胰腺癌血漿循環(huán)游離DNA甲基化預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建及應(yīng)用

陳 旻，黃一鳴，趙 暉，康亞妮

胰腺癌是高度致死性的惡性腫瘤，是目前第4大癌癥死亡原因[1]，90%以上為胰腺導(dǎo)管腺癌[2]。由于超過75%的胰腺癌患者確診時(shí)已處于晚期階段[3]，因此僅10%～20%患者有機(jī)會(huì)接受手術(shù)治療[4]。即便如此，在接受手術(shù)治療的胰腺癌患者中，仍有50%的患者在18個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)[5-6]，因此胰腺癌患者5年生存率僅為9%[1]。所以，早期診斷胰腺癌能夠有效提高胰腺癌患者的生存率[7]。

基于循環(huán)游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）的液體活檢技術(shù)通過檢測(cè)腫瘤患者體液中腫瘤組織釋放的成分以實(shí)現(xiàn)腫瘤診斷，在腫瘤的早期診斷中顯示出很好的應(yīng)用前景。相較于目前常規(guī)的腫瘤檢測(cè)技術(shù)，液體活檢具有微創(chuàng)、負(fù)擔(dān)小、敏感度高[8]以及結(jié)果更為全面[9]等優(yōu)勢(shì)。DNA甲基化作為一種穩(wěn)定的腫瘤早期變化事件，具有很強(qiáng)的組織穩(wěn)定性和不同的個(gè)體保守性[9]，因此很適合作為有效的腫瘤早期標(biāo)志物，以實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷?；赾fDNA甲基化的液體活檢技術(shù)在實(shí)現(xiàn)胰腺癌早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)方面顯示出一定的潛力。

本研究采用胰腺癌患者和健康人群血漿cfDNA樣本，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)中胰腺癌與癌旁組織的甲基化450K數(shù)據(jù)，聯(lián)合篩選獲得胰腺癌血漿cfDNA甲基化候選標(biāo)志物，構(gòu)建胰腺癌的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)模型。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本和材料

胰腺癌患者和健康人群的5份血漿樣本由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院提供；QIAamp循環(huán)核酸試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；KAPA Hyper Prep試劑盒購(gòu)自KAPA Biosystems公司；5-甲基胞嘧啶單克隆抗體購(gòu)自EpiGentek公司；Q5高保真DNA聚合酶購(gòu)自New England Biolabs公司。

1.2 方法

1.2.1 血漿樣本收集

收集胰腺癌患者血漿樣本3份以及健康人群血漿樣本2份，所有患者均簽署知情同意書，并獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2.2 血漿cfDNA提取

在手術(shù)和藥物治療之前，使用EDTA抗凝管收集5 mL外周血。在采集后6 h內(nèi)，1 500×g離心15 min以純化血漿。使用QIAamp循環(huán)核酸試劑盒從800 μL血漿中提取cfDNA，應(yīng)用2100 Bioanalyzer系統(tǒng)（購(gòu)自Agilent Technologies公司）進(jìn)行定量。

1.2.3 MeDIP-seq建庫(kù)和測(cè)序

使用KAPA Hyper Prep試劑盒，將約20 ng cfDNA與Illumina接頭相連接。構(gòu)建的cfDNA文庫(kù)與95 ℃變性10 min。使用5-甲基胞嘧啶單克隆抗體，使甲基化cfDNA從文庫(kù)中免疫沉淀。使用Q5高保真DNA聚合酶進(jìn)一步擴(kuò)增MeDIP DNA。采用2100 Bioanalyzer系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，擴(kuò)增文庫(kù)由Illumina HiSeq 2000平臺(tái)進(jìn)行深度測(cè)序。

1.2.4 血漿cfDNA原始數(shù)據(jù)的處理與差異甲基化區(qū)域（differential methylation regions，DMRs）篩選

使 用Trim_Galore（0.4.3版 本）去 除Illumina接頭，Cutadapt（1.8.3版本）切除低質(zhì)量序列。采用Bowtie2軟件（2.1.0版本）將處理后的序列比對(duì)到人類參考基因組GRCh38/hg38（UCSC）。比對(duì)完成后，通過SAMtools（1.3.1版本）過濾唯一比對(duì)序列，并通過Picard（1.2版本）去除重復(fù)序列。最后，應(yīng)用MACS2軟件（2.1.0版本）對(duì)序列進(jìn)行校峰。預(yù)處理完成后，應(yīng)用DiffBind R軟件包（2.8.0版本）篩選胰腺癌患者與健康人群之間的DMRs（P＜0.05，log|FC|＞1）。對(duì)篩選獲得的DMRs，應(yīng)用ChIPseeker R軟件包（1.5.1版本）進(jìn)行注釋，進(jìn)一步篩選出其中位于基因啟動(dòng)子區(qū)的DMRs用于后續(xù)分析。

1.2.5 胰腺癌與癌旁組織甲基化450K數(shù)據(jù)的獲取與差異甲基化位點(diǎn)（differential methylation positions，DMPs）的篩選

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取胰腺癌與癌旁組織樣本的甲基化450K數(shù)據(jù)（GSE49149），共獲得胰腺癌組織樣本155個(gè)，癌旁組織樣本19個(gè)。應(yīng)用ChAMP R軟件包（2.18.3版本）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和預(yù)處理，并且篩選出DMPs（P＜0.05，|Δβ|＞0.2）。選擇位于啟動(dòng)子區(qū)域的DMPs用于后續(xù)分析。

1.2.6 胰腺癌血漿cfDNA與胰腺癌組織甲基化狀態(tài)的聯(lián)合分析及模型的建立

篩選出位于啟動(dòng)子區(qū)域且與DMRs擁有相同靶基因和甲基化差異趨勢(shì)的DMPs，將這些DMPs作為胰腺癌血漿cfDNA甲基化候選位點(diǎn)用于模型的構(gòu)建。將GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的胰腺癌與癌旁組織的甲基化450K數(shù)據(jù)按1：1分為訓(xùn)練集與測(cè)試集，在訓(xùn)練集中進(jìn)行模型的構(gòu)建。采用500次Lasso算法進(jìn)一步縮減候選位點(diǎn)，選取在500次Lasso算法中出現(xiàn)500次的位點(diǎn)作為具有顯著診斷能力的位點(diǎn)。從CFEA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取14組健康人群的血漿cfDNA甲基化450K數(shù)據(jù)，將其作為血漿背景的依據(jù)，排除選擇的位點(diǎn)中血漿背景干擾較大的位點(diǎn)，采用余下的位點(diǎn)，在訓(xùn)練集中采用Lasso算法構(gòu)建胰腺癌模型。

1.2.7 胰腺癌模型的診斷性能與預(yù)后性能的評(píng)估

《意見》堅(jiān)持市場(chǎng)主導(dǎo)、政府引導(dǎo)、精準(zhǔn)施策的基本原則，以供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革為主線，提出了推動(dòng)綠色餐飲發(fā)展的主要任務(wù)：一是健全綠色餐飲標(biāo)準(zhǔn)體系，二是構(gòu)建大眾化綠色餐飲服務(wù)體系，三是促進(jìn)綠色餐飲產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，四是培育綠色餐飲主體，五是倡導(dǎo)綠色發(fā)展理念。

通過繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC），計(jì)算特異度和敏感度以評(píng)估模型的診斷效能。除了使用訓(xùn)練集和測(cè)試集評(píng)估模型的效能以外，為防止模型產(chǎn)生過擬合，另從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取一組臨床信息齊全的胰腺癌與癌旁組織甲基化450K樣本，包括184個(gè)胰腺癌組織樣本和10個(gè)癌旁組織樣本，作為獨(dú)立測(cè)試集評(píng)估模型的診斷效能。通過繪制Kaplan-Meier法繪制生存曲線以及多重時(shí)間依賴性ROC曲線，在獨(dú)立測(cè)試集中評(píng)估模型的預(yù)后預(yù)測(cè)能力。此外，采用多因素COX回歸分析胰腺癌預(yù)后相關(guān)因素。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理平臺(tái)

本研究的測(cè)序數(shù)據(jù)均采用Linux Mint 17.3 Rosa系統(tǒng)進(jìn)行分析，包括高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)檢、預(yù)處理、比對(duì)、去重和校峰等。下游分析均采用R version 4.0.2軟件，包括差異甲基化分析、模型構(gòu)建和效能評(píng)估等。

2 結(jié)果

2.1 血漿cfDNA中DMRs的篩選結(jié)果

共篩選獲得857個(gè)差異高甲基化區(qū)域和933個(gè)差異低甲基化區(qū)域（圖1A）。經(jīng)過注釋后，發(fā)現(xiàn)共有26.13%的DMRs位于啟動(dòng)子區(qū)（圖1B），其中包括高甲基化區(qū)域225個(gè)和低甲基化區(qū)域243個(gè)。

Fig.1 The results of differential methylation regions (DMRs) analysis of plasma cell-free DNA (cfDNA).A:The heatmap of all DMRs (P＜0.05,|logFC|＞1),in which the blue ones are DMRs hypomethylated in pancreatic cancer patients’ plasma cfDNA and the red ones are DMRs hypermethylated in pancreatic cancer patients’ plasma cfDNA.B:The annotation results of DMRs.圖1 血漿cfDNA差異甲基化分析結(jié)果（A）DMRs（P＜0.05，|logFC|＞1）熱圖和DMRs注釋結(jié)果（B）

2.2 胰腺癌組織和癌旁組織DMPs篩選結(jié)果

從胰腺癌組織和癌旁組織樣本中共篩選獲得7 630個(gè)高甲基化位點(diǎn)以及8 763個(gè)低甲基化位點(diǎn)（圖2）。其中，位于啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化位點(diǎn)2 186個(gè)，低甲基化位點(diǎn)1 190個(gè)。

Fig.2 The volcano plot of all differentially methylated positions (DMPs) (P＜0.05,|Δβ|＞0.2) in pancreatic cancer tissues,where blue dots are those methylation sites hypomethylated in pancreatic cancer tissues,and red dots are those methylation sites hypermethylated in pancreatic cancer tissues.圖2 胰腺癌組織DMPs（P＜0.05，|Δβ|＞0.2）的火山圖

2.3 胰腺癌模型的構(gòu)建

將胰腺癌血漿cfDNA與組織樣本聯(lián)合進(jìn)行分析，共獲得41個(gè)具有潛在診斷與預(yù)后預(yù)測(cè)能力的血漿cfDNA候選甲基化位點(diǎn)。通過500次Lasso迭代算法進(jìn)一步篩選，留下6個(gè)候選位點(diǎn)，包括3個(gè)高甲基化位點(diǎn)（圖3A）和3個(gè)低甲基化位點(diǎn)（圖3B）。對(duì)這6個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行血漿背景干擾的排除，其中甲基化位點(diǎn)cg12951282在胰腺癌組織和健康人群血漿cfDNA中都表現(xiàn)出明顯的低甲基化狀態(tài)，存在明顯的干擾，因此將其排除（圖3D）。使用剩余的5個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行胰腺癌模型的構(gòu)建?；贚asso算法構(gòu)建的胰腺癌模型的基本信息見表1。

Fig.3 Screening results of methylation sites.A:The methylation status of 3 hypermethylated sites.B:The methylation status of 3 hypomethylated sites.C:The methylation status in plasma background of 3 hypermethylated sites.D:The methylation status in plasma background of 3 hypomethylated sites.圖3 甲基化位點(diǎn)的篩選結(jié)果

表1 胰腺癌甲基化分析模型的基本信息Table Basic information of methylation analysis model for pancreatic cancer

2.4 胰腺癌模型診斷效能的評(píng)估結(jié)果

從箱線圖和ROC曲線來看，該診斷模型在訓(xùn)練集和測(cè)試集中都可以很好地鑒別胰腺癌患者與健康人群（圖4）。在訓(xùn)練集中的AUC值為0.998（圖4B），特異度為0.962，敏感度為0.750；在測(cè)試集中的AUC為0.997（圖4D），特異度為0.987，敏感度為0.875。由此可見，該模型具有很好的診斷效能。在獨(dú)立測(cè)試集中，同樣得到令人滿意的結(jié)果，AUC值為0.963（圖4F），特異度為0.900，敏感度為0.788。

Fig.4 The diagnostic performance of pancreatic cancer model in training,test and independent test sets.A:The box plot of model in the training set.B:The receiver operating characteristic (ROC) curve of model in the training set.C:The box plot of model in the test set.D:The ROC curve of model in the test set.E:The box plot of model in the independent test set.F:The ROC curve of model in the independent test set.AUC:Area under the curve.圖4 胰腺癌模型在訓(xùn)練集、測(cè)試集和獨(dú)立測(cè)試集中的診斷效能

2.5 胰腺癌模型對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)效能評(píng)估結(jié)果

Kaplan-Meier曲線顯示，胰腺癌模型可以有效地將胰腺癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組（P＝0.002）（圖5A）。此外，該模型可以較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)胰腺癌患者1、3和5年的生存情況，AUC值分別為0.61、0.71和0.74（圖5B）。多因素COX回歸分析顯示，種族、年齡、性別和腫瘤分期不是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素（P＞0.05，圖6）。

Fig.5 The ability of pancreatic cancer model to predict prognosis in the independent test set.A:The Kaplan-Meier survival curves of the model.B:The time-dependent receiver operating characteristic (ROC)curve of the model.AUC:Area under the curve.

Fig.6 The forest plot of prognostic factors in patients with pancreatic cancer.圖6 胰腺癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)因素的森林圖

3 討論

液體活檢技術(shù)是腫瘤早期檢測(cè)領(lǐng)域最具應(yīng)用前景的技術(shù)之一，可以在微創(chuàng)條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤患者進(jìn)行較為全面的早期篩查。相較于一般的基于基因組特征的液體活檢技術(shù)，基于cfDNA甲基化的篩查方式能夠在更早期鑒別腫瘤患者和健康人群，其表觀遺傳特征也更為普遍和穩(wěn)定[10]。本研究使用胰腺癌患者和健康人群的血漿cfDNA甲基化數(shù)據(jù)，與胰腺癌組織和癌旁組織的甲基化450K數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，構(gòu)建了具有較好的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)能力的模型。

在構(gòu)建模型時(shí)，綜合了胰腺癌患者cfDNA的高甲基化特征和低甲基化特征，更為全面地揭示了胰腺癌患者與健康人群的差異，并且具有更好的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)能力。既往研究在構(gòu)建胰腺癌診斷模型時(shí)，大多數(shù)僅考慮胰腺癌患者cfDNA高甲基化特征，或是僅考慮低甲基化特征。MELNIKOV等[11]的模型基于5個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)的低甲基化，而YI等[12]、HENRIKSEN等[13]和LI等[14]的研究都聚焦于一些基因的高甲基化特征，這可能導(dǎo)致部分特征的丟失，造成診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)能力的不足。同時(shí)，此前的模型大多僅具有診斷或預(yù)測(cè)預(yù)后的能力，而無法同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)胰腺癌患者的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)。本研究構(gòu)建的模型不僅具有理想的診斷效能，還能對(duì)胰腺癌患者的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)，顯著提高了模型的應(yīng)用價(jià)值。

應(yīng)用胰腺癌血漿cfDNA甲基化預(yù)測(cè)模型篩選到5個(gè)胰腺癌血漿cfDNA甲基化位點(diǎn)，分別位于GALNT9、CACNA1H、ADAMTS2、THBS1和KIAA1671基因的啟動(dòng)子區(qū)，其中GALNT9、CACNA1H和ADAMTS2基因的啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化趨勢(shì)，而THBS1和KIAA1671基因的啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)低甲基化趨勢(shì)。在這些基因中，ADAMTS2[15]和THBS1[11]基因在胰腺癌患者中呈現(xiàn)出與既往研報(bào)道的相同的甲基化趨勢(shì)，表明ADAMTS2基因的高甲基化和THBS1基因的低甲基化是胰腺癌的標(biāo)志物之一，而其他基因在胰腺癌甲基化相關(guān)研究中尚未見報(bào)道。

本研究構(gòu)建的模型診斷胰腺癌的敏感度為87.4%，特異度為84.6%，AUC值為0.962。目前臨床上應(yīng)用的胰腺癌生物學(xué)標(biāo)志物是CA19-9。KATHERINE等[16]的研究中，對(duì)胰腺癌患者診斷的敏感度為78.2%，特異度為82.8%，都明顯低于本模型。而癌胚抗原作為一種常用的癌癥生物標(biāo)志物，在胰腺癌患者中的敏感度和特異度也較低，僅為44.2%和84.8%。MELNIKOV等[11]構(gòu)建了5個(gè)基因的低甲基化特征模型，在尚無獨(dú)立測(cè)試集的情況下，區(qū)分胰腺癌患者與健康人群的敏感度和特異度分別僅為76%和59%。YI等[12]發(fā)現(xiàn)了2個(gè)高甲基化標(biāo)志物，診斷胰腺癌的敏感度為81%，特異度為85%。HENRIKSEN等[13]基于8個(gè)基因的高甲基化特征，診斷胰腺癌的敏感度為76%，特異度為83%，但未經(jīng)過測(cè)試集的驗(yàn)證。

綜上所述，本研究構(gòu)建的cfDNA甲基化診斷模型有望提高胰腺癌的診斷效能，其敏感度高于癌胚抗原（44.2%）和CA19-9（78.2%）。該模型在測(cè)試集和獨(dú)立測(cè)試集中均通過驗(yàn)證，顯示出較高的敏感度和適用性。該模型還具有較好的預(yù)后預(yù)測(cè)能力?？傊?，基于cfDNA甲基化的液體活檢技術(shù)可以有效提高胰腺癌的診斷效能，為胰腺癌的早期診斷提供新的思路和理論依據(jù)。