綜合根系活性及葉片光合速率揭示碳納米材料對(duì)濕地中水生植物的影響

楊祥宇，鄧亞宏，石益廣，袁小兵，孫志國(guó)，何強(qiáng)，陳一,*

1. 重慶大學(xué)三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶大學(xué)，重慶 400045 2. 國(guó)家低碳和綠色建筑國(guó)際研究中心，重慶大學(xué)，重慶 400045 3. 重慶大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，重慶 400045 4. 中建三局第二建設(shè)工程有限責(zé)任公司，武漢 430000

碳納米材料(carbon nanomaterials, CNMs)因其獨(dú)特的力學(xué)性能、熱持久性和化學(xué)穩(wěn)定性而被廣泛應(yīng)用于眾多領(lǐng)域，如柔性導(dǎo)電復(fù)合材料[1]、合金[2]和混凝土[3]等。隨著含有CNMs的商品材料大量合成、使用和處理，CNMs不可避免地被釋放到環(huán)境中，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成威脅。污水處理系統(tǒng)作為CNMs進(jìn)入環(huán)境的必經(jīng)途徑，其受影響情況尚未明確。

人工濕地作為生態(tài)友好型污水處理系統(tǒng)，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、低能耗、維護(hù)方便等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)越來(lái)越得到水處理行業(yè)的認(rèn)可和推廣[4]。由于生物膜特殊的截留能力及納米顆粒超大的比表面積，雖然人工濕地對(duì)常規(guī)氮磷污染物有良好的去除效果，但也被認(rèn)為是納米級(jí)顆粒污染物的重要聚集區(qū)[5-6]。濕地植物作為人工濕地重要的組成部分，它們能直接或間接地去除濕地水體中污染物[7]，例如吸收同化氮、磷養(yǎng)分，富集重金屬，還可有效去除廢水中的有機(jī)污染物[8]。此外，濕地植物還可以調(diào)節(jié)pH值，釋放有機(jī)分泌物、氧氣，以增強(qiáng)根際微生物對(duì)污染物的降解和轉(zhuǎn)化[9]。植物的景觀功能也展現(xiàn)了濕地系統(tǒng)的美學(xué)價(jià)值。然而，CNMs對(duì)濕地植物的生物毒性以及因此對(duì)濕地除污效能的影響目前還沒(méi)有被充分闡明。

在響應(yīng)國(guó)家“節(jié)能減排”、“創(chuàng)建生態(tài)友好型宜居環(huán)境”政策的大背景下，人工濕地的推廣應(yīng)用已成為趨勢(shì)。為使人工濕地系統(tǒng)更好地服務(wù)城鎮(zhèn)廢水處理，在居民環(huán)境中營(yíng)造更好地景觀氛圍。了解CNMs對(duì)水生植物的毒性影響十分必要。盡管之前已有關(guān)于CNMs對(duì)植物的生理毒性報(bào)道，但大多數(shù)CNMs的毒理學(xué)研究都在土壤或水培等單一處理基礎(chǔ)上，采用較高劑量對(duì)農(nóng)作物或敏感植物進(jìn)行研究，不適宜說(shuō)明CNMs在濕地廢水處理這樣的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)中對(duì)大型水生植物的影響過(guò)程。因此本研究重點(diǎn)考察了3種常見(jiàn)CNMs包括單壁碳納米管(SWCNTs)、多壁碳納米管(MWCNTs)和納米富勒烯(nC60)在人工濕地中對(duì)植物生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料(Experimental materials)

3種碳納米材料(CNMs)購(gòu)自江蘇納米先豐(XFNANO)材料科技有限公司。實(shí)驗(yàn)中，SWCNTs和MWCNTs被放置在12 mol·L-1鹽酸溶液浸泡11 h去除殘留金屬催化劑，之后用去離子水清洗直到中性[10]。nC60分散到甲苯中，150 r·min-1振蕩2 h，然后加入4倍體積的去離子水繼續(xù)振蕩，直到甲苯揮發(fā)完全[11]。隨后通過(guò)0.22 μm濾膜(ANPEL，上海，中國(guó))。所有洗過(guò)的CNMs在60 ℃的烘箱中干燥過(guò)夜以得到粉末。

圖1 人工配水中不同碳納米材料(CNMs)的透射電鏡(TEM)圖像和X射線能譜(EDS) 分析結(jié)果(紅色矩形區(qū)域內(nèi)材料的元素分布)注：SWCNTs為單壁碳納米管，MWCNTs為多壁碳納米管，nC60為富勒烯納米材料。Fig. 1 Transmission electron microscopy (TEM) images of different carbon nanomaterials (CNMs) in artificial wastewater and energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) analysis results (the area indicated by the red rectangle in TEM images)Note: SWCNTs mean single-wall carbon nanotubes; MWCNTs mean multi-wall carbon nanotubes; nC60 means fullerene.

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Design of experiment)

本研究建立了21個(gè)序批次潛流人工濕地(SSF CWs)，水力停留時(shí)間(HRT)為5 d，每個(gè)濕地的體積為0.045 m3(長(zhǎng)0.3 m、寬0.3 m、高0.5 m)。濕地內(nèi)部用礫石(直徑5～8 mm，孔隙度0.4)填充40 cm高，種植香蒲(約20 cm高，種植深度約15 cm，密度約為267 株·m-2)，孔隙體積為12 L。21個(gè)反應(yīng)器共設(shè)置4個(gè)體系，其中3個(gè)濕地為空白組，SWCNTs組、MWCNTs組和nC60組各6個(gè)濕地(3個(gè)10 μg·L-1濃度處理組，3個(gè)1 000 μg·L-1濃度處理組)。所有濕地均置于(25±1) ℃的空調(diào)玻璃溫室內(nèi)。溫室晝夜時(shí)間及溫度為18 h/6 h、28 ℃/22 ℃。溫室相對(duì)光照度和濕度分別為160 μmol·m-2·s-1和60%。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，濕地通入人工配水進(jìn)行4個(gè)月的掛膜啟動(dòng)過(guò)程，以建立穩(wěn)定的生物膜和植物根系。人工配水從濕地頂部的入口倒入，從底部靠重力排出，停留時(shí)間為5 d。正式實(shí)驗(yàn)分為短期急性暴露(5 d)和長(zhǎng)期慢性累積(180 d)2個(gè)階段。

1.3 取樣(Sampling)

植物樣品：植物根系樣品在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第一批次(5 d)及最后一個(gè)批次(180 d)結(jié)束后進(jìn)行取樣，最大程度取同深度、同粗細(xì)的根系5 g，取出后進(jìn)行酶活性、根系活力及其他項(xiàng)目的檢測(cè)。

1.4 根系抗氧化酶活性和丙二醛分析(Analysis of antioxidant enzyme activity and malondialdehyde in root system)

取1 g鮮根置于預(yù)冷研缽，加少量二氧化硅顆粒后冰浴研磨至砂漿狀。加入于5 mL 50 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH=7.0，1 mmol·L-1EDTA和2% PVP)混勻。隨后，將勻漿置于10 mL離心管中，4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min，分離上清液進(jìn)行抗氧化酶活性分析[5]。

通過(guò)測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)抑制硝基藍(lán)四唑(NBT)還原能力，確定SOD活性；根據(jù)過(guò)氧化氫分解速率確定過(guò)氧化氫酶(CAT)活性；通過(guò)測(cè)定愈創(chuàng)木酚的氧化速率，確定過(guò)氧化物酶(POD)的活性；通過(guò)測(cè)定硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)(TBARS)的濃度，確定丙二醛(MDA)濃度。所有物質(zhì)濃度均采用分光光度計(jì)(DR6000，HACH，日本)進(jìn)行確定。

1.5 光合作用、根系活力、生物量和元素分析(Photosynthesis, root activity, biomass and elemental analysis)

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后5 d和180 d，中午10:00—11:00期間，在每個(gè)反應(yīng)器中最大程度選取同高度、同大小、同狀態(tài)的3片葉子利用光合作用儀(LI-COR 6400 XT, Licor, USA)測(cè)定凈光合速率，測(cè)定過(guò)程中保證CO2濃度400 μmol·mol-1和光照度450 μmol·m-2·s-1。根活力測(cè)定采用氯化三苯基四氮唑(TTC)還原法確定，具體實(shí)驗(yàn)步驟參考《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[12]。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS) (iCAP-6300-Duo, Thermo Fisher Scientific, USA)確定植物體內(nèi)磷的含量，180 d后獲濕地植物，清洗根部并分離根葉，直接稱量確定濕質(zhì)量，烘干(75 ℃，3 d)后確定干質(zhì)量，烘干后的根葉分別研磨過(guò)篩(60目)后進(jìn)行消解，消解方法參考文獻(xiàn)[13]。采用元素分析儀(Vario EL Cube, Elementar, Germany)對(duì)植物中C、N含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理(Statistical analysis)

所有處理組均設(shè)置3個(gè)平行，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。采用方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)結(jié)果的顯著性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(SPSS 22.0, IBM).

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 根系活力的改變(Changes of root activity)

根系活力可以直接反映植物根系生長(zhǎng)狀態(tài)。如圖2所示，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始5 d后，各組植物根系活力沒(méi)有顯著差別；而180 d后，10 μg·L-1和1 000 μg·L-1的CNMs對(duì)根系活力產(chǎn)生了顯著影響，分別降低了14.6%和36.8%(P<0.05，SWCNTs組)、7.1%和42.4%(P<0.05，MWCNTs組)、9.9%和11.5%(P<0.05，nC60組)。本研究揭示了CNMs對(duì)水生植物根系活力的抑制作用，其影響植物根系生長(zhǎng)已有文獻(xiàn)報(bào)道。袁剛強(qiáng)等[14]發(fā)現(xiàn)SWCNTs暴露可以顯著降低水稻根長(zhǎng)耐性指數(shù)，導(dǎo)致根部生長(zhǎng)緩慢。相反，Caas等[15]發(fā)現(xiàn)SWCNTs在水培條件下可以促進(jìn)洋蔥和黃瓜的根伸長(zhǎng)；羅春燕等[16]發(fā)現(xiàn)nC60存在可以緩解菲對(duì)水稻根系生長(zhǎng)的抑制作用，對(duì)植物的根系也有促進(jìn)作用。關(guān)于MWCNTs對(duì)植物根系活力的影響，郭敏等[17]發(fā)現(xiàn)水稻幼苗根系活力隨MWCNTs濃度升高而顯著降低，該結(jié)論與本研究相同。根系活力之所以受到抑制，離不開(kāi)根系細(xì)胞活性的改變。為了說(shuō)明植物細(xì)胞活性的改變，本研究對(duì)根系酶活性進(jìn)行了檢測(cè)。

圖2 CNMs處理5 d和180 d后濕地植物根系活力的變化注：*表示樣品間有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 2 Root activity of wetland plants under 5 d and 180 d exposure to CNMsNote: *indicates values significantly different from the control over the same exposure period (P<0.05).

2.2 根系酶活性的變化(Changes of enzyme activity in root system)

圖3 植物根系丙二醛(MDA)含量及抗氧化酶活性在不同濃度的CNMs及不同暴露時(shí)間(5 d和180 d)下的變化注：*表示與對(duì)照組相比，處理組樣品有顯著差異(n=3、P<0.05)。Fig. 3 The changes of malondialdehyde (MDA) and antioxidant enzyme activities in roots under different concentrations of CNMs stress after 5 d and 180 d exposureNote: *indicates statistically significant differences (n=3, P<0.05) from the control.

2.3 光合作用速率改變(Changes of photosynthesis rate)

光合作用被認(rèn)為是植物最重要的功能之一。本研究利用光合作用儀對(duì)凈光合速率進(jìn)行了檢測(cè)。如圖4所示，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始5 d后，各組植物的凈光合作用，除了SWCNTs組有輕微降低外(3.6%～7.0%)，另外2組CNMs處理并沒(méi)有顯著變化。在180 d的實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，10 μg·L-1和1 000 μg·L-1的3種CNMs處理對(duì)凈光合作用均有顯著的抑制作用，分別下降17.5%～52.3%(SWCNTs組)、1.0%～47.7%(MWCNTs組)、3.6%～17.3%(nC60組)。相比之下，SWCNTs的暴露對(duì)植物葉片凈光合作用最顯著，其次是MWCNTs，nC60的影響較小。

一般來(lái)說(shuō)，光照度、溫度等外部因素以及還原型輔酶Ⅱ(NADPH)量、Rubisco(1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶)濃度等內(nèi)部因素都會(huì)影響光合效率[28]。在本研究中，MDA的存在表明，根系細(xì)胞膜可能被過(guò)氧化物破壞[5]。此外，MDA的產(chǎn)生過(guò)剩也會(huì)損害光合作用系統(tǒng)中的關(guān)鍵功能過(guò)程。同樣，Huang等[29]報(bào)道，由于過(guò)量的ROS存在，水生植物中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)葉綠素含量和光合系統(tǒng)(PSⅡ)功能、活性都會(huì)下降。考慮到ROS的存在，電子傳遞速率也隨著抑制強(qiáng)度的增加而降低[30]。關(guān)于CNMs對(duì)植物光合作用的影響，王李原[31]研究了MWCNTs對(duì)蘆薈和蜈蚣草的影響，發(fā)現(xiàn)短時(shí)間(24 h)暴露于MWCNTs可以促進(jìn)植物的光合作用，而長(zhǎng)時(shí)間(72 h)暴露光合作用則會(huì)受到抑制，但并沒(méi)有解釋產(chǎn)生機(jī)理。對(duì)于nC60影響大型水生植物光合作用的研究并不多，但是Tao等[32]和Santos等[33]對(duì)柵藻的研究表明，nC60會(huì)降低光合產(chǎn)物和葉綠素的含量，最終造成柵藻死亡、浮萍生長(zhǎng)受阻。因此，對(duì)于本研究中影響葉片凈光合作用程度由大到小依次是SWCNTs>MWCNTs>nC60，與實(shí)驗(yàn)中CNMs誘導(dǎo)MDA產(chǎn)生程度相一致，以此可以推測(cè)CNMs誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過(guò)量MDA是導(dǎo)致葉片凈光合作用下降的關(guān)鍵因素。

圖4 CNMs處理5 d和180 d后濕地植物葉片凈光合速率的變化注：*表示與對(duì)照組相比，處理組樣品有顯著性差異(n=3、P<0.05)。Fig. 4 Net photosynthetic rate of wetland plants under 5 d and 180 d exposure to CNMsNote: *indicates values significantly different from the control over the same exposure period (n=3, P<0.05).

2.4 生物量的變化(Changes of biomass)

對(duì)于CNMs的暴露，植物根葉的響應(yīng)最終表達(dá)在生物量上。經(jīng)過(guò)180 d的暴露試驗(yàn)后，平均每株植物生物量情況，如表1所示。由表1可知，處理組大部分生物量指標(biāo)含量略低于空白組。尤其值得注意的是，經(jīng)SWCNTs和MWCNTs處理180 d后，植株平均總質(zhì)量低于空白組1%～6%，這樣的削弱趨勢(shì)也顯著體現(xiàn)在根干質(zhì)量和葉干質(zhì)量上。而nC60處理組沒(méi)有植物生長(zhǎng)量低的現(xiàn)象。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)植物體內(nèi)主要元素C、N和P的含量也進(jìn)行了測(cè)定，同時(shí)計(jì)算了其占植物干質(zhì)量的比例。結(jié)果顯示，與空白組相比，在SWCNTs處理180 d后，C、N和P的百分含量在低、高濃度處理組分別顯著降低8.1%和17.1%、17.8%和50.5%、14.5%和52.6%；MWCNTs處理組中分別降低0.3%和10.5%、21.7%和32.7%、20.1%和45.0%。不同的是，nC60組表現(xiàn)出了低濃度處理提升植物體內(nèi)C、N和P含量(分別升高1.7%、8.0%和5.8%)，而高濃度處理則削減3種元素含量(分別下降3.5%、10.0%和16.6%)。不同組別內(nèi)植物生物量的差異充分反映了3種CNMs在濕地系統(tǒng)中對(duì)濕地植物生長(zhǎng)狀況的影響。結(jié)合上文提到的根部根系活力、抗氧化酶活性改變以及葉部?jī)艄夂献饔盟俾实淖兓冉Y(jié)果，并通過(guò)分析3種CNMs對(duì)植物的作用機(jī)理，可認(rèn)定存在于廢水中的CNMs在濕地系統(tǒng)中長(zhǎng)期累積，會(huì)顯著改變濕地植物的生長(zhǎng)狀態(tài)。植物作為濕地中不可或缺的組成部分，其根系分泌氧分子及微量有機(jī)物對(duì)根際微生物生理活性具有很好的促進(jìn)作用，借此間接影響濕地處理效能；同時(shí)根系吸收廢水中含N、P元素的營(yíng)養(yǎng)鹽等，也可以直接影響濕地處理效能。不論是直接還是間接影響，都離不開(kāi)植物良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。

2.5 濕地水處理效能變化情況(Changes of treatment efficiency of wetland system)

表1 濕地處理含CNMs人工廢水180 d后濕地植物生物量指標(biāo)變化Table 1 Changes of plant biomass index in wetland system after treating artificial wastewater containing CNMs for 180 d

表2 不同濃度CNMs處理176～180 d水質(zhì)各指標(biāo)去除效率變化Table 2 Changes in removal efficiency of each nutrient at 176～180 d after treatment with different concentrations of CNMs (%)

水生植物是人工濕地中不可缺少的組成部分，其健康情況也直接影響人工濕地中營(yíng)養(yǎng)鹽的去除。CNMs脅迫降低了植物體內(nèi)碳氮磷3種大量元素的百分含量(表1)，這也間接說(shuō)明CNMs投加導(dǎo)致了植物對(duì)碳氮磷養(yǎng)分吸收同化能力的降低，從而削弱了濕地的除污能力。

本研究調(diào)查了香蒲在人工濕地連續(xù)處理含有3種CNMs廢水的短期和長(zhǎng)期響應(yīng)規(guī)律。結(jié)果表明，香蒲急性(5 d)接觸CNMs并沒(méi)有顯著的生理活性方面的改變；連續(xù)處理含CNMs廢水180 d(慢性暴露)后，香蒲根系細(xì)胞受CNMs脅迫，胞內(nèi)抗氧化酶活性及MDA含量升高，導(dǎo)致根系活力受到顯著抑制，抑制程度由強(qiáng)到弱依次為SWCNTs>MWCNTs>nC60；根部MDA含量增加以及抗氧化酶活性上升，說(shuō)明CNMs與香蒲根系長(zhǎng)期接觸，干擾了根系細(xì)胞生理活性，這種干擾在SWCNTs組和MWCNTs組尤為突出，而nC60處理組與空白組比較并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)證明，由于根部遭到CNMs的干擾，香蒲地上部葉片的凈光合作用也表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。暴露于含CNMs的廢水180 d后，由于香蒲生理活性的改變，其生物量嚴(yán)重減少，SWCNTs組和MWCNTs組最為顯著，nC60處理組表現(xiàn)為短期輕微促進(jìn)、長(zhǎng)期抑制的結(jié)果。