 和化合物13 等幾個結(jié)構(gòu)類似的活性成分與RELA 蛋白對接的數(shù)據(jù)要優(yōu)于其他化合物，估計抑制常數(shù)均達(dá)到納摩爾級水平?；衔?1是所有活性成分中對接數(shù)據(jù)最差的。

對接構(gòu)象上，本研究以RELA 蛋白為代表靶點，分析了虛擬活性差距較大的化合物4 和化合物11與靶蛋白的相關(guān)作用和結(jié)合模式。對接構(gòu)象顯示，化合物4 能夠完全占據(jù)RELA 蛋白中的A、B、C 三個活性口袋，其中黃酮母核結(jié)構(gòu)占據(jù)了A口袋，母核上的兩個羥基分別與VAL300和HIS252兩個氨基酸形成氫鍵相互作用力，而化合物4 中氧萘母核落在RELA 蛋白活性位點的B 口袋，氧萘母核的支鏈取代基則伸入到由ILE249、ASN251 及ALA73 等氨基酸構(gòu)成的C 口袋。化合物4 中的三部分結(jié)構(gòu)剛好完美地嵌入在RELA 蛋白中的三個不同活性口袋，是其呈現(xiàn)出較強(qiáng)的抗骨關(guān)節(jié)炎虛擬活性的基礎(chǔ)。

從化合物4 和化合物11 的疊加構(gòu)象圖看，化合物11 只伸入了RELA 蛋白中的B、C 兩個活性口袋，未能像化合物4 一樣占據(jù)A 活性口袋，導(dǎo)致其對接數(shù)據(jù)與化合物4 等虛擬活性較好的成分相差較大，我們初步推斷RELA 蛋白中的A 活性口袋在整個活性位點中扮演著重要的角色。

綜上，我們預(yù)測淫羊藿中抗骨關(guān)節(jié)炎成分發(fā)揮抗炎作用對潛在核心靶點有一定的選擇性，主要作用于RELA 蛋白；化合物4、化合物6 及化合物13 等結(jié)構(gòu)類似的化合物能夠完全占據(jù)RELA 蛋白的三個活性口袋，與蛋白結(jié)合牢固，相互作用較強(qiáng)，表現(xiàn)出對該蛋白較強(qiáng)的虛擬活性，可能是淫羊藿中最活性最高的抗骨關(guān)節(jié)炎成分。