早產(chǎn)合并認(rèn)知障礙大鼠糞便短鏈脂肪酸水平變化

薛正陽，盧紅艷，唐煒，樂濤

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群改變與認(rèn)知發(fā)育異常存在明顯相關(guān)性[1]。人類腸道菌群多樣性和豐度下降與自閉癥發(fā)生密切相關(guān)[2]，且與糞便短鏈脂肪酸含量變化有關(guān)。短鏈脂肪酸是一組少于六個碳的有機(jī)脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等，前三者占腸道中短鏈脂肪酸95%以上。對自閉癥患兒的研究發(fā)現(xiàn)，主要產(chǎn)丁酸的腸道菌群豐度降低，產(chǎn)戊酸相關(guān)細(xì)菌豐度增加，糞便中乙酸和丁酸含量較低，戊酸水平較高[3]。腹腔注射丁酸鈉可減輕自閉癥小鼠社交功能缺陷[4]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者糞便中乙酸及丙酸明顯較低，將其糞便微生物群移植到缺乏微生物群的大鼠身上會傳播焦慮樣行為[5]。以上研究結(jié)果提示，腸道菌群代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸可能直接影響大腦功能。目前，糞便短鏈脂肪酸變化是否會導(dǎo)致早產(chǎn)后認(rèn)知障礙尚不明確。本研究應(yīng)用高通量測序與氣相色譜技術(shù)定量檢測早產(chǎn)認(rèn)知障礙大鼠糞便腸道菌群以及短鏈脂肪酸含量，探討腸道菌群及其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸與早產(chǎn)后認(rèn)知障礙發(fā)生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑與儀器

60只SPF級健康孕16～17 d SD孕鼠，11周齡，體質(zhì)量(410±40) g，由江蘇大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(蘇)2013-0036。

脂多糖(美國Sigma公司)；Morris水迷宮實驗相關(guān)儀器由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗室提供；Illumina MiSeq測序儀(美國Illumina公司)；Onedrop儀器(南京五義科技有限公司)；GC-14B型氣相色譜儀(日本Shimadzu公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及處理 認(rèn)知障礙大鼠模型制備參考本實驗室方法[6]。將60只孕鼠隨機(jī)分成實驗組與對照組，每組30只，實驗組連續(xù)2 d腹腔注射脂多糖，對照組注射PBS；孕21 d(足月為22～23 d)對兩組孕鼠行剖宮術(shù)取出早產(chǎn)大鼠，獲得30只實驗組早產(chǎn)大鼠和15只對照組早產(chǎn)大鼠。通過定位航行實驗，從實驗組早產(chǎn)大鼠中篩選出21只得分低的早產(chǎn)大鼠作為認(rèn)知障礙組，從對照組早產(chǎn)大鼠中篩選出10只作為對照組。比較兩組大鼠在定位航行實驗中找到平臺平均時間，采集大鼠糞便，并于-80 ℃保存待用。

1.2.2 高通量測序檢測腸道菌群 糞便腸道菌群檢測采用高通量測序16S rRNA檢測方法[6]，提取的基因組建庫后，在MiSeq平臺上進(jìn)行300×2 bp測序，該測序服務(wù)由天益健康科學(xué)研究院(鎮(zhèn)江)有限公司提供。

菌群數(shù)據(jù)應(yīng)用Ribosomal Database Project (RDP) Classifier 2.3軟件，與細(xì)菌數(shù)據(jù)庫Silva(v129)，生成各樣品分類學(xué)數(shù)據(jù)。采用PICRUSt方法，分析各樣品中菌群代謝基因豐富度及多樣性。

1.2.3 氣相色譜技術(shù)檢測糞便短鏈脂肪酸含量 取1 g糞便樣本，加入超純水5 mL，振蕩混勻；取 1 mL上清液，按照5 ∶1加入偏磷酸巴豆酸混合溶液(內(nèi)標(biāo))，-20 ℃保存過夜；解凍后12 000 r/min離心10 min；取上清液再加入樣品1 mL，迅速振蕩搖勻。測定前再12 000 r/min離心10 min；取上清液直接進(jìn)樣，用 1.0 μL微量進(jìn)樣器瞬時注入色譜儀，進(jìn)樣量為0.2～1.0 μL。通過標(biāo)準(zhǔn)樣品和內(nèi)標(biāo)巴豆酸各自的峰面積計算出各個樣品中乙酸、丙酸及丁酸濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 定位航行實驗

早產(chǎn)認(rèn)知障礙大鼠找到平臺的平均時間[(40±5)s]明顯長于對照組[(18±4)s，t=13.29,P<0.01]。

2.2 大鼠糞便腸道菌群多樣性指數(shù)分析

Chao1及Ace指數(shù)常代表菌群豐富度，Shannon 指數(shù)及Simpson 指數(shù)常代表菌群多樣性。認(rèn)知障礙組Chao1、Ace及Shannon指數(shù)明顯低于正常對照組 (P均<0.05)，兩組間Simpson 指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠腸道菌群豐富度及多樣性指標(biāo)比較

2.3 大鼠糞便腸道菌群分析

從門水平而言，擬桿菌門與厚壁菌門構(gòu)成所有樣本中主要優(yōu)勢菌群。其中，認(rèn)知障礙組變形菌門豐度較對照組增加(P<0.05)，其他菌門比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。從目、屬水平而言，與對照組比較，認(rèn)知障礙組大鼠腸道中乳桿菌屬、擬桿菌目明顯降低(P均<0.05)。見表3。

表2 兩組大鼠腸道菌群門水平優(yōu)勢菌群比較

表3 兩組大鼠腸道菌群目、屬水平優(yōu)勢菌群比較 M(P25，P75)，%

2.4 兩組大鼠糞便短鏈脂肪酸變化

經(jīng)檢驗分析，認(rèn)知障礙組總短鏈脂肪酸與乙酸水平明顯低于對照組(P均<0.05)，其他短鏈脂肪酸差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表4。

表4 兩組大鼠糞便短鏈脂肪酸含量比較 M(P25，P75)，μmol/g

2.5 糞便短鏈脂肪酸與代表菌屬的相關(guān)性分析

將認(rèn)知障礙組大鼠短鏈脂肪酸與腸道菌群進(jìn)行Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌、擬桿菌與乙酸呈一定的正相關(guān)(r=0.488，0.361，P均<0.05)。

3 討論

定位航行實驗是一種研究動物大腦認(rèn)知功能的經(jīng)典實驗手段。本研究結(jié)果顯示，在定位航行實驗中，與對照組相比，早產(chǎn)認(rèn)知障礙大鼠找到平臺的平均時間明顯延長，提示造模成功，表明認(rèn)知障礙組存在認(rèn)知障礙。

SD大鼠1月齡與人類2～5歲即幼兒期等同，此時能充分評估認(rèn)知功能發(fā)育正常與否，且Morris水迷宮實驗是評估嚙齒類動物認(rèn)知障礙的金標(biāo)準(zhǔn)，故早產(chǎn)大鼠出生30 d后，通過Morris水迷宮實驗中的定位航行實驗，可證明早產(chǎn)大鼠是否存在認(rèn)知障礙。

腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變與認(rèn)知障礙聯(lián)系緊密。Liu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，認(rèn)知障礙患者腸道菌群多樣性下降。Kelly等[8]發(fā)現(xiàn)，患有認(rèn)知障礙疾病患者腸道菌群數(shù)量與多樣性較健康者顯著降低。Cattaneo等[9]發(fā)現(xiàn)，輕度認(rèn)知障礙患者體內(nèi)變形菌門豐度增加。以上研究表明，認(rèn)知障礙患者腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，認(rèn)知障礙組早產(chǎn)大鼠腸道菌群豐富度及多樣性下降，擬桿菌門及厚壁菌門這兩種優(yōu)勢菌門豐度降低，變形菌門豐度明顯增加，同樣提示認(rèn)知障礙大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，表明腸道菌群結(jié)構(gòu)改變可能是早產(chǎn)合并認(rèn)知障礙的重要原因。

腸道中乳桿菌及擬桿菌與認(rèn)知功能障礙關(guān)系密切。Yu等[10]發(fā)現(xiàn)，抑郁癥模型大鼠乳桿菌水平相對豐度較低；Saji等[11]發(fā)現(xiàn)，認(rèn)知功能障礙患者擬桿菌水平較低。本研究對腸道菌群分析，同樣發(fā)現(xiàn)認(rèn)知障礙組早產(chǎn)大鼠腸道擬桿菌目及乳桿菌屬豐度明顯減低。妊娠20周至產(chǎn)后3歲為腦發(fā)育關(guān)鍵期，而腸道菌群的定植也發(fā)生在該關(guān)鍵窗口期。在該窗口期內(nèi)，若腸道菌群紊亂，短期有感染增加和炎癥進(jìn)程延長風(fēng)險，長期可導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育異常。

腸道菌群產(chǎn)生的短鏈脂肪酸對大腦功能和行為有顯著影響。小膠質(zhì)細(xì)胞在大腦發(fā)育、可塑性和認(rèn)知方面起關(guān)鍵作用。Erny等[12]研究顯示，短鏈脂肪酸能促進(jìn)大腦小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育，影響少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞分化和髓鞘形成。在無菌模型小鼠中[12]，短鏈脂肪酸受體缺失，大腦小膠質(zhì)細(xì)胞整體缺陷，提示短鏈脂肪酸是調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞成熟和功能的關(guān)鍵分子。此外，血腦屏障形成也與短鏈脂肪酸有關(guān)[13]，由細(xì)菌產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可降低血腦屏障通透性。給無菌小鼠補(bǔ)充可產(chǎn)生短鏈脂肪酸的細(xì)菌，小鼠血腦屏障恢復(fù)正常，提示調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸含量，就有可能維持血腦屏障功能[13]。本研究中，認(rèn)知障礙組總短鏈脂肪酸水平與乙酸水平明顯低于對照組，也表明短鏈脂肪酸減少對大腦認(rèn)知功能形成產(chǎn)生影響。

乳桿菌與擬桿菌是常見的產(chǎn)乙酸菌。研究表明，口服乳酸桿菌12周可明顯改善認(rèn)知功能[14]。阿爾茨海默病模型小鼠的糞便和腦組織短鏈脂肪酸含量降低，而通過口服乙酸鹽能改善小鼠腦神經(jīng)損傷及認(rèn)知功能障礙[15]。由此提示，總短鏈脂肪酸及乙酸含量下降可能會導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，且總短鏈脂肪酸及乙酸濃度降低可能與乳桿菌降低有關(guān)[16]。本研究分析發(fā)現(xiàn)，乙酸與擬桿菌目、乳桿菌屬呈一定正相關(guān)性，提示早產(chǎn)合并認(rèn)知障礙大鼠腸道內(nèi)乙酸含量下降可能與擬桿菌目、乳桿菌屬含量下降有關(guān)。擬桿菌目、乳桿菌屬水平下降所導(dǎo)致的總短鏈脂肪酸及乙酸水平下降可能導(dǎo)致早產(chǎn)合并認(rèn)知障礙。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠自閉癥樣行為可由腦室內(nèi)高濃度丙酸引起[17]。Liu等[3]研究發(fā)現(xiàn)，自閉癥患兒糞便中丁酸含量較低。本研究中，認(rèn)知障礙組丙酸與丁酸含量與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，表明丙酸及丁酸改變是否與早產(chǎn)后認(rèn)知障礙有關(guān)尚需進(jìn)一步研究。本研究建立于動物模型，短鏈脂肪酸是否造成人類早產(chǎn)合并認(rèn)知障礙，需要進(jìn)一步的人體試驗論證。此外，本實驗缺乏糞群移植等干預(yù)手段；未來研究可增加干預(yù)手段，多角度觀察論證菌群及其代謝產(chǎn)物與早產(chǎn)認(rèn)知障礙的關(guān)系。

綜上所述，早產(chǎn)認(rèn)知障礙大鼠的腸道菌群特征為變形菌門富集與擬桿菌目、乳桿菌屬含量降低。其擬桿菌目及乳桿菌屬低豐度所致總短鏈脂肪酸與乙酸下降可能導(dǎo)致早產(chǎn)合并認(rèn)知功能障礙。