外周血PCA3基因mRNA檢測診斷前列腺癌臨床應(yīng)用價值

湯山松 楊 霞

四川省資陽市人民醫(yī)院腫瘤科 641300

目前，PC常用的篩查方法為血清前列腺特異抗原檢查，但其體內(nèi)水平個體差異較大。因此確定其診斷PC的cutt-off值較為困難且臨床應(yīng)用特異性較低。PCA3為新近鑒定的在PC患者中特異高表達(dá)的癌基因[1]。有研究顯示，與正常人群相比，PCA3 mRNA在PC患者中表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著升高[2-3]。因此，本研究探討外周血中PCA3 mRNA水平在PC診斷中的可行性，及其作為生物標(biāo)志物的應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1 對象來源 選取2016年2月—2020年4月我院收治的確診PC患者24例(病例組)和良性前列腺增生(BPH)40例及泌尿系結(jié)石患者13例(對照組)作為研究對象。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡>50周歲；獲取患者標(biāo)本前均需要簽署知情同意書；病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實PC、BPH或泌尿系結(jié)石；PC患者為初診且既往未接受過治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者無細(xì)胞學(xué)或病理學(xué)診斷；合并性傳播疾??；合并有其他系統(tǒng)惡性腫瘤；HIV陽性患者均予以排除。

1.2 試劑與儀器 Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV(購自大連寶生物，TAKARA公司)，核酶抑制劑RNAsin，dNTP，DEPC水(購自Tiangen公司)，PCR引物合成(由華大基因完成)，Taq酶，EX TaqTMR-PCR(購自大連寶生物，TAKARA公司)，實時熒光定量PCR儀(購自ABI公司)， 高速離心機(jī)(購自美國Beckman公司)，紫外凝膠成像系統(tǒng)(購自美國BIO-RAD公司)。

1.3 標(biāo)本采集與處理 患者確診后，抽取靜脈血3ml，置入乙二胺四乙酸抗凝的采血管中，并向采血管中加入Trizol試劑吹打混勻，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實驗方法

1.4.1 總RNA提取：Trizol法提取總RNA[4]，取預(yù)先收集的外周血0.5ml置于無酶EP管中，向EP管中加入1ml Trizol，渦旋30s，26℃靜止6min，低溫高速離心(12 000r/min)，離心10min。吸取上層無色澄清液體置入另一無酶EP管中并加入200μl氯仿，劇烈震蕩10s，然后26℃放置5min，低溫高速離心(12 000r/min)，離心10min。轉(zhuǎn)移上次液體至另一離心管中并加入600μl異丙醇，充分震蕩后靜置10min。后低溫高速離心(12 000r/min)，離心10min。然后棄去上層清夜，保留EP管地步沉淀并加入1 000μl 75%的乙醇，充分混勻后8 000r/min，低溫離心4min。棄去上清，晾干后置于-80℃冰箱中保存。

1.4.2 實時熒光定量PCR反應(yīng)：根據(jù)ABIPRISM 7900HT Fast Real-time PCR 儀器說明進(jìn)行操作。PCA3基因上游引物5’-AGAAGCTGG CATCAGAAAAA-3’下游引物3’-TCCTGCCCATCCTTTAAGG-5’，反應(yīng)體系見表1。

表1 PCA3基因Real-time PCR反應(yīng)體系

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 PCA3 mRNA表達(dá)量計算，ΔCT=CTpca3-CTβ-actinPCA3mRNA相對表達(dá)量=2-ΔCT×10。 Stata 12.0統(tǒng)計軟件繪制ROC曲線，并根據(jù)敏感性和特異性的最佳組合判斷cutt-off值，并給出相應(yīng)的該臨界值下診斷PC的敏感性和特異性，計算AUC，檢驗效能為α=0.05。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCA3 mRNA表達(dá)水平 PC、BPH及泌尿系結(jié)石患者PCA3 mRNA水平分別為62.7±29.8、8.9±6.4和4.1±2.2，PC組顯著高于其他兩組患者(P<0.05)，見圖1。

圖1 三組患者1PCA3基因mRNA表達(dá)水平比較

2.2 PCA3mRNA檢測診斷前列腺癌的價值 根據(jù)貝葉斯定理繪制ROC曲線并計算曲線下面積AUC=0.94，確定cut-off值為16.2，該cut-off值下診斷PC的敏感性為78.8%，特異性為95.8%，見圖2。

圖2 PCA3基因診斷前列腺癌的ROC曲線圖

3 討論

在西方國家PC的發(fā)病率較高，2013年美國PC新發(fā)病例為238 590例，PC發(fā)病率約占全身惡性腫瘤的28%，為發(fā)病率最高的惡性腫瘤，死亡人數(shù)為29 720例，占惡性腫瘤死亡人數(shù)的10%，為第二位[5]。與西方國家相比我國等東亞人群PC的發(fā)病率較低，但尚無確切流行病學(xué)數(shù)據(jù)[6]。臨床上，對PC高危人群進(jìn)行篩查，早期發(fā)現(xiàn)腫瘤性病變是提高PC預(yù)后的重要方法[7]。前列腺解剖位置隱秘，臨床查體及影像學(xué)檢查等不易發(fā)現(xiàn)早期病變。近年來的研究顯示PCA3在PC患者呈現(xiàn)高表達(dá)，而在良性前列腺增生及正常人群中表達(dá)水平較低[8-9]，因此，PCA3有可能成為早期篩查PC的腫瘤標(biāo)志物。PCA3基因是由約翰霍普金斯醫(yī)院的Baltimore和Nijmegen 共同發(fā)現(xiàn)的，該基因定位于人9號染色體21-22區(qū)全長約25kb，該基因由4個exon和3個introns組成[10]。國外文獻(xiàn)報道，PCA3基因mRNA在PC組織中拷貝數(shù)顯著上升[2]，同時亦有文獻(xiàn)報道，PC患者體液標(biāo)本同樣可以檢測到拷貝數(shù)增加的mRNA水平[11]。這樣的結(jié)果提示，PCA3基因有可能成為診斷PC的生物學(xué)標(biāo)志物。PCA3基因在PC與BPH患者體內(nèi)呈現(xiàn)差異性表達(dá)，為其成為診斷PC的生物學(xué)標(biāo)志物提供了可能；其次，在外周血或尿液中這種差異表達(dá)仍能檢測到，為采用微創(chuàng)或無創(chuàng)的方法篩查PC提供了方便條件。

國內(nèi)劉龍亞等人[12]采用qPCR方法檢測PC及BPH患者外周血及前列腺按摩液中的PCA3基因表達(dá)水平，研究結(jié)果提示，PC患者外周血及前列腺液中PCA3表達(dá)水平顯著高于BPH患者，采用PCA3作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，其診斷PC的敏感性為86.5%。在本研究中，PC組患者PCA3 mRNA表達(dá)水平顯著高于其他兩組患者(P<0.05)。根據(jù)貝葉斯定理計算的ROC曲線下面積AUC=0.94，cut-off值為16.2，該cut-off值下診斷PC的敏感性為78.8%，特異性為95.8%。提示PCA3基因mRNA檢測可作為PC患者有效診斷方法。

綜上所述，檢測PC高危人群外周血中PCA3 mRNA表達(dá)為篩查PC提供了可行性方法，其診斷的敏感性和特異性均較高。但本研究納入患者例數(shù)較少，且為單中心的臨床研究，同時各組人群納入及實驗過程中均未采用盲法，因而實驗結(jié)果可能受到信息偏倚等因素的影響。因此，在實驗條件、經(jīng)濟(jì)條件允許的大型醫(yī)療中心應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行多中心的前瞻性臨床研究，為PCA3檢測作為PC篩查的腫瘤標(biāo)志物提供更為充分的臨床依據(jù)。