白芨種子萌發(fā)及無(wú)菌苗移栽成活影響因素研究

鄒歡歡，程明圣，鄒 娜

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與藝術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045）

白芨（Bletilla striata（Thunb.）Reichb. f.）為蘭科白芨屬植物，又名地螺絲、刀口藥、連芨草［1］。白芨屬植物是蘭科植物中最具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的類群之一。白芨是我國(guó)常用的中藥材之一，據(jù)《中國(guó)藥典》記載其干燥塊莖可入藥，具有補(bǔ)肺、止血、消腫、生肌等功效［2?3］。有研究表明白芨在抗腫瘤、抗菌等方面作用明顯，還可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)［4?5］。而且白芨莖中還含有較高的白芨膠，具有特殊的黏度特性，可作為增稠劑、混懸劑、保濕劑和助乳化劑等應(yīng)用于化妝品中，可以達(dá)到改善皮膚營(yíng)養(yǎng)、抗氧化抗衰老和美白祛斑的效果［6］。另外在食品、紡織印染、特殊涂料中也可以看到它的身影［7］。

因其極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與藥用價(jià)值，野生白芨資源遭到了大量人工采挖。由于白芨種子微小無(wú)胚乳，只有幾個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的發(fā)育不完全的胚，自然條件下發(fā)芽率極低，再加上白芨生存的生態(tài)環(huán)境遭到破壞，野生資源日益減少［8］。白芨目前已被《中國(guó)植物紅皮書(shū)——稀有瀕危植物》第1冊(cè)收錄，同時(shí)也被寫(xiě)入了《瀕危野生動(dòng)植物國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES）保護(hù)種類［9］。白芨?jìng)鹘y(tǒng)的繁殖方法采用的是分生繁殖，繁殖系數(shù)低，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，而且耗種量大，容易造成種性退化，不宜進(jìn)行大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)［10］。鑒于白芨種子特點(diǎn)，通過(guò)無(wú)菌播種，采用組織培養(yǎng)技術(shù)可以快速繁殖大量種苗，但目前白芨組培快繁體系尚不完善。本研究以白芨種子為外植體材料，對(duì)比不同培養(yǎng)基對(duì)其發(fā)芽的影響，提高白芨種子萌發(fā)率，探究影響試管苗移栽成活的因素，獲得最適宜白芨幼苗生長(zhǎng)的栽培容器規(guī)格和遮蔭處理，提高白芨無(wú)菌苗出瓶移栽成活率，為白芨種苗人工栽培的工廠化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白芨種子采自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉盆景教學(xué)基地，采集成熟而未裂開(kāi)的蒴果為外植體材料，進(jìn)行白芨種子萌發(fā)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的消毒滅菌將采回的白芨蒴果用洗潔精仔細(xì)刷洗表面，洗凈后流水沖洗10 ～20 min。于超凈工作臺(tái)上用70%的乙醇浸泡10 ～30 s，取出材料后用含吐溫?80 的10%次氯酸鈉劇烈振蕩消毒20 min，無(wú)菌水沖洗6 遍，濾紙吸干表面水分，待用。

1.2.2 種子萌發(fā)及生根分別配置固體培養(yǎng)基BJ4 和B7、液體培養(yǎng)基BJ4 和B7。BJ4 固體培養(yǎng)基：MS + 1.0 mg/L 6?BA + 0.5 mg/L NAA + 30 g/L 蔗糖+ 6.5 g/L 瓊脂；B7 固體培養(yǎng)基：MS + 2.0 mg/L 6?BA + 0.1 mg/L IBA + 30 g/L 蔗糖+ 6.5 g/L 瓊脂，pH = 5.8 ± 0.2。從消毒的蒴果中取出種子均勻撒在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每種類型培養(yǎng)基各接種16 瓶。將接種后的全部固體培養(yǎng)基隨機(jī)放置于組培室內(nèi)，將一半的液體培養(yǎng)基置于搖床上振蕩培養(yǎng)（120 r/min），另一半置于培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)，探究不同配方的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式對(duì)白芨種子萌發(fā)的影響。萌發(fā)后選取葉色相似、大小高度相近的無(wú)菌苗作為白芨生根培養(yǎng)的材料，接種于文獻(xiàn)［11］提供的1/2MS + 0.5 mg/L IBA + 1.0 mg/L GA3生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.2.3 無(wú)菌苗煉苗移栽無(wú)菌苗在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行煉苗后，將根生長(zhǎng)較好、苗高大于3 cm 且葉色較綠的植株取出，流水洗凈根部培養(yǎng)基，選擇生長(zhǎng)狀況相近的白芨無(wú)菌苗（圖1）進(jìn)行移栽。以蛭石作為基質(zhì)來(lái)探究不同規(guī)格的無(wú)紡布育苗容器袋對(duì)無(wú)菌苗移栽成活的影響。育苗袋有4 個(gè)規(guī)格，每個(gè)規(guī)格的寬度與高度值分別為7 cm × 9 cm、9 cm × 12 cm、12 cm × 14 cm、16 cm ×20 cm，分別記為A、B、C、D，每個(gè)規(guī)格30 袋，每一處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

圖1 白芨無(wú)菌苗Fig.1 Bletilla striata aseptic seedlings

1.2.4 白芨容器苗栽植將生長(zhǎng)兩個(gè)月后的容器移栽苗直接移栽到地里，采用不同密度的遮陽(yáng)網(wǎng)對(duì)白芨進(jìn)行拱形覆蓋，研究不同遮蔭強(qiáng)度對(duì)白芨容器苗移栽成活的影響。試驗(yàn)設(shè)有對(duì)照（100%自然光（natural light，NS））、二針（約50% NS）、三針（約30% NS）、四針（約20% NS）共4 種處理，每個(gè)處理共50 棵容器苗。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室內(nèi)條件：溫度為（25 ± 1）℃；光照時(shí)間為12 h/d；光照強(qiáng)度為2 000 Lx。如無(wú)特殊說(shuō)明各培養(yǎng)基均為MS 培養(yǎng)基，添加瓊脂6.5 g/L，蔗糖20 g/L，pH 5.8，121 ℃高溫滅菌20 min。溫室棚的環(huán)境條件為濕度≥80%，溫度28 ℃左右。

1.4 實(shí)驗(yàn)觀察與數(shù)據(jù)處理

接種20 d 后隨機(jī)抽取6 份培養(yǎng)基對(duì)變綠萌發(fā)的種子的球莖大小等級(jí)進(jìn)行分類，球莖級(jí)別分為5 級(jí)：0 級(jí)（仍然處于黃色絲狀）、Ⅰ級(jí)（直徑為0.1 ～0.5 mm）、Ⅱ級(jí)（直徑為0.6 ～1.4 mm）、Ⅲ級(jí)（直徑為1.5 ～1.9 mm）、Ⅳ級(jí)（直徑為2.0 mm 以上），并統(tǒng)計(jì)各級(jí)萌發(fā)數(shù)據(jù)，計(jì)算萌發(fā)率，其中，萌發(fā)率=（Ⅰ級(jí)+ Ⅱ級(jí)+ Ⅲ級(jí)+ Ⅳ級(jí)數(shù)量）/（0 級(jí)+ Ⅰ級(jí)+ Ⅱ級(jí)+ Ⅲ級(jí)+ Ⅳ級(jí)數(shù)量）×100%；在無(wú)紡布育苗袋中移裁50 d 后對(duì)株高、葉片數(shù)、成活率進(jìn)行測(cè)量計(jì)算；在遮蔭強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)中，移栽后的1 個(gè)月和2 個(gè)月分別測(cè)量植株高度和成活率。葉片數(shù)= 葉片總數(shù)/株數(shù)；株高= 總植株高度值/株數(shù)；成活率= 成活數(shù)/移栽總數(shù)× 100%。對(duì)觀察及統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)用Excel2007 和DPS6.0 軟件進(jìn)行處理。方差分析利用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS22.0 進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基及處理方式對(duì)白芨種子萌發(fā)生長(zhǎng)的影響

表1 結(jié)果表明，不同培養(yǎng)基（BJ4 與J7）與不同處理方式下（固體與液體培養(yǎng)，靜止與振蕩培養(yǎng)）的各組處理間均不存在顯著性差異，在整體上J7 較BJ4 有更高的萌芽率，J7 比BJ4 在固體培養(yǎng)、液體振蕩和靜止培養(yǎng)中的萌發(fā)率分別高出5.3%、9.7%和19.0%；并且在白芨萌發(fā)生長(zhǎng)后球莖大小會(huì)受到培養(yǎng)基質(zhì)類型的影響，其中固體BJ4 和J7 對(duì)種球發(fā)育大小的影響差異達(dá)到顯著水平，固體BJ4 中的白芨球根Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)占比是J7 的3.2 倍；并且與液態(tài)靜止培養(yǎng)間也存在顯著性差異，培養(yǎng)基J7 以液體培養(yǎng)較好，但固液間則沒(méi)有顯著性差異。液體BJ4 和液體J7 的靜止與振蕩狀態(tài)下的球根發(fā)育大小之間沒(méi)有顯著性的差異。

表1 不同培養(yǎng)基及處理方式對(duì)種子萌發(fā)的影響 /%Tab.1 Effects of different media and treatment methods on seed germination

2.2 不同規(guī)格育苗袋對(duì)白芨無(wú)菌苗移栽成活的影響

表2 結(jié)果表明，從移栽成活率來(lái)看，D 規(guī)格的育苗袋（16 cm × 20 cm）移栽成活率較高，達(dá)71.10%，分別比規(guī)格為A（7 cm × 9 cm）、B（9 cm × 12 cm）、C（12 cm × 14 cm）育苗袋處理的移栽成活率提高了45.4%、23.1%、4.9%，但不同育苗袋規(guī)格間的移栽成活率不存在顯著性差異。從平均葉片數(shù)和苗高兩個(gè)指標(biāo)來(lái)看，也是D 規(guī)格的育苗袋更好，葉片數(shù)分別比規(guī)格為A、B、C 容器中的提高162.0%、101.4%、55.9%，并且與這3 種規(guī)格間的差異均達(dá)到了顯著水平；植株高度分別比規(guī)格為A、B、C 育苗袋中的提高60.1%、23.1%、30.3%，并且與A 之間的差異具有顯著性，而與其他兩個(gè)規(guī)格沒(méi)有顯著性差異。結(jié)合成活率、植株高度、葉片數(shù)的這3 項(xiàng)指標(biāo)可以說(shuō)明規(guī)格D 對(duì)白芨無(wú)菌苗移栽成活與生長(zhǎng)影響優(yōu)于其他3 種規(guī)格的育苗袋。

表2 育苗袋規(guī)格對(duì)無(wú)菌苗移栽成活的影響Tab.2 Effect of seedling bag specifications on the transplanting survival of aseptic seedlings

2.3 不同遮蔭強(qiáng)度對(duì)白芨容器苗移栽成活的影響

圖2 結(jié)果表明，成活率隨著遮蔭強(qiáng)度的增加而提高，兩個(gè)月后的成活率低于一個(gè)月時(shí)的成活率。成活率在四針遮蔭時(shí)成活率最高，達(dá)到70%，分別高出三針、二針、對(duì)照組處理40%、59%、600%，兩個(gè)月后四針規(guī)格與其他3 種不同處理之間的成活率差為20%、30%、60%。

圖2 遮蔭強(qiáng)度對(duì)白芨容器苗移栽成活的影響Fig.2 Effect of shading intensity on transplanting survival of Bletilla striata container seedlings

白芨無(wú)菌苗分種到地里的初始平均株高之間沒(méi)有顯著性的差異，但不同強(qiáng)度的遮蔭對(duì)白芨無(wú)菌苗移栽成活及生長(zhǎng)影響不同，結(jié)果見(jiàn)表3。一個(gè)月時(shí)各處理間容器苗株高無(wú)顯著差異。但兩個(gè)月后，4 種處理的平均株高達(dá)到顯著性差異，其中以四針的效果最好，三針次之，兩針效果較差，無(wú)遮蔭處理的移栽苗全部死亡。由此可知四針規(guī)格處理下的環(huán)境更有利于白芨容器苗的生長(zhǎng)，無(wú)遮蔭狀態(tài)下不適合白芨容器苗的生長(zhǎng)。

表3 遮蔭強(qiáng)度對(duì)白芨容器苗高度的影響 /cmTab.3 Effects of shading intensity on container seedling height of Bletilla striata

3 討論

白芨的種子因沒(méi)有胚乳，自然條件下萌發(fā)率極低，因此需要在一定的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中才能萌發(fā)。白芨種子無(wú)菌培養(yǎng)時(shí)常采用固體培養(yǎng)基，而液體培養(yǎng)基可以使外植體與營(yíng)養(yǎng)物充分接觸，振蕩培養(yǎng)可以使得白芨種子處于良好的分散狀態(tài)，有利于每粒種子都能吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［12］。但本文結(jié)果顯示不同處理間（靜止和振蕩培養(yǎng)）白芨種子萌發(fā)率差異并不顯著（P＞0.05），沒(méi)有達(dá)到預(yù)期效果，可能是搖床轉(zhuǎn)速過(guò)快，不利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

容器作為育苗的主體器皿，容器的規(guī)格和材質(zhì)的選擇直接影響到苗木的移栽成活及質(zhì)量、生產(chǎn)成本乃至后期的生長(zhǎng)狀況。無(wú)紡布袋的融水性、融土性和透氣性好，容器苗可以直接入土，避免移栽過(guò)程中對(duì)根系造成損傷。本文實(shí)驗(yàn)顯示4 種規(guī)格容器中，D 規(guī)格為最佳選擇，這個(gè)結(jié)果與呂家等［13］在容器規(guī)格對(duì)紫椴幼苗生長(zhǎng)的影響中一致。而且較大的容器規(guī)格會(huì)增加育苗成本和運(yùn)輸費(fèi)用等問(wèn)題，生產(chǎn)中具體的育苗規(guī)格的選擇還要進(jìn)行綜合考慮。

光照強(qiáng)度是影響植物健康生長(zhǎng)的重要因素之一，人工遮蔭可以有效降低光照強(qiáng)度和葉面溫度的作用［14］。在本實(shí)驗(yàn)中，四針規(guī)格的遮陽(yáng)網(wǎng)條件下，白芨的存活率和高度達(dá)到最大，這個(gè)結(jié)果和楊平飛等［15］的結(jié)果相似，其研究中40% ～55%遮陰網(wǎng)進(jìn)行遮陰，有利于白芨的生長(zhǎng)。隨后黃珊等［16］也證明了這一點(diǎn)，60%的遮蔭度白芨的莖稈最粗、根數(shù)最多，也有利于多糖的積累，從而得到優(yōu)質(zhì)的白芨種苗。這與白芨喜陰涼濕潤(rùn)的環(huán)境有關(guān)。

綜上所述，不同培養(yǎng)基對(duì)種子萌發(fā)率差異不顯著，但固體BJ4（MS + 1.0 mg/L 6?BA +0.5 mg/L NAA + 30 g/L 蔗糖+ 6.5 g/L 瓊脂）培養(yǎng)基中的球莖會(huì)大于其他處理的培養(yǎng)基。綜合成活率、株高、葉片數(shù)的數(shù)據(jù)可以說(shuō)明D（16 cm × 20 cm）規(guī)格的無(wú)紡布容器袋對(duì)白芨無(wú)菌苗移栽成活與生長(zhǎng)影響優(yōu)于其他3 種規(guī)格。四針遮陽(yáng)網(wǎng)下的光照強(qiáng)度更有利于白芨容器苗的生長(zhǎng)，移栽兩個(gè)月后成活率為60%，株高為5.65 cm，而無(wú)遮蔭狀態(tài)下不適合白芨容器苗的生長(zhǎng)。