鐵死亡調(diào)控機(jī)制及在肺癌治療中的研究進(jìn)展

徐 飛，陳維達(dá)，郭溟浩，陳澤濤

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)科，山東 濟(jì)南 250014)

肺癌(lung cancer,LC)是全球腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一，其高發(fā)病率、高病死率成為世界關(guān)注的焦點(diǎn)。然而，傳統(tǒng)的治療手段以及分子靶向藥物、腫瘤免疫療法并沒有為晚期或復(fù)發(fā)患者帶來理想的利益。面對上述治療困境，進(jìn)一步探究肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，尋找有效的治療方法與藥物，是肺癌研究領(lǐng)域亟需解決的問題。

既往根據(jù)細(xì)胞形態(tài)，將細(xì)胞死亡分為3種類型：凋亡(apoptosis)、自噬(autophagy)和細(xì)胞壞死(necrosis)。2012年，一種鐵依賴性的脂質(zhì)過氧化損傷導(dǎo)致的新型非凋亡細(xì)胞死亡模式被提出，命名為“鐵死亡” (ferroptosis)[1]。它本質(zhì)上是由膜脂修復(fù)酶——谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase 4,GPX4)活性失效、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物代謝障礙、鐵依賴的脂質(zhì)活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)大量累積所致的細(xì)胞死亡，在形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)、生化特征上與凋亡、壞死、自噬具有顯著差異[1]。在形態(tài)學(xué)上，鐵死亡主要表現(xiàn)為線粒體體積縮小、線粒體膜密度增加、線粒體嵴減少甚至消失、外膜破裂，而無細(xì)胞核濃縮、染色質(zhì)邊緣化[1]。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞對鐵需求量增加，ROS水平明顯升高，正是這種對鐵的高依賴性和高水平ROS，使得腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生鐵死亡[1]。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡成為一種新型的抗肺癌治療策略。本文將對鐵死亡調(diào)節(jié)機(jī)制、鐵死亡與肺癌的關(guān)系作一綜述，以期為肺癌的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 鐵死亡的調(diào)節(jié)機(jī)制

鐵代謝、氨基酸和谷胱甘肽代謝以及脂質(zhì)代謝是鐵死亡的3大生化過程。

1.1 鐵代謝

鐵在食物中主要以Fe3+形式存在，經(jīng)腸道鐵還原酶如細(xì)胞色素B、血紅素加氧酶1(HO-1)等還原成Fe2+，并在二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(divalent metal transporter 1,DMT1)的作用下轉(zhuǎn)運(yùn)至小腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cell,IEC)，被IEC吸收[2]。在鐵死亡過程中DMT1表達(dá)上調(diào)[2]。IEC所吸收的鐵(Fe2+)在膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ferroportin 1,FPN1)的作用下被運(yùn)輸至細(xì)胞外，并在腸細(xì)胞基地外側(cè)被多銅氧化酶蛋白氧化為Fe3+，與轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,TF)結(jié)合形成TF-Fe3+復(fù)合物，經(jīng)血液循環(huán)，運(yùn)輸至各組織與臟器[2]。循環(huán)中的TF-Fe3+與細(xì)胞膜表面上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1 (transferrin receptor 1,TFR1)結(jié)合，經(jīng)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，F(xiàn)e3+被釋放，繼而被前列腺六跨膜表皮抗原3(six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3,STEAP3)還原為Fe2+，經(jīng)DMT1進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[2-3](圖1)。細(xì)胞質(zhì)中的Fe2+稱為不穩(wěn)定鐵池，具有代謝活性，在多種生物功能中發(fā)揮作用，如凋亡、壞死、鐵死亡等。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵過載和抗氧化能力不足時(shí)，游離的Fe2+，一方面，通過芬頓反應(yīng)直接催化脂質(zhì)過氧化物，產(chǎn)生大量羥自由基，激起強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量的ROS，誘發(fā)鐵死亡[2]；另一方面，作為輔助因子，增強(qiáng)各種代謝酶(如LOX家族脂氧合酶、PDH1)活性，促進(jìn)脂質(zhì)ROS的生成[2]。因此，鐵是鐵死亡的必要元素，鐵代謝是鐵死亡的必要過程。

1.2 氨基酸和谷胱甘肽代謝

谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體system Xc-，作為跨膜蛋白，由兩個(gè)亞基組成——輕鏈SLC7A11(也稱為xCT)和重鏈SLC3A2(也稱為CD98)[1](圖1)。xCT為其主要功能亞基，由SLC7A11基因編碼合成，對胱氨酸和谷氨酸有高度的特異性，負(fù)責(zé)主要的轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)；SLC3A2，主要作為伴侶蛋白，維持xCT蛋白的穩(wěn)定性。System Xc-調(diào)控著胞外胱氨酸和胞內(nèi)谷氨酸以1∶1比例交換進(jìn)出細(xì)胞[1]。谷氨酸(glutamic acid,Glu)、半胱氨酸(cysteine,Cys)和甘氨酸(glycine,Gly)在谷氨酸-半胱氨酸連接酶(glutamate cysteine ligase,GCL)和谷胱甘肽合成酶(glutamylcysteine synthetase,GSS)的催化下，生成還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)(圖1)。谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidases,GPXs)是一種進(jìn)化上高度保守的酶，以GSH為輔助因子，將過氧化物(如R-OOH)還原為相應(yīng)的醇(如R-OH)，從而限制鐵依賴的有毒自由基的形成(如R-O·)，抑制脂質(zhì)ROS的生成[1](圖1)。GPX4是鐵死亡中最核心的調(diào)控因子，胞內(nèi)GSH含量直接影響GPX4酶活性。

圖1 鐵死亡調(diào)節(jié)機(jī)制示意圖 Fig 1 Regulatory mechanism of ferroptosis

1.3 脂質(zhì)代謝

脂質(zhì)過氧化是指自由基或非自由基等氧化劑從多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)的二烯丙基亞甲基群中獲取一個(gè)不穩(wěn)定的氫原子，通過氧化作用生成大量脂質(zhì)過氧化自由基和過氧化氫的過程[4]。細(xì)胞內(nèi)PUFAs的含量決定著細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度以及對鐵死亡的敏感性。細(xì)胞經(jīng)鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin處理后，PUFAs花生四烯酸等和PUFA衍生物煙油酸鹽等含量明顯減少[5]。許多參與調(diào)控脂肪酸合成的因子和信號分子，如谷氨酰胺分解反應(yīng)、檸檬酸合成酶和乙酰輔酶A羧化酶等脂氧合酶，通過介導(dǎo)脂質(zhì)氧化參與調(diào)控鐵死亡過程[6]。

酯?；o酶A合成酶長鏈家族成員4(acyl-CoA synthetase long-chain familymember4,ACSL4)是鐵死亡脂質(zhì)代謝的助力者。一方面，ACSL4和磷脂膽堿?；D(zhuǎn)移酶3(lysophosphatidylcholine acyltrans-ferase 3,LPCAT3)將游離的長鏈多不飽和脂肪酸活化，促進(jìn)溶血卵磷脂轉(zhuǎn)換為卵磷脂，參與氧化細(xì)胞膜磷脂質(zhì)的合成，進(jìn)而介導(dǎo)鐵死亡過程[7]；另一方面，ACSL4將花生四烯酸輔酶A酯化成酰基輔酶 A(coenzyme A,CoA)，用于脂肪酸氧化和鐵死亡所需多不飽和脂肪酸的生物合成[7]。CoA的缺失使得脂質(zhì)過氧化底物減少，鐵死亡程度下降[7]。在PUFAs相關(guān)的磷脂質(zhì)中，含有花生四烯酸(arachidonoyl,AA)或腎上腺酸(adrenoyl,AdA)的磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamines,PEs)，是鐵死亡中脂質(zhì)氧化作用的關(guān)鍵底物，能夠被15-脂氧合酶(15-LOX)氧化生成脂質(zhì)過氧化氫(H2O2)，促進(jìn)鐵死亡[8]。當(dāng)ACSL4基因敲除或功能抑制時(shí)，AA或AdA酯化過程受阻，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生減少，鐵死亡被抑制[7]。

2 鐵死亡與肺癌的關(guān)系

2.1 鐵死亡與肺癌發(fā)生發(fā)展

2.1.1 鐵離子：流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)室研究證實(shí)，鐵超載與肺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，高鐵攝入量與肺癌風(fēng)險(xiǎn)之間存在顯著正相關(guān)性。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，肺癌患者的血清鐵、鐵蛋白、總鐵結(jié)合力明顯高于健康對照組，血清鐵濃度越高，患肺癌風(fēng)險(xiǎn)越大[9]。與之結(jié)果一致的是，臺灣一項(xiàng)研究對2018年至2009年309 443名的招募時(shí)，非腫瘤人群進(jìn)行中位隨訪時(shí)間為7.07年的隨訪，其中8 060例確診腫瘤，3 066例因腫瘤死亡，高血清鐵(>120 μg/dL)增加了惡性腫瘤的發(fā)病與死亡風(fēng)險(xiǎn)，且與腫瘤發(fā)病率與病死率成正相關(guān)[10]。大量基礎(chǔ)研究表明，過量的鐵會誘發(fā)凋亡、壞死和鐵死亡[3]。鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin促進(jìn)ROS的累積和細(xì)胞死亡，外源性鐵顯著增強(qiáng)erastin所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而鐵離子螯合劑(deferoxamine,DFO)能夠逆轉(zhuǎn)erastin所引起的細(xì)胞死亡現(xiàn)象[1]。在裸鼠肺癌腫瘤模型中，過表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1,TFR1加快肺癌細(xì)胞對鐵的吸收速度，促進(jìn)腫瘤生長，縮短小鼠生存期[11]。熱休克蛋白B1(heat shock protein B1，HSPB1)通過抑制TFR1循環(huán)，降低細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度；HSPB1的失活有助于鐵的積累，促進(jìn)erastin所誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞鐵死亡[12]。值得一提的是，雖然鐵可以通過芬頓反應(yīng)促進(jìn)脂類ROS生成，但其他途徑(如H2O2)造成的ROS累積并不會引起鐵死亡。因此，鐵在鐵死亡中的作用機(jī)制和應(yīng)用方面的許多問題仍然沒有答案。

2.1.2 SLC7A11：SLC7A11為一種潛在的肺癌生物標(biāo)志物，與癌旁組織相比，SLC7A11在NSCLC組織中高表達(dá)，與生存期成負(fù)相關(guān)[13]。在體內(nèi)外，SLC7A11均能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增值與轉(zhuǎn)移，敲減SLC7A11可逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象[13]。在人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中，SLC7A11通過介導(dǎo)胱氨酸攝取幫助肺癌細(xì)胞在細(xì)胞應(yīng)激下重建氧化還原穩(wěn)態(tài)，減少ROS的生成，具有促進(jìn)腫瘤的作用；反之，siRNA干擾敲低SLC7A11表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)GSH含量，抑制A549細(xì)胞增殖[13]。

在KARS突變型肺腺癌患者中，SLC7A11高表達(dá)，與肺癌進(jìn)展呈正相關(guān)[14]。與之對應(yīng)的是，在KARS突變的肺腺癌細(xì)胞系中，胞內(nèi)胱氨酸、GSH含量較高。敲除SLC7A11基因或阻斷SLC7A11功能，能夠降低胞內(nèi)胱氨酸攝取、抑制細(xì)胞內(nèi)GSH的生物合成，在體外顯著抑制腫瘤生長與轉(zhuǎn)移、延長小鼠生存期，在體內(nèi)選擇性殺傷KARS突變的肺癌細(xì)胞[14]。KARS突變型肺腺癌細(xì)胞對SLC7A11的缺失更為敏感，這為KARS突變肺癌的治療帶來希望。

2.1.3 GPX4：GPX4在癌組織中的表達(dá)高于正常組織，與肺癌TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移成正相關(guān)，與患者預(yù)后、生存期呈負(fù)相關(guān)；肺癌細(xì)胞系亦呈現(xiàn)GPX4高表達(dá)狀態(tài)[15]。過表達(dá)GPX4能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖，抵抗鐵死亡；反之，siRNA 敲減GPX4表達(dá)或RSL3抑制GPX4活性，抑制H1299、A549和NCI-H460細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，而鐵死亡抑制劑ferrostatin-1(Fer-1)可逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象[15]。這意味著抑制GPX4能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，靶向GPX4可能是一種新的肺癌治療模式。

2.1.4 FSP1：FSP1是一種獨(dú)立于經(jīng)典GPX4信號通路的鐵死亡抑制因子和非線粒體CoQ抗氧化劑系統(tǒng)的關(guān)鍵成分[16]。當(dāng)肺癌細(xì)胞GPX4基因缺失時(shí)，F(xiàn)SP1被豆蔻?；揎棧肗AD(P)H還原CoQ10，生成親脂性自由基捕獲抗氧化劑(radical-trapping antioxidants,RTA)阻止脂質(zhì)過氧化，從而抑制鐵死亡[16]。FSP1表達(dá)水平越高，肺癌細(xì)胞鐵死亡抵抗程度越大，而FSP1抑制劑(iFSP1)可逆轉(zhuǎn)FSP1所致的鐵死亡抵抗，增加肺癌細(xì)胞對鐵死亡的敏感性，促進(jìn)肺癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[16]。目前，對于FSP1的研究還處于萌芽階段，后續(xù)還需進(jìn)一步研究。

2.2 鐵死亡與化療藥物耐藥

順鉑(cisplatin，DDP)通過促進(jìn)脂質(zhì)過氧化，升高M(jìn)DA、ROS，促進(jìn)HO-1和NQO-1的表達(dá)，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞鐵死亡，而這一過程可被Fer-1所抑制[17]。Nrf2/xCT通路的激活是NSCLC細(xì)胞耐順鉑的主要機(jī)制之一。Erastin和索拉菲尼通過抑制Nrf2下游靶基因xCT的表達(dá)，耗竭GSH，誘發(fā)鐵死亡，降低細(xì)胞活性，增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞對順鉑的敏感性[18]。相反，過表達(dá)SLC7A11增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性[18]。將SLC7A11的表達(dá)與1 400種候選抗癌藥物的效力聯(lián)系起來，其中，與39種藥物藥效呈正相關(guān)，與296種藥物藥效呈負(fù)相關(guān)，提示SLC7A11可作為谷胱甘肽介導(dǎo)的抗癌藥物耐藥性的預(yù)測因子，預(yù)測多種化學(xué)藥物敏感性[19]。

與A549細(xì)胞相比，A549-DDP細(xì)胞(A549順鉑耐藥株)高表達(dá)GPX4[20]。抑制GPX4可增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性作用；反之，過表達(dá)GPX4導(dǎo)致順鉑細(xì)胞毒性減弱[20]。與單純順鉑或GPX4特異性抑制劑RSL3治療相比，順鉑聯(lián)合RSL3顯著抑制了H1299和A549細(xì)胞活性、遷移與侵襲，MDA、ROS、脂質(zhì)過氧化物含量升高，提示RSL3可增強(qiáng)順鉑的敏感性[20-21]。

此外，鐵自噬被證實(shí)促進(jìn)癌細(xì)胞鐵死亡。在這一過程中，鐵蛋白降解，鐵離子從內(nèi)涵體釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)不穩(wěn)定的鐵池中，從動(dòng)態(tài)鐵池釋放的過量的鐵通過芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生大量的ROS，誘發(fā)鐵死亡。順鉑處理肺癌細(xì)胞所引起的細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度、MDA和ROS含量升高、鐵蛋白(ferritin 1,FTH1)表達(dá)下降，被自噬抑制劑3-MA所逆轉(zhuǎn)，提示順鉑能夠誘發(fā)鐵自噬[20]。在體外，與順鉑組相比，順鉑聯(lián)合RSL3組FTH1水平下降，自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B Ⅱ/LC3BⅠ比值升高、P62蛋白水平下降，細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度和MDA含量增加[20]?？傊鲜霈F(xiàn)象表明，順鉑能夠通過介導(dǎo)鐵自噬，誘發(fā)鐵死亡。

2.3 鐵死亡與放療抵抗

經(jīng)放射治療(ionizing radiation,IR;簡稱放療)處理后，NSCLC細(xì)胞ROS含量升高，ACSL4、SLC7A11、GPX4表達(dá)升高，線粒體縮小，膜密度增強(qiáng)，為典型的鐵死亡形態(tài)學(xué)特征；鐵死亡抑制劑Fer-1可逆轉(zhuǎn)IR所引起的細(xì)胞死亡，提高NSCLC細(xì)胞活性[22]。采用CRISPR/Cas9技術(shù)沉默H460和A549細(xì)胞中ACSL4表達(dá)后，ACSL4的缺失顯著減弱了erastin所誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞鐵死亡，促進(jìn)放療抵抗[22]。過表達(dá)SLC7A11或GPX4基因削弱IR所誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低鐵死亡標(biāo)志基因PTGS2的表達(dá)，抑制鐵死亡，增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞的放療抵抗性[22]。與正常NSCLC細(xì)胞相比較，GPX4在放療抵抗性NSCLC細(xì)胞中表達(dá)明顯升高[23]。RNA干擾技術(shù)沉默GPX4后，放療抵抗性A549(A549-R)和H460(H460-R)對鐵死亡的敏感性增強(qiáng)[23]。因此，鐵死亡激活劑erastin能夠增強(qiáng)A549-R和H460-R細(xì)胞對放療的敏感性，降低NSCLC細(xì)胞對放療的耐藥性，促進(jìn)細(xì)胞死亡；反之，鐵死亡抑制劑DFO可部分“挽救”erastin所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[23]。MicroRNA(miRNA)是一種非編碼RNA，參與調(diào)控多種癌基因表達(dá)，在放療抵抗性NSCLC細(xì)胞中，miR-7-5p表達(dá)升高，miR-7-5p通過下調(diào)線粒體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，降低Fe2+濃度，減弱芬頓反應(yīng)，降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量，抑制鐵死亡，增強(qiáng)細(xì)胞放射抵抗性[24]。

2.4 鐵死亡與免疫治療

T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在腫瘤發(fā)生發(fā)展中過程中發(fā)揮重要作用。在免疫治療過程中活化的CD8+T細(xì)胞能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)鐵死亡特異性的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；反之，鐵死亡的激活有助于免疫治療的抗腫瘤效果[25]。CD8+T細(xì)胞釋放的IFN-γ下的表達(dá)，抑制胱氨酸的攝取，促進(jìn)脂質(zhì)過氧化和鐵死亡[25]。耗竭胞內(nèi)胱氨酸或阻斷PD-L1免疫檢查點(diǎn)，顯著增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡[25]。同時(shí)，臨床數(shù)據(jù)顯示，在黑色素患者中，胱氨酸相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC7A11和SLC3A2的表達(dá)與CD8+T細(xì)胞的數(shù)量、IFN-γ的表達(dá)水平以及患者的預(yù)后成負(fù)相關(guān)[25]。雖然目前針對肺癌，T細(xì)胞與鐵死亡的關(guān)系未明確指出，但是，不難發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞鐵死亡是一種潛在的治療方法，有助于增強(qiáng)免疫治療療效。

3 總結(jié)

鐵死亡，作為一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡形式，在腫瘤治療中表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢和巨大的潛力。許多侵襲性和抗藥性的癌細(xì)胞對鐵死亡的敏感性，以及美國FDA批準(zhǔn)六甲蜜胺(altretamine)、索拉菲尼(sorafenib)、二氧化硅納米顆粒(silica nanoparticles)作為鐵死亡誘導(dǎo)劑用于腫瘤治療，這使得人們對鐵死亡的治療潛力產(chǎn)生了很高的期望。雖然，近年來鐵死亡相關(guān)研究取得了巨大的進(jìn)展，但仍有一些懸而未決的問題有待解決，如鐵死亡中ROS的特殊性、鐵死亡在免疫治療中的具體作用等。此外，不同組織間細(xì)胞對鐵死亡的敏感性存在很大的差異，對鐵死亡誘導(dǎo)劑索拉菲尼、erastin等敏感性也具有顯著的個(gè)體間差異。因此，尋找能夠反映細(xì)胞、個(gè)體對鐵死亡敏感性的生物指標(biāo)、發(fā)現(xiàn)新的鐵死亡誘導(dǎo)劑，對于提高對鐵死亡相關(guān)疾病的認(rèn)識、肺癌診療水平具有重要意義。鐵死亡將成為腫瘤治療的一種新策略，打破目前肺癌治療的瓶頸，為肺癌患者帶來利益。