環(huán)狀RNA在骨質(zhì)疏松癥中的作用及機(jī)制研究進(jìn)展

董 輝,于 航,王永祥

(1.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院/江蘇省蘇北人民醫(yī)院 骨科,江蘇 揚(yáng)州,225001;2.大連醫(yī)科大學(xué)研究生院,遼寧 大連,116044)

骨質(zhì)疏松癥是一種骨量低下、骨密度降低、骨脆性增加、易發(fā)生骨折的全身骨骼代謝性疾病[1],主要由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成不足與代償破骨細(xì)胞過度骨吸收導(dǎo)致[2]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和生物信息學(xué)的普及，近年來對(duì)骨質(zhì)疏松的研究多集中在基因?qū)用鎇3]。非編碼RNA是臨床重點(diǎn)研究對(duì)象，其中環(huán)狀RNA(circRNA)相對(duì)于微小RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA)具有更加穩(wěn)定的自身環(huán)狀結(jié)構(gòu)，對(duì)核酸外切酶介導(dǎo)的降解具有抗性[4-5],且功能復(fù)雜，來源廣泛，在多種生物體中以時(shí)空特異性方式表達(dá)[6]。此外，circRNA還參與多種細(xì)胞過程，如增殖、遷移和凋亡[7-8],這些特性使得circRNA可能在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、靶向治療等方面發(fā)揮巨大的作用。

1 circRNA的生物學(xué)特性

circRNA是一種主要存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中的由數(shù)百個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，其特征是共價(jià)閉合的連續(xù)環(huán)狀結(jié)構(gòu)[9],其3′頭和5′尾結(jié)合在一起[10]。因剪接結(jié)合方式不同,circRNA又分為外顯子環(huán)狀RNA(ecircRNA)、內(nèi)含子環(huán)狀RNA(ciRNA)和帶有內(nèi)含子的外顯子環(huán)狀RNA(EIciRNA)3種，其中ecircRNA占大多數(shù)，通常由1～5個(gè)外顯子組成，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，而ciRNA和EIciRNA主要存在于細(xì)胞核中[11]。很多研究[12-14]證實(shí)circRNA在細(xì)胞增殖分化和疾病發(fā)生發(fā)展過程中起著潛在的調(diào)節(jié)作用,HUANG Y等[15]發(fā)現(xiàn)circRNA具有作為骨質(zhì)疏松癥診療生物標(biāo)志物的巨大潛力。circRNA通過多種機(jī)制參與各種生理和病理過程，包括miRNA分子海綿、參與mRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控及表達(dá)、與蛋白相結(jié)合發(fā)揮蛋白降解功能、直接翻譯合成蛋白，目前臨床研究主要集中在miRNA分子海綿方面[11]。

2 circRNA的miRNA分子海綿作用

circRNA帶有miRNA結(jié)合位點(diǎn)，通常充當(dāng)miRNA分子海綿[16]。研究[17-18]表明，當(dāng)引入miRNA反應(yīng)元件(MREs)時(shí),circRNA可能競(jìng)爭(zhēng)性地與miRNA結(jié)合，從而影響剪接或轉(zhuǎn)錄來阻止mRNA的翻譯并調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。

2.1 circRNA與成骨細(xì)胞

在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中,HAN S等[19]觀察到hsa-circ-0076690和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX-2)的表達(dá)逐漸增加，而miRNA-152的表達(dá)則隨著時(shí)間推移逐漸降低。對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行hsa-circ-0076690過表達(dá)和敲除處理，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)結(jié)果表明hsa-circ-0076690過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞miRNA-152表達(dá)降低,RUNX-2表達(dá)增加，而hsa-circ-0076690敲除則表現(xiàn)出相反的結(jié)果。此外，成骨相關(guān)生物標(biāo)志物的表達(dá)水平和堿性磷酸酶(ALP)活性的檢測(cè)結(jié)果表明,hsa-circ-0076690過表達(dá)促進(jìn)成骨分化。

JI F等[20]觀察到hsa-circ-0026827在人牙髓干細(xì)胞(DPSCs)來源成骨細(xì)胞分化過程中表達(dá)顯著升高，而敲除hsa-circ-0026827可抑制DPSCs來源的成骨細(xì)胞分化。miRNA表達(dá)譜分析顯示hsa-circ-0026827的下調(diào)促進(jìn)了miR-188-3p的表達(dá)。hsa-circ-0026827沉默后,miR-188-3p下調(diào)可恢復(fù)DPSCs的成骨分化。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí),miR-188-3p是hsa-circ-0026827的靶點(diǎn),Beclin1和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(RUNX1)是miR-188-3p的下游靶點(diǎn)。miR-188-3p過表達(dá)通過靶向調(diào)控Beclin1和RUNX1抑制DPSC成骨分化。由此提示,hsa-circ-0026827通過靶向調(diào)控Beclin1促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，并通過黏附miR-188-3p促進(jìn)RUNX1信號(hào)通路，提示了骨質(zhì)疏松癥的新療法方向。

在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程中,circRNA13685(circIGSF11)的表達(dá)顯著降低,miR-199B-5p的表達(dá)顯著增加。對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的circIGSF11進(jìn)行siRNA沉默后,miR-199B-5p的表達(dá)上調(diào)，而且堿性磷酸酶(ALP)和茜素紅(ARS)染色強(qiáng)度較陰性對(duì)照組增強(qiáng)，促進(jìn)了成骨細(xì)胞的分化[21]。此外還有報(bào)道[22]稱，miR-199B-5p影響糖原合成酶激酶Gsk-3β/β-catenin途徑調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化。因此,circIGSF11可能通過Gsk-3β/β-catenin途徑靶向作用于miR-199B-5p抑制成骨細(xì)胞分化。

小腦變性相關(guān)蛋白1轉(zhuǎn)錄本的反義基因(CDR1as),也被稱為miR-7的環(huán)狀RNA海綿(CIRS-7)[16]。在成骨分化過程中,CDR1as顯著上調(diào)，而miR-7則下降[23]。CDR1as的低表達(dá)和miR-7的過表達(dá)都抑制了ALP活性、ARS染色和Runx2的表達(dá)。CDR1as競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-7,從而觸發(fā)生長分化因子5(GDF5)和隨后的Smad1/5/8、P38和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化的上調(diào)，最終促進(jìn)成骨分化。除上述相關(guān)研究[19-23]外，還有很多研究[24-32]報(bào)道了circRNA通過miRNA分子海綿作用對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生影響，見表1。

表1 circRNA在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化中的作用

2.2 circRNA與破骨細(xì)胞

CHEN X等[33]發(fā)現(xiàn)，在M-CSF和RANKL誘導(dǎo)骨髓單核/巨噬細(xì)胞(BMM)向破骨細(xì)胞分化過程中,circRNA-28313表達(dá)上調(diào)至少3倍。circRNA-28313敲低可顯著抑制體外BMM細(xì)胞中RANKL+CSF1誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，同時(shí)抑制小鼠體內(nèi)卵巢切除(OVX)誘導(dǎo)的骨吸收。生物信息學(xué)分析已證明miR-195a可能與circRNA-28313和CSF1結(jié)合并一起形成circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。circRNA-28313通過充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)緩解miR-195a介導(dǎo)的CSF1抑制，從而調(diào)節(jié)BMM中的破骨細(xì)胞分化。因此,circRNA-28313、miR-195a和CSF1形成ceRNA網(wǎng)絡(luò)以在RANKL+CSF1誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中起作用，從而影響OVX誘導(dǎo)的小鼠骨吸收。

DOU C等[34]建立的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中,miR-31與1個(gè)下調(diào)的circRNA(circRNA-005108)相關(guān)。MIZOGUCHI F等[35]的研究中,RANKL刺激下的破骨細(xì)胞發(fā)育過程中miR-31高度上調(diào)，且用miR-31特異性拮抗劑抑制其表達(dá)后出現(xiàn)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色陽性的破骨細(xì)胞數(shù)量和骨吸收明顯減少。破骨細(xì)胞的Phalloidin染色顯示，抑制miR-31表達(dá)后嚴(yán)重?fù)p害了破骨細(xì)胞外圍肌動(dòng)蛋白環(huán)的形成，出現(xiàn)了成簇的小環(huán)狀足體。在這些破骨細(xì)胞中,miR-31靶基因之一的RhoA的表達(dá)被miR-31抑制而上調(diào)，且用RhoA抑制劑外酶C3干預(yù)后破骨細(xì)胞數(shù)量又得以增長。

LIU S等[36]通過RNA測(cè)序和生物信息學(xué)分析篩選絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMO)患者不同表達(dá)水平的circRNA,發(fā)現(xiàn)circ-0007059在骨質(zhì)疏松癥患者和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞破骨分化過程中表達(dá)下調(diào)。circ-0007059過表達(dá)后miR-378表達(dá)下調(diào)，抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化，且上調(diào)miR-378時(shí)可明顯降低骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)的表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示circ-0007059直接靶向調(diào)控miR-378,而miR-378又靶向調(diào)控BMP-2。轉(zhuǎn)染miR-378模擬物可逆轉(zhuǎn)circ-0007059對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響。這些結(jié)果表明,circ-0007059通過miR-378/BMP-2信號(hào)通路在破骨細(xì)胞形成中發(fā)揮重要作用。靶向調(diào)控circ-0007059/miR-378/BMP-2軸可能是治療骨質(zhì)疏松癥的新思路。

MIAO F等[37]證實(shí)了circRNA-009934在破骨細(xì)胞中高表達(dá)，用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)circRNA-009934靶向作用于miR-5107,并通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了circRNA-009934與miR-5107的結(jié)合關(guān)系。circRNA-009934高表達(dá)時(shí)會(huì)抑制miR-5107的表達(dá)，同時(shí)可顯著上調(diào)其下游TRAF6的表達(dá)，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成。因此,circRNA-009934可作為miR-5107的ceRNA來上調(diào)TRAF6的表達(dá)從而促進(jìn)骨質(zhì)疏松。

LIN J B等[38]利用RT-qPCR方法驗(yàn)證了破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程中具有差異表達(dá)的circRNA,hsa-circ-0002922和hsa-circ-0007710在破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程中上調(diào)。其中hsa-circ-0002922與hsa-miR-181b-5p結(jié)合以調(diào)控MAP2K1的表達(dá),hsa-circ-0007710與hsa-miR-197-3p結(jié)合以調(diào)控MAPK1的表達(dá)。相關(guān)研究[33-38]報(bào)道了circRNA通過miRNA分子海綿作用對(duì)破骨細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生影響，見表2。

表2 circRNA在骨髓單核/巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化中的作用

3 circRNA作為診斷生物標(biāo)志物的應(yīng)用

HUANG Y等[15]通過微陣列分析和定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)發(fā)現(xiàn),circ-0006873和circ-0002060水平在骨質(zhì)疏松癥患者中明顯更高。Pearson相關(guān)分析顯示,circ-0006873和circ-0002060水平與骨質(zhì)疏松癥患者的低骨密度相關(guān)。受試者工作特征(ROC)曲線分析表明,circ-0002060對(duì)骨質(zhì)疏松癥具有潛在的診斷價(jià)值，其敏感性和特異性在骨質(zhì)疏松癥的臨床樣本中分別為78%和69%。生物信息學(xué)、實(shí)驗(yàn)分析和疾病模型綜合分析結(jié)果顯示,circ-0002060可作為骨質(zhì)疏松癥潛在的診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

ZHAO K W等[14]對(duì)PMO患者與正常人的血液樣本進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)381種具有差異表達(dá)的circRNAs,其中circ-0001275經(jīng)qRT-PCR證實(shí)在骨質(zhì)疏松癥組內(nèi)呈高表達(dá)，在非骨質(zhì)疏松癥組內(nèi)呈低表達(dá)?；貧w分析表明circ-0001275與骨密度值具有高度相關(guān)性,ROC曲線下面積為0.759,敏感度和特異度分別為66.4%和85.3%。因此,circ-0001275 可作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的新型診斷生物標(biāo)記物。

XIANG S K等[39]評(píng)估了hsa-circ-0001445作為PMO患者血漿生物標(biāo)志物的潛力。該研究采用qRT-PCR檢測(cè)健康者、骨質(zhì)減少(OPE)患者和PMO患者血漿中hsa-circ-0001445的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PMO患者血漿hsa-circ-0001445表達(dá)水平顯著低于OPE患者和健康對(duì)照者。hsa-circ-0001445表達(dá)與T-score呈正相關(guān)，與β膠原降解產(chǎn)物(β-CTx)呈負(fù)相關(guān)。PMO患者接受抗骨質(zhì)疏松治療后血漿中hsa-circ-0001445表達(dá)明顯上調(diào)，提示血漿hsa-circ-0001445可能是一種新的潛在的PMO診斷生物標(biāo)志物。

4 結(jié) 語

骨吸收和骨形成之間的平衡維持了骨的穩(wěn)態(tài)，當(dāng)平衡打破就會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[40]。目前骨質(zhì)疏松癥的臨床研究主要集中于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞方面，而其發(fā)病機(jī)制的研究尚未取得較大進(jìn)展。circRNA是一類具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的新型非編碼RNA,在細(xì)胞生長、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生理病理反應(yīng)等多種生物學(xué)活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用[41],同時(shí)參與調(diào)控成骨或破骨形成過程，也可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的平衡[42]。本文重點(diǎn)綜述了circRNA在骨質(zhì)疏松癥中的表達(dá)模式及其可能機(jī)制，相信未來其可作為骨質(zhì)疏松癥的診斷標(biāo)志物，并通過合適的載體作為核酸藥物，靶向作用于致病基因來延緩甚至扭轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松進(jìn)程。