植物原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁研究進(jìn)展

楊 穎，康 蘭，耿 新，陳玉珍，盧存福

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083）

0 引言

細(xì)胞壁是植物細(xì)胞的重要特征，若沒有細(xì)胞壁，植物將是一堆柔韌的原生質(zhì)體[1]。同時(shí)，作為植物區(qū)別于動(dòng)物的一個(gè)進(jìn)化特征，細(xì)胞壁形成和調(diào)控的分子機(jī)制一直是有待研究的基礎(chǔ)科學(xué)問題。2005年，《Science》在其創(chuàng)刊125周年時(shí)就提出把“植物如何形成細(xì)胞壁”作為接下來25年需要解決的重要科學(xué)問題之一[2]。

植物細(xì)胞在去除細(xì)胞壁后能迅速地重新合成新的細(xì)胞壁[3-4]，因此植物原生質(zhì)體是研究細(xì)胞壁再生的良好材料[5-6]。過去對植物細(xì)胞壁的研究多從生化角度出發(fā)，主要集中在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與功能、化學(xué)組分和物理特性及應(yīng)用上[7-9]。從細(xì)胞學(xué)的角度更能整體把控細(xì)胞壁代謝的全過程，原生質(zhì)體為單細(xì)胞且具有全能性，非常適合用于研究植物生物學(xué)的基本問題，如膜生理學(xué)、細(xì)胞壁代謝和應(yīng)激反應(yīng)[10-11]。細(xì)胞壁的生物合成是非常動(dòng)態(tài)、復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)，借助原生質(zhì)體可再生壁這一特性，人們逐漸揭開了細(xì)胞壁合成的面紗[11]。1967年，Pojnar等[12]利用光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡觀察到番茄果實(shí)原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生過程。之后越來越多物種的原生質(zhì)體經(jīng)培養(yǎng)觀察到新生細(xì)胞壁，推動(dòng)了可視化細(xì)胞壁再生動(dòng)力學(xué)研究的發(fā)展。每個(gè)植物基因組都包含數(shù)千個(gè)與細(xì)胞壁形成相關(guān)的基因[13-15]，隨著第二、三代測序技術(shù)的興起，原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁的過程結(jié)合組學(xué)成為新的研究方向，可解釋原先無法解釋的植物細(xì)胞壁形成的機(jī)理和調(diào)控的分子機(jī)制，并鑒定出細(xì)胞壁合成關(guān)鍵基因[16]，為后續(xù)基因功能特性分析奠定基礎(chǔ)。因此，研究原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁，將有助于更加深入地了解細(xì)胞壁合成及修飾的過程，對于定向改良細(xì)胞壁、指導(dǎo)林木培育、發(fā)展生物能源均具有重要意義。

1 原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁培養(yǎng)

1.1 原生質(zhì)體再生壁材料的選擇

一般來說，單子葉植物例如水稻、玉米、小麥的原生質(zhì)體再生壁過程較雙子葉植物更為困難，所以取材上也更加精細(xì)。對于單子葉植株，選取幼嫩的葉片及根部游離原生質(zhì)體很難再生出細(xì)胞壁，研究者開始選擇分裂能力強(qiáng)、生長旺盛的組織如分生組織用來再生植株，后續(xù)逐漸選用胚性愈傷、懸浮細(xì)胞系等作為實(shí)驗(yàn)材料，并成為主流。例如Mujahid等[17]利用水稻懸浮細(xì)胞系(NB2P cells)成功培養(yǎng)得到水稻原生質(zhì)體再生的細(xì)胞壁，并利用新生壁為后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組相關(guān)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。岳晉軍[18]同樣選取毛竹胚性懸浮細(xì)胞構(gòu)建毛竹原生質(zhì)體再生體系，再生效率最高。但選用胚性愈傷、懸浮細(xì)胞系也存在弊端，因?yàn)閼腋∨囵B(yǎng)的建立和維持往往費(fèi)時(shí)費(fèi)力，從而增大研究成本。雙子葉植物的原生質(zhì)體再生較為簡單，一般選取幼嫩葉片即可獲得原生質(zhì)體的再生壁。番石榴[19]、擬南芥[20]、矮牽牛[21]、豆科植物[22]均可利用幼嫩的葉片游離原生質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞壁再生。與雙子葉植物等維管植物相比，苔蘚植物和蕨類植物具有相對簡單的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因此細(xì)胞壁再生過程更加容易[23-24]。

1.2 培養(yǎng)基的選擇

植物原生質(zhì)體經(jīng)提取、純化的步驟后進(jìn)入培養(yǎng)階段。盡管Pilet等[25]在1984年提出植物原生質(zhì)體不能再生出正常的細(xì)胞壁，但之后又有報(bào)道表明其在合適的培養(yǎng)基中也可生成正常的細(xì)胞壁[24]。因此不同物種的培養(yǎng)基可能存在差異，選擇合適的培養(yǎng)基十分關(guān)鍵。使用頻率較高的基本培養(yǎng)基為MS、KM8P、B5，培養(yǎng)基中常輔以碳源、滲透壓穩(wěn)定劑、少量植物激素和小分子營養(yǎng)素等[26]。其中，KM8P培養(yǎng)基營養(yǎng)最豐富，接受度最高，影響最為廣泛。

KM8P培養(yǎng)基最早是由Kao and Michayluk于1975年提出，它使蠶豆原生質(zhì)體細(xì)胞能夠以極低的初始種群密度（25～50個(gè)細(xì)胞/mL）生長，同時(shí)證明了單個(gè)原生質(zhì)體能夠形成細(xì)胞壁[27]。首次闡明添加氨基酸和椰子水能夠幫助原生質(zhì)體細(xì)胞在低密度條件下存活，因其提供了許多代謝的中間產(chǎn)物，同時(shí)具有解毒作用。

但并非所有的物種都適用于KM8P培養(yǎng)基，多數(shù)研究者會(huì)根據(jù)自己的材料以及研究意圖選擇最為合適的培養(yǎng)基。作為典型的單子葉植物，毛竹懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體培養(yǎng)采用以MS為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基，并添加各類維生素及氨基酸等增加原生質(zhì)體活性[18]。作為雙子葉植物的草香豌豆和黃羽扇豆則不需要過于豐富的培養(yǎng)基，Wiszniewska等[22]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基越豐富，原生質(zhì)體保持活性的能力越差，他們改良原有AS培養(yǎng)基，加速了原生質(zhì)體表面纖維素的合成。因此，對于剛失去細(xì)胞壁保護(hù)的原生質(zhì)體來說，選擇合適的培養(yǎng)基對長出新生細(xì)胞壁至關(guān)重要，并且一般來說單子葉植物較雙子葉植物再生壁過程困難，所以單子葉植物的培養(yǎng)基更加豐富。

1.3 培養(yǎng)方式的選擇

原生質(zhì)體培養(yǎng)存在多種新舊方式，因不涉及后續(xù)細(xì)胞團(tuán)生成和植株再生，原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁培養(yǎng)通常選用液體淺層培養(yǎng)(liquid thin culture)。Wiszniewska等[22]在直徑為4 cm的塑料培養(yǎng)皿里使用液體淺層培養(yǎng)的方法，成功再生出豆類植物原生質(zhì)體細(xì)胞壁。相較于固體培養(yǎng)或固液結(jié)合培養(yǎng)，液體淺層培養(yǎng)方法簡單、損害小，對于再生細(xì)胞壁這一階段十分適用。但是這種方法也存在不足，如原生質(zhì)體分布不均，長壁的原生質(zhì)體易粘黏成細(xì)胞團(tuán)，不利于觀察單個(gè)細(xì)胞且影響進(jìn)一步的細(xì)胞壁發(fā)育等。

原生質(zhì)體植板密度也影響著其存活率。密度過高時(shí)，由于缺乏營養(yǎng)元素或有害的代謝中間產(chǎn)物增多，原生質(zhì)體無法正常生長；密度過低時(shí)，不利于尋找長出細(xì)胞壁的原生質(zhì)體。在原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁這一階段，植板密度一般控制在1×105個(gè)/mL較為適宜。

因此，培養(yǎng)條件的好壞決定直接影響著原生質(zhì)體的存活率，它作為關(guān)鍵的一環(huán)甚至決定整個(gè)實(shí)驗(yàn)的成敗。為高效再生出原生質(zhì)體新生細(xì)胞壁，應(yīng)注意以下幾個(gè)方面：（1）根據(jù)前人研究，多嘗試幾種培養(yǎng)基，不同的物種對培養(yǎng)基的營養(yǎng)程度喜好不一；（2）原生質(zhì)體十分脆弱，操作過程中應(yīng)盡量減少機(jī)械性損傷；（3）若原生質(zhì)體長時(shí)間沒有長壁，還應(yīng)考慮取材部位是否正確。

2 細(xì)胞壁再生的細(xì)胞生物學(xué)證據(jù)

原生質(zhì)體再生的細(xì)胞壁在普通光學(xué)或相差顯微鏡下無法得以觀察，所以需利用化學(xué)染料與細(xì)胞壁中的物質(zhì)結(jié)合，再借助熒光顯微鏡才能判斷細(xì)胞壁生成與否。熒光增白劑卡式白(Calcofluor White)自1970年發(fā)現(xiàn)可使細(xì)胞壁在熒光顯微鏡紫外光下呈藍(lán)色[28]，直至現(xiàn)在仍是主流應(yīng)用于細(xì)胞壁可視化的經(jīng)典染料。這種熒光染料對纖維素和幾丁質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，很多物種的原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生實(shí)驗(yàn)均使用了該染料檢測。盡管卡式白染料染色過程簡單、快速，但它對纖維素微纖絲的特異性不強(qiáng)且對活細(xì)胞有毒害作用。近年來，Pontamine Fast Scarlet 4 BS這種新型細(xì)胞壁染料興起，它對纖維素微纖絲有很高的特異性，與卡式白染料相比，其最大的優(yōu)勢在于可使活細(xì)胞染色[29-32]，更有利于活體原生質(zhì)體的實(shí)時(shí)檢測，便于得到立體的細(xì)胞壁再生圖。

通過歷代科研工作者的努力，人們對原生質(zhì)體再生壁的觀察不再局限在二維層面，而是從三維立體的角度研究再生過程中纖維素微纖絲沉積規(guī)律。Kuki等[33]將傳統(tǒng)的纖維素染色技術(shù)與圖像分析相結(jié)合，設(shè)計(jì)出一種新的成像技術(shù)來定量評估擬南芥花葉原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生過程中的纖維素網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖1[33]）。三維成像的方式打破了人們對細(xì)胞壁固有的認(rèn)知，細(xì)胞壁的纖維素微纖絲的總長度、分布的密度和平均角度等關(guān)鍵指標(biāo)都可用此方式生動(dòng)地呈現(xiàn)出來，可直接觀察到擬南芥原生質(zhì)體再生的早期階段表現(xiàn)為纖維素微纖絲的隨機(jī)取向，隨后是部分纖維素微纖絲的定向沉積最后才是有序的纖維素沉積。不僅如此，細(xì)胞壁可視化的應(yīng)用使人們更加形象、立體、全面地觀察到原生質(zhì)體新生壁。因每種植物細(xì)胞壁纖維素微纖絲累積模式不盡相同[34-37]，該技術(shù)除了可以比較再生過程中細(xì)胞壁的變化，還可為不同植物細(xì)胞壁動(dòng)力學(xué)的顯著差異提供新的見解。

圖1 原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生的時(shí)間進(jìn)程

3 組學(xué)技術(shù)研究原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁的細(xì)胞分子生物學(xué)過程

細(xì)胞壁再生相關(guān)蛋白約占細(xì)胞壁質(zhì)量的10%，通常由大的基因家族編碼[38-39]，這些蛋白質(zhì)在維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能多樣性上發(fā)揮重要作用。但是目前為止，仍存在大量未被挖掘出來的細(xì)胞壁蛋白，因此在原生質(zhì)體單細(xì)胞的基礎(chǔ)上，結(jié)合多種組學(xué)的系統(tǒng)研究方法[40]，已成為人們深入了解細(xì)胞壁再生分子機(jī)制的新方向。不同的組學(xué)手段適用于解釋原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁分子網(wǎng)絡(luò)的不同層面，可歸納為以下3點(diǎn)。

3.1 獲得差異表達(dá)基因

在細(xì)胞壁再生的不同時(shí)間點(diǎn)取樣，通過轉(zhuǎn)錄組或蛋白組獲得再生壁過程中各階段的差異表達(dá)基因，分析篩選出關(guān)鍵基因，構(gòu)建細(xì)胞壁再生模型。2005年Kwon等[41]通過比較細(xì)胞壁再生0、1、3 h后擬南芥原生質(zhì)體的蛋白組變化情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁再生1 h內(nèi)，AtXTH11(At3g48580)、AtXYL1(At1g68560)等蛋白便開始合成細(xì)胞壁再生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)纖維素/木葡聚糖網(wǎng)絡(luò)。Yang等[42]利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，根據(jù)棉花細(xì)胞壁再生的不同時(shí)期，把上調(diào)表達(dá)的210基因標(biāo)簽分成細(xì)胞壁再 生 前 期 (TIP、EXLA2、BIK1)、中 期 (PRP、GRP、ANAC016)、后 期 (CIPK9、FLA2、SUS2)、整 個(gè) 階 段(SMADC)4類。由此可見，植物細(xì)胞壁分子網(wǎng)絡(luò)已初具雛形，為單基因功能驗(yàn)證以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑鑒定奠定了基礎(chǔ)。

3.2 細(xì)胞壁再生與細(xì)胞內(nèi)部的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

目前，組學(xué)技術(shù)已深入至亞細(xì)胞水平，有助于系統(tǒng)深入地了解細(xì)胞器與細(xì)胞壁再生的內(nèi)部響應(yīng)機(jī)理。眾所周知，細(xì)胞壁的酶解對植物細(xì)胞而言屬于外界的脅迫刺激，因此細(xì)胞核會(huì)對該刺激觸發(fā)響應(yīng)機(jī)制，從而參與細(xì)胞壁再生的分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。有研究利用核蛋白組學(xué)技術(shù)證實(shí)水稻細(xì)胞壁去除后染色質(zhì)中組蛋白H3K23高度乙?；M蛋白變體如H3.3等表達(dá)量降低。但隨著細(xì)胞壁的再生，H3K23乙酰化程度立即下降，組蛋白變體表達(dá)量上調(diào)[43]。由于高爾基體在植物中主要參與細(xì)胞壁中多糖的合成、蛋白質(zhì)糖基化和囊泡形成，與細(xì)胞壁再生息息相關(guān)[44]。Parsons等[45]根據(jù)擬南芥高爾基體蛋白組發(fā)現(xiàn)，GNT1(AT4G38240.1)、XYLT(AT5G55500.1)和 FUT12(AT1G49710.1)主要參與的N-糖基化途徑和GT65參與的O-巖藻糖基化途徑在細(xì)胞壁合成中發(fā)揮重要作用。以上研究表明細(xì)胞壁再生過程是一個(gè)復(fù)雜的生命活動(dòng)，需要多種細(xì)胞器配合完成，但目前其他細(xì)胞器對細(xì)胞壁合成的分子機(jī)制是否有響應(yīng)尚未明確。

3.3 細(xì)胞壁再生網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控樞紐-磷酸化修飾

磷酸化作為一種最常見的翻譯后修飾，具有重要的調(diào)節(jié)作用。2014年，Wang等[46]對小立碗蘚原生質(zhì)體再生的磷蛋白組進(jìn)行了綜合分析（圖2[46]），鑒定出108個(gè)磷酸化蛋白可能參與調(diào)控細(xì)胞壁生成、細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化、細(xì)胞增生和分化、器官發(fā)生和發(fā)育調(diào)節(jié)。雖然該團(tuán)隊(duì)構(gòu)建出了小立碗蘚原生質(zhì)體再生的磷酸化蛋白代謝網(wǎng)絡(luò)，但并未從分子層面解釋蛋白質(zhì)的互作關(guān)系。后來，劉玉薇和王曉琴[47]在Wang等研究的基礎(chǔ)上構(gòu)建了小立碗蘚原生質(zhì)體再生的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子AGL21磷酸化可與20個(gè)蛋白發(fā)生互作，促進(jìn)植物的生長發(fā)育；VIP4可與VIP3和ELF8蛋白發(fā)生互作，其中ELF8還和組蛋白甲基化有關(guān)，同時(shí)表明細(xì)胞核與細(xì)胞壁再生密切相關(guān)。組學(xué)技術(shù)隨時(shí)間不斷發(fā)展，磷蛋白組的應(yīng)用加深了人們對蛋白相互作用的理解，為進(jìn)一步闡明原生質(zhì)體再生過程的分子調(diào)控機(jī)制提供了理論依據(jù)。

圖2 裸藻原生質(zhì)體再生過程的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與細(xì)胞反應(yīng)

4 展望

近十幾年來，培養(yǎng)技術(shù)的更新及新技術(shù)的應(yīng)用使得植物原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生方面的研究取得了長足的進(jìn)展。細(xì)胞壁再生過程中涉及諸多生理生化反應(yīng)，雖然可通過基因組、蛋白組構(gòu)建出細(xì)胞壁再生的分子網(wǎng)絡(luò)，但對于細(xì)胞壁再生機(jī)理尚處于淺層次認(rèn)識(shí)的階段，可從以下3個(gè)方面進(jìn)一步深入研究：（1）分析得到的關(guān)鍵蛋白如何指導(dǎo)細(xì)胞壁的發(fā)生、修飾以及它們之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的構(gòu)建仍不清晰；（2）原生質(zhì)體中細(xì)胞壁的再合成和胞質(zhì)分裂過程中新細(xì)胞壁的合成是否遵循相同的調(diào)控機(jī)制并使用相同的一組催化酶；（3）影響原生質(zhì)體再生的因素很多，細(xì)胞內(nèi)部中存在多種細(xì)胞器及細(xì)胞骨架共同指導(dǎo)完成細(xì)胞壁再生，目前只有高爾基體、細(xì)胞膜、細(xì)胞核證實(shí)與細(xì)胞壁再生有關(guān)，但其所描述的分子網(wǎng)絡(luò)尚未完善。已有研究表明，外部環(huán)境有多種脅迫應(yīng)激影響細(xì)胞壁合成，例如冷、熱、重金屬脅迫等[48-49]，甚至太空中的微重力環(huán)境也會(huì)抑制原生質(zhì)體的細(xì)胞壁再生能力[50]，而外部環(huán)境如何刺激影響細(xì)胞壁再生，也是值得研究的問題。