離子液體[C14mim]BF4對大鼠的肝臟毒性

苑華飛，田杏杏，許峰，葛月月，魏海燕，張蕤，曹江宇，徐紅梅

合肥工業(yè)大學，食品與生物工程學院，藥物科學與工程系，合肥 230009

離子液體(ionic liquids, ILs)是一種熔點低于100 ℃，在室溫或接近室溫下呈現(xiàn)液態(tài)，完全由陰離子、陽離子組成的有機鹽[1-2]。相比于傳統(tǒng)有機溶劑，ILs因具有溶解力強、熱穩(wěn)定性較高和不易揮發(fā)等優(yōu)點，被廣泛應用于化學合成[3]、萃取分離[4]和生物材料制備[5]等多個領域，曾一度被認為是揮發(fā)性有機溶劑的綠色替代品。然而，越來越多的研究表明，ILs并非完全綠色，由于其性質(zhì)穩(wěn)定，難以生物轉(zhuǎn)化和降解，故易在環(huán)境或生物體內(nèi)累積而產(chǎn)生危害[6-8]。因此，研究ILs對生物體的毒性及作用機制，評價其對生態(tài)環(huán)境的影響，對ILs的設計、合成、安全使用、減少環(huán)境污染以及維護生態(tài)平衡等，都具有深遠的社會意義和重要的經(jīng)濟價值。

咪唑型ILs是近年來合成與研究最為廣泛的ILs，對多種生物都有一定的毒性[9-13]，國內(nèi)外學者對其毒性機制也進行了有益的探索。Liu等[14]發(fā)現(xiàn)四氟硼酸化-1-丁基-3-甲基咪唑鹽([Bmim]BF4)可使蠶豆幼苗體內(nèi)抗氧化酶的活性發(fā)生顯著變化，從而引發(fā)機體的氧化損傷。Zhang等[15]報道在急性暴露下，[Bmim]BF4會誘導斑馬魚體內(nèi)細胞膜通透性增加，從而引起細胞內(nèi)代謝紊亂與活性氧(reactive oxygen species, ROS)過量積累，繼而引發(fā)脂質(zhì)過氧化，導致肝臟損傷。本課題組在前期已對咪唑型ILs的毒性開展了相關研究，發(fā)現(xiàn)咪唑型ILs對小鼠的急性毒性隨著烷基側(cè)鏈長度的增加而增強，當烷基側(cè)鏈長度為14時，毒性最強[16]；進一步的研究顯示[C14mim]BF4染毒可導致小鼠肝臟病變與損傷[17-18]。

盡管目前對ILs的毒性研究資料頗多，但多為考察ILs急性或亞急性染毒對生物體的影響，而有關ILs低劑量、長期染毒后，對生物體尤其是哺乳動物所產(chǎn)生的毒性及其作用機制的研究卻十分匱乏[19]。因此，本實驗在前期工作的基礎上，選取[C14mim]BF4為研究對象，通過考察染毒大鼠體質(zhì)量、臟體系數(shù)、組織形態(tài)學、肝功能指標和抗氧化酶活性等方面的變化，初步探討了[C14mim]BF4對大鼠亞慢性染毒的肝毒性及其作用機理，以期為更加全面地評價ILs的毒性作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 離子液體

咪唑型ILs [C14mim]BF4由中國科學院蘭州化學物理研究所合成，純度≥99%，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 [C14mim]BF4的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structure of [C14mim]BF4

1.2 實驗動物

健康SD大鼠40只(6周齡)，雌、雄各半，體質(zhì)量約為90～120 g，由安徽醫(yī)科大學動物養(yǎng)殖中心提供，生產(chǎn)許可證為SCXK(皖)2019-001。大鼠飼養(yǎng)于標準動物房內(nèi)(溫度20～22 ℃、濕度65%～75%)，自然光照，動物自由飲水、飲食。

1.3 主要試劑和儀器

生理鹽水(0.9%氯化鈉注射液)購自中國安徽豐原藥業(yè)有限公司；甲醛為分析純，購自中國上海振企化學試劑有限公司；無水乙醇為分析純，購自中國上海中試化工總公司；活性氧(ROS)試劑盒購自中國碧云天生物技術有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自中國南京建成生物工程研究所有限公司。

電子天平(中國上海精密科學儀器有限公司，JA2004N)；高速離心機(德國Thermo公司，CT14RD)；冷凍切片機(德國Leica公司，RM2245)；顯微鏡(日本Olympus日本，X71)；紫外可見分光光度計(中國上海精密科學儀器有限公司，U1757CRT)；酶標儀(美國Bio-Rad公司，680型)；全自動生化分析儀(中國普朗醫(yī)療器械公司，PUZS-300)。

1.4 [C14mim]BF4溶液的配制

實驗前，分別精密稱取500、250和125 mg的[C14mim]BF4，各自溶于100 mL蒸餾水中，依次得到濃度為5、2.5和1.25 mg·mL-1的[C14mim]BF4溶液。

1.5 動物染毒及指標檢測1.5.1 [C14mim]BF4對大鼠的亞慢性染毒

40只SD大鼠(雌雄各半)適應性飼養(yǎng)一周后，隨機均分成5組。根據(jù)前期測得的半數(shù)致死量(LD50)值(249.8 mg·kg-1)，設置3個染毒組(12.5、25和50 mg·kg-1)、1個染毒恢復組(50 mg·kg-1)和空白對照組。染毒組大鼠經(jīng)口給予[C14mim]BF4染毒(1 mL藥液/100 g體質(zhì)量)，每天1次，連續(xù)90 d，空白組的大鼠灌胃等容積的蒸餾水。染毒后逐日觀察，記錄各組大鼠的中毒反應，包括外觀特征、活動狀態(tài)和死亡數(shù)等，每周稱量并記錄大鼠體質(zhì)量變化。染毒恢復組是指大鼠在停止染毒后，繼續(xù)觀察1個月，相關指標檢測同染毒組。

1.5.2 臟器指數(shù)

末次染毒后，大鼠麻醉處死，立即解剖并分離其肝、腎、脾、肺和心臟，用預冷的生理鹽水清洗血污，濾紙吸干水分，稱量。根據(jù)測得的各器官質(zhì)量，計算臟器指數(shù)。

1.5.3 組織病理學檢查

將分離得到的各組大鼠的肝臟組織用10%甲醛溶液固定，采用不同濃度梯度的乙醇逐級脫水，石蠟包埋，切片機切片，脫蠟，HE染色，在顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織病理學變化。

1.5.4 肝功能指標的測定

末次染毒后，將大鼠麻醉，腹主動脈取血，靜置30 min，3 500 r·min-1離心10 min，取血清；解剖后取新鮮肝臟，準確稱取組織質(zhì)量，按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下，制備成10%的肝組織勻漿，2 500 r·min-1離心10 min，取上清，再用生理鹽水稀釋成最佳取樣濃度。按照試劑盒說明書方法，分別檢測血清和肝臟中ALT、AST和ALP的活性。

1.5.5 肝臟中CAT和SOD的測定

取大鼠新鮮肝組織，按照1.5.4的方法處理，使用試劑盒檢測肝臟組織中CAT和SOD的活性。

1.5.6 肝臟ROS的測定

取大鼠新鮮肝臟組織，按照試劑盒說明書方法操作，研磨制備細胞懸液，200目尼龍網(wǎng)過濾，1 500 r·min-1離心10 min，加入磷酸緩沖液(PBS)重懸沉淀，細胞計數(shù)后加入DCFH-DA探針，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，在熒光顯微鏡下觀察激發(fā)波長為495 nm的熒光；同時，在激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為540 nm的條件下，使用熒光酶標儀檢測熒光強度。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 大鼠中毒體征觀察

在染毒過程中，隨著染毒時間的延長，大鼠毒性反應增強，表現(xiàn)為毛發(fā)枯澀、凌亂豎立，身體顫抖，興奮等中毒癥狀。50 mg·kg-1組大鼠除具有上述癥狀外，還出現(xiàn)活動減少、精神萎靡不振、呼吸喘促和行走不穩(wěn)等中毒癥狀。

2.2 [C14mim]BF4對大鼠體質(zhì)量的影響

由圖2可知大鼠體質(zhì)量的變化趨勢：與對照組相比，染毒早期(3～6周)大鼠體質(zhì)量的增長量隨著劑量的升高而降低(P<0.05)；中期(6～9周)其體質(zhì)量的增長量隨著染毒劑量的增加而增大(P<0.05)；而在染毒的后期(9～12周)，大鼠體質(zhì)量的增長量與正常組大鼠基本一致。

圖2 [C14mim]BF4亞慢性染毒對大鼠體質(zhì)量的影響Fig. 2 Effect of [C14mim]BF4 subchronic exposure on body weight of rats

2.3 [C14mim]BF4對大鼠臟器指數(shù)的影響

由表1所示，與對照組相比，[C14mim]BF4染毒對大鼠的心、腎和脾的臟器指數(shù)幾乎無影響，但使其肝、肺的臟器指數(shù)略有升高；與50 mg·kg-1組相比，恢復組大鼠肝、肺的臟器指數(shù)略有下降；各組臟器指數(shù)間無統(tǒng)計學差異。

2.4 組織病理學檢查

HE染色顯示，對照組大鼠的肝細胞形態(tài)正常，肝細胞索排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰(圖3(a))。 [C14mim]BF4染毒后，隨著劑量的增加，大鼠肝臟依次出現(xiàn)少量炎細胞浸潤(圖3(b))、肝細胞點狀壞死及少量片狀壞死(圖3(c))、大量炎細胞浸潤、脂肪空泡、橋接狀壞死等病變(圖3(d))。停止染毒一個月后，大鼠肝組織病變有所減輕，可見少量炎細胞浸潤和雙核細胞(圖3(e))。上述結(jié)果表明，隨著染毒劑量的增加，大鼠肝臟受損程度增強；停止染毒后，大鼠肝組織損傷程度有所減輕。

2.5 [C14mim]BF4對大鼠血清和肝臟中ALT、AST和ALP的影響

由圖4可知，與對照組相比，各染毒組大鼠血清和肝臟中ALT、AST和ALP活性顯著升高(P<0.05)，且呈劑量依賴趨勢；而恢復組大鼠在停止染毒一個月后，其血清和肝臟中ALT、AST和ALP活性均比50 mg·kg-1組明顯降低(P<0.05)。上述結(jié)果顯示，[C14mim]BF4對大鼠肝功能的損傷呈劑量相關性，染毒停止后，大鼠肝功能損傷有一定程度的恢復。

2.6 [C14mim]BF4對大鼠肝臟ROS的影響

如圖5所示，[C14mim]BF4染毒組大鼠肝臟ROS熒光強度顯著高于對照組(P<0.05)，且呈劑量依賴性；而與50 mg·kg-1組相比，恢復組大鼠肝臟ROS熒光強度顯著降低(P<0.05)。

2.7 [C14mim]BF4對大鼠肝臟中CAT和SOD的影響

如圖6所示，[C14mim]BF4亞慢性染毒后，各組大鼠肝臟中抗氧化酶CAT和SOD的活性隨著劑量的增加顯著降低(P<0.05)；而與50 mg·kg-1組相比，恢復組大鼠肝臟中CAT和SOD的活性則顯著上升(P<0.05)。這表明[C14mim]BF4染毒可抑制大鼠肝臟抗氧化酶的活性，停止染毒30 d后，大鼠肝臟的抗氧化酶活性有所恢復。

表1 [C14mim]BF4亞慢性染毒對大鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effect of [C14mim]BF4 subchronic exposure on the ratio of viscera in rats n=8)

圖3 大鼠肝組織病理切片(×100)注：(a) 對照組；(b)～(d) 分別為12.5 mg·kg-1、25 mg·kg-1和50 mg·kg-1組肝組織切片；(e) 恢復組。Fig. 3 Histology of livers from [C14mim]BF4-treated rats (×100)Note: (a) Control group; (b)～(d) Liver of rat treated with [C14mim]BF4 at dose of 12.5 mg·kg-1, 25 mg·kg-1 and 50 mg·kg-1, respectively; (e) Recovery group.

圖4 [C14mim]BF4對大鼠血清和肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)活性的影響注：(a)～(c)分別為血清中ALT、AST和ALP活性；(d)～(e)分別為肝臟中ALT、AST和ALP活性。Fig. 4 Effects of [C14mim]BF4 on the activities of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and alkaline phosphatase (ALP) in rat serum and liverNote: (a)～(c) The activities of ALT, AST and ALP in serum; (d)～(e) The activities of ALT, AST and ALP in liver.

圖5 大鼠肝臟中活性氧(ROS)熒光圖像和相對熒光強度(×100)注：(a) 對照組；(b)～(d) 分別為12.5 mg·kg-1、25 mg·kg-1和50 mg·kg-1組熒光圖片；(e) 恢復組；(f) 相對熒光強度。Fig. 5 Fluorescence image and relative fluorescence intensity of reactive oxygen species (ROS) in rat liver (×100)Note: (a) Control group; (b)～(d) Liver of rat treated with [C14mim]BF4 at dose of 12.5 mg·kg-1, 25 mg·kg-1 and 50 mg·kg-1, respectively; (e) Recovery group; (f) Fluorescence intensity relative to Control.

圖6 [C14mim]BF4對大鼠肝組織中(a)過氧化氫酶(CAT)和(b)超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響Fig. 6 Effects of [C14mim]BF4 on the activities of (a) catalase (CAT) and (b) superoxide dismutase (SOD) in rat liver

3 討論(Discussion)

咪唑型ILs因性質(zhì)穩(wěn)定易在環(huán)境中蓄積而產(chǎn)生危害[20]，本課題組在前期開展了[C14mim]BF4對大鼠的急性毒性研究，發(fā)現(xiàn)其對大鼠的肝臟損傷最為嚴重。由于目前的研究多集中在對ILs的急性毒性研究，而有關ILs對哺乳動物的長期毒性及其作用機制仍知之甚少。因此，我們選取大鼠為實驗對象，來探究[C14mim]BF4對哺乳動物的亞慢性毒性作用。

肝臟是機體解毒的主要器官，當受到外來有毒物質(zhì)的侵襲時，肝臟可將有毒物質(zhì)通過一系列代謝酶的作用轉(zhuǎn)化為無毒或低毒物排出體外[21]。轉(zhuǎn)氨酶在生物體的代謝過程中發(fā)揮著重要作用，并參與對環(huán)境應激的先天性免疫防御[22]。當肝細胞受損時，細胞膜通透性增加，ALT從細胞漿中流出；而當肝細胞受損嚴重或壞死時，線粒體中的AST也釋放出來。因此，血清和肝臟中ALT、AST活性的變化能敏感地反映肝細胞的損傷程度。ALP主要來自于肝臟、骨骼和腸道，當膽道梗阻嚴重時，ALP活性顯著升高[23]。相關研究表明，具有較長烷基鏈的ILs更易進入細胞，進而破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)[24-25]。已有研究表明ILs中毒可導致大鼠急性肝損傷，其特征是肝臟轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)升高和組織病理學改變[26]。本實驗中，大鼠經(jīng)口染毒[C14mim]BF490 d后，其血清和肝臟中ALT、AST和ALP活性均顯著升高，表明[C14mim]BF4可能通過破壞肝細胞膜結(jié)構(gòu)，使肝臟中代謝酶含量升高，產(chǎn)生毒性反應。組織病理學結(jié)果也顯示，[C14mim]BF4染毒后，大鼠肝細胞膜結(jié)構(gòu)受損，導致肝臟水腫，肝體指數(shù)增大，并伴有炎性細胞浸潤。在恢復組中，肝功能標志物ALT、AST和ALP活性明顯降低，肝臟損傷癥狀得到緩解，表明[C14mim]BF4誘導的肝損傷在停止暴露后，有一定程度的改善。

綜上所述，離子液體[C14mim]BF4亞慢性染毒，可引起大鼠肝臟功能受損，其肝毒性可能與[C14mim]BF4誘發(fā)氧化應激，破壞肝臟抗氧化酶的活性有關。