國產(chǎn)化細(xì)胞擴增系統(tǒng)及其配套工藝技術(shù)分析

程錦生

（上海東富龍醫(yī)療裝備有限公司，上海 201108）

關(guān)鍵字：細(xì)胞擴增系統(tǒng)；一次性生物反應(yīng)器；生物制藥；自動化；一次性技術(shù)

一次性使用技術(shù)（Single-use Technologies），同時也稱作一次性使用系統(tǒng)（Single Use Systems，SUS）或一次性使用設(shè)備（Single Use Equipment），是一種工藝設(shè)備解決方案，其種類繁多，應(yīng)用范圍廣[1]。在生物制藥領(lǐng)域，近年來，隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域，并開始改變該領(lǐng)域的生產(chǎn)方式。

生物工藝中一次性使用系統(tǒng)，同時也稱作藥用一次性使用技術(shù)，是一種工藝耗材解決方案，通常由聚合材料組件裝配而成，形成一個系統(tǒng)或單元操作，用于單次或一個階段性生物工藝或制藥生產(chǎn)活動[2]。其具備固定投入小、節(jié)省時間、污染風(fēng)險低、操作靈活等優(yōu)勢，可以加快藥物的研發(fā)及上市速度[3]。隨著生物制品行業(yè)的快速發(fā)展，一次性使用技術(shù)正在逐步完善，并廣泛應(yīng)用于生物制藥各個生產(chǎn)環(huán)節(jié)，特別是蛋白、抗體、疫苗及細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)制備[4]。生物工藝中常見的一次性使用系統(tǒng)主要有一次性混合系統(tǒng)、一次性生物反應(yīng)器、一次性純化系統(tǒng)及一次性灌裝系統(tǒng)等。

總體來說，我國一次性技術(shù)的應(yīng)用起步較晚，發(fā)展迅速，越來越多的制藥企業(yè)將一次性技術(shù)引入到制藥工藝中，但絕大多數(shù)一次性設(shè)備系統(tǒng)均為國外品牌，國內(nèi)一次性技術(shù)設(shè)備研發(fā)生產(chǎn)技術(shù)能力薄弱，市場被國外品牌壟斷，嚴(yán)重制約我國生物技術(shù)的發(fā)展。細(xì)胞培養(yǎng)/發(fā)酵用一次性生物反應(yīng)器作為生物技術(shù)的核心，一直是一次性技術(shù)研究的焦點，自1996年一次性生物反應(yīng)器問世以來，經(jīng)過20 多年的發(fā)展，一次性生物反應(yīng)器技術(shù)逐漸成熟，可以滿足多種不同類型及規(guī)模的生產(chǎn)要求[5-6]。但是，縱觀國內(nèi)市場，一次性生物反應(yīng)器還是以國外品牌為主，如Thermo、Sartorius 以及GE 等，缺乏具備競爭力的國產(chǎn)化自主品牌。為了打破國外的壟斷，經(jīng)過長期的研究，開發(fā)了國產(chǎn)化一次性生物反應(yīng)器系統(tǒng)，該系統(tǒng)及配套耗材均由自主研發(fā)生產(chǎn)，并配套對應(yīng)生產(chǎn)工藝技術(shù)，可實現(xiàn)國外品牌的完全替代。

1 一次性細(xì)胞擴增系統(tǒng)

一次性細(xì)胞擴增系統(tǒng)（CES）是自主研發(fā)的國產(chǎn)化搖擺式一次性生物反應(yīng)器，可應(yīng)用于蛋白、抗體、疫苗及細(xì)胞治療產(chǎn)品的種子細(xì)胞擴增及生產(chǎn)。根據(jù)不同的配置需求，可適用于不同的培養(yǎng)模式，系統(tǒng)設(shè)備規(guī)格齊全，覆蓋0.1～100 L 培養(yǎng)體積需求，可實現(xiàn)連續(xù)逐級放大培養(yǎng)及不同規(guī)模的生產(chǎn)要求。系統(tǒng)配備一次性培養(yǎng)袋（CES-BAG）使用，形成全密閉的一次性體系，袋內(nèi)5 倍以上的培養(yǎng)體積放大，可有效地簡化生產(chǎn)操作并預(yù)防污染，一次性培養(yǎng)袋使用后無害化處理，大大簡化后續(xù)清潔作業(yè)并有效杜絕潛在的污染風(fēng)險。

一次性細(xì)胞擴增系統(tǒng)主要分為自動化控制單元及搖擺器。自動化控制單元包含：主機電腦系統(tǒng)，蠕動泵，氣體供應(yīng)及壓力檢測模塊，如圖1所示。

圖1 自動化控制單元Fig.1 Automation control unit

搖擺器包含：搖擺運動單元、加熱單元、pH 值/DO 檢測單元、溫度監(jiān)測單元、過濾器單元保溫箱體、稱重裝置。搖擺運動單元由擺動電機帶動托盤軸承導(dǎo)向進行往復(fù)圓周擺動；加熱單元由加熱元件和導(dǎo)熱底板組成，采用接觸加熱的方式進行加熱；pH 值/DO 監(jiān)測單元由pH 值和DO 變送器及光纖組成，通過光纖連接變送器及一次性培養(yǎng)袋檢測，進行精準(zhǔn)測量及控制。溫度監(jiān)測單元主要由溫度傳感器接收溫度信息用于監(jiān)測及控制溫度；過濾器單元由過濾器加熱器及支架組成，通過加熱器的溫控加熱實現(xiàn)對尾氣過濾器加熱；保溫箱體由RIM 反應(yīng)注射聚氨酯工藝制成，提供優(yōu)良保溫隔熱性能；稱重裝置包含高度調(diào)節(jié)元件，緩沖元件，稱重元件，有效地解決了細(xì)胞擴增搖床工作過程中擺動引起的重量偏差，能夠不受細(xì)胞擴增搖床擺動干擾，精確測量細(xì)胞擴增搖床加液量。

圖2 搖擺器Fig.2 Rocker unit

以上單元模塊通過組合并結(jié)合自動化控制系統(tǒng)軟件組成一次性細(xì)胞擴增系統(tǒng)設(shè)備，系統(tǒng)通過與一次性培養(yǎng)袋配合使用，組成密閉的一次性細(xì)胞培養(yǎng)/發(fā)酵工藝平臺，為蛋白、抗體、疫苗及細(xì)胞治療產(chǎn)品的種子細(xì)胞擴增及生產(chǎn)提供良好的國產(chǎn)化一次性工藝方 案。

2 一次性細(xì)胞擴增系統(tǒng)配套應(yīng)用工藝

細(xì)胞培養(yǎng)/發(fā)酵工藝是生物制藥的關(guān)鍵核心，不同的設(shè)備對應(yīng)不同的工藝技術(shù)路線，一套成熟的工藝需要經(jīng)過一系列的開發(fā)及優(yōu)化過程，可能需要相當(dāng)長的時間。為了更好地支持生物制藥工藝技術(shù)與細(xì)胞擴增系統(tǒng)的結(jié)合，提供配套的工藝作為基礎(chǔ)技術(shù)路線以供參考是非常必要的。針對不同的細(xì)胞類型及培養(yǎng)方式，在驗證實驗室條件下開發(fā)獲得了對應(yīng)的工藝參數(shù)，本文以HEK 293 無血清懸浮培養(yǎng)為例，進行應(yīng)用工藝及效果介紹。

2.1 HEK 293 懸浮培養(yǎng)參考參數(shù)

對于不同培養(yǎng)體系下最佳參數(shù)值，應(yīng)在使用時調(diào)整，需要調(diào)整的情況及調(diào)整方法主要有：

（1）溶氧水平低：調(diào)高轉(zhuǎn)速及擺動角度，角度調(diào)整優(yōu)先；

（2）細(xì)胞聚集成團：調(diào)高轉(zhuǎn)速及擺動角度，角度調(diào)整優(yōu)先；

（3）產(chǎn)生大量氣泡：降低轉(zhuǎn)速，提高搖擺角度。

2.2 HEK 293 逐級放大培養(yǎng)作業(yè)工藝流程

2.2.1 HEK 293 細(xì)胞株復(fù)蘇及上游細(xì)胞搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞量達到CES 細(xì)胞擴增系統(tǒng)所需接種量時，即可接種至CES 細(xì)胞擴增系統(tǒng)進行逐級放大培養(yǎng)。

注：接種一般建議細(xì)胞密度不小于0.6×106/mL，最小接種體積為CES-BAG 最大體積的10%。

2.2.2 選擇適當(dāng)規(guī)格的CES 細(xì)胞擴增系統(tǒng)及配套CES-BAG，參考CES 使用說明連接設(shè)備管線并安裝CES-BAG。

2.2.3 CES 細(xì)胞擴增系統(tǒng)開機，登錄系統(tǒng)控制軟件，設(shè)定作業(yè)批號，選擇培養(yǎng)模式并充氣，之后進入“校正”界面，進行泵校正及pH 值/DO（輸入CESBAG 參數(shù)）確認(rèn)。

注：系統(tǒng)軟件根據(jù)關(guān)聯(lián)設(shè)定自動監(jiān)控pH 值和DO，pH 調(diào)節(jié)可關(guān)聯(lián)CO2或酸/堿，DO 可關(guān)聯(lián)O2和N2。

2.2.4 使用補料瓶或補料袋通過內(nèi)置/外置泵將預(yù)先配制的新鮮培養(yǎng)基泵入CES-BAG 內(nèi)，設(shè)定培養(yǎng)基平衡過程中的運行參數(shù)，培養(yǎng)基介質(zhì)平衡需2 h 以上。

注：介質(zhì)平衡過程中pH 值與溫度參數(shù)設(shè)定要求與培養(yǎng)過程基本相同，pH 值設(shè)定7.0/7.1，溫度設(shè)定在36.5～37℃之間，搖擺速度、角度及通氣量參考《工藝參數(shù)設(shè)置參考明細(xì)表》中參數(shù)。

2.2.5 當(dāng)介質(zhì)培養(yǎng)基pH 值及溫度完全平衡后，取樣4～8 mL 檢測pH 值，根據(jù)檢測值進入“校正”界面設(shè)置偏離值并標(biāo)定100% a.s DO。

2.2.6 收集上游HEK 293 細(xì)胞至轉(zhuǎn)種瓶，通過設(shè)定的補料泵接種至CES-BAG 內(nèi)的已平衡培養(yǎng)基中，設(shè)定培養(yǎng)T：36.5～37℃，pH 值：7.0/7.1，DO：40%，并設(shè)定對應(yīng)的死區(qū)及報警上限，搖擺速度、搖晃角度及通氣量，參考表1。

表1 工藝參數(shù)設(shè)置參考表（數(shù)據(jù)來自驗證實驗室）Tab.1 Process parameters settings reference list

注：推薦設(shè)定值，死區(qū)：T 為0.2℃，pH 值為0.2，DO 為2%；報警上下限T 為35.5～37.5℃，pH 值為6.7/7.4，DO 為38%～150%。

2.2.7 點擊“啟動”按鈕開始設(shè)備運行，CES 細(xì)胞擴增系統(tǒng)根據(jù)設(shè)定參數(shù)及關(guān)聯(lián)設(shè)定自動通過PID 控制，細(xì)胞培養(yǎng)過程中取樣監(jiān)測細(xì)胞密度、活率、糖含量及代謝情況，根據(jù)需要添加培養(yǎng)基或補料繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中隨著細(xì)胞密度擴大及培養(yǎng)體積擴大，轉(zhuǎn)速、搖晃角度及通氣量需做適當(dāng)調(diào)節(jié)，詳參見表1。

2.2.8 當(dāng)CES-BAG 內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)體積放大到最大，可繼續(xù)培養(yǎng)，在細(xì)胞處于指數(shù)生長期時，收獲轉(zhuǎn)種至下一級CES細(xì)胞擴增系統(tǒng)或大規(guī)模生物反應(yīng)器繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3 應(yīng)用實例

CES-100L HEK 293 無血清培養(yǎng)。

2.3.1 培養(yǎng)流程

（1）將培養(yǎng)的種子細(xì)胞接種至CES-100L 的100 L CES-BAG（有效培養(yǎng)體積10～50 L）內(nèi)，初始接種體積10 L，初始接種密度0.6×106/mL。

（2）設(shè)定初始培養(yǎng)參數(shù)（pH 值/DO 模式）T：37℃、pH 值：7.0、DO：40%、轉(zhuǎn)速：12 r/min、角度：5°，通氣量1 000 mL/min。

（3）培養(yǎng)過程中，CES-100S 細(xì)胞擴增系統(tǒng)自動監(jiān)控培養(yǎng)過程關(guān)鍵參數(shù)，作業(yè)人員每天通過取樣程序，使用注射器從取樣口取樣檢測，檢測活細(xì)胞密度、活性、pH 值、Gluc 并記錄。

（4）根據(jù)細(xì)胞檢測結(jié)果按照0.6×106/mL 補充培養(yǎng)基，擴大培養(yǎng)。

（5）當(dāng)培養(yǎng)體積擴大到最大培養(yǎng)體積50 L 時，繼續(xù)培養(yǎng)，補充葡萄糖，維持糖含量2～6 g/L。

注：測試過程關(guān)鍵參數(shù)設(shè)定詳見表2。

表2 細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)記錄表Tab.2 Cell expension main parameters daily test record

圖3 CES-100L HEK 293 生長曲線Fig.3 CES-100L HEK 293 cell expension profile

2.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)效果

結(jié)果評價：HEK293 細(xì)胞在接種后即開始進入快速增長，HEK293 最高活細(xì)胞密度（PVCD）1.234×107/ mL，到達平臺最高密度之前，細(xì)胞活性保持在95%以上。細(xì)胞培養(yǎng)擴增效果滿足用戶需求，完全可以替代進口設(shè)備。

一次性細(xì)胞擴增系統(tǒng)系列產(chǎn)品型號有10 L、25 L、50 L、100 L 及200 L，細(xì)胞培養(yǎng)體積0.2～100 L，對市面上同類進口設(shè)備的培養(yǎng)體積規(guī)模實現(xiàn)全覆蓋，滿足上游細(xì)胞、規(guī)模化放大及生產(chǎn)表達要求，可有力支持我國抗體、蛋白、疫苗及細(xì)胞基因行業(yè)的研發(fā)及規(guī)?；a(chǎn)。

3 結(jié)束語

一次性細(xì)胞擴增系統(tǒng)是自主國產(chǎn)化一次性生物反應(yīng)器設(shè)備系統(tǒng)，為細(xì)胞培養(yǎng)/發(fā)酵提供一次性工藝解決方案支持，可實現(xiàn)對進口品牌的國產(chǎn)化替代，有助于打破進口品牌對國內(nèi)市場的壟斷。目前一次性擴增系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于多種生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其在疫苗及免疫細(xì)胞治療領(lǐng)域，未來隨著其在生物制藥領(lǐng)域應(yīng)用的深入，一次性擴增系統(tǒng)設(shè)備及配套技術(shù)將逐步優(yōu)化提升，得到更廣泛的認(rèn)可，實現(xiàn)對進口品牌的完全替代。