沙門氏菌H鞭毛抗原純培養(yǎng)和位相變異方法改進(jìn)及效果的分析

趙衛(wèi)紅，黃曾，鄒錦群，詹卓蓬，丁欣悅，龔怡靜

（1.豐城市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，江西 豐城331100；2.武漢體育學(xué)院研究生院健康科學(xué)院，湖北 武漢430079）

沙門氏菌可以通過水源、食物等途徑引起食物中毒,敗血癥等病，85%的食物中毒是由沙門氏菌引起[1]。GB29921-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》中沙門氏菌是主要限量菌之一，且限量為0cfu/25g或ml,為所有微生物限量標(biāo)準(zhǔn)中的最嚴(yán)格級[2]。

沙門氏菌對人類的威脅已超過數(shù)百年,全球每年有超過1億人感染。在亞太地區(qū),每10萬人中有32人感染,其中東亞地區(qū)最嚴(yán)重,每1O萬人中有3600人感染,全球每年因沙門氏菌而死亡的人數(shù)高達(dá)15.5 萬人,死亡率居亞洲國家和東南亞國家最高[3]。我國每年至少200萬人感染沙門氏菌，造成成千上萬人住院，數(shù)百人因此而死亡[4]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告,世界各國沙門氏菌食物污染日益嚴(yán)重，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[5]。

近年來沙門氏菌檢測與分型手段有了長足進(jìn)步,但大部分是基于核酸的分子生物學(xué)等檢測技術(shù),這些方法門檻要求高，成本貴，限制了其在基層應(yīng)用[6]。在基層常用的傳統(tǒng)檢測方法中，血清學(xué)分型是沙門氏菌命名及菌株溯源的關(guān)鍵步驟，但實(shí)際檢測過程中沙門氏菌的血清分型工作量大、步驟繁雜，靈敏度低，尤其是沙門氏菌H鞭毛抗原難以檢測，常需誘導(dǎo)多次[7]，導(dǎo)致整個檢測過程耗時長、易出錯、成本高[8]，人員勞動強(qiáng)度大。有報(bào)道顯示，沙門氏菌H鞭毛抗原較易發(fā)生H-O變異[7]，而H鞭毛抗原如何恢復(fù)表達(dá)的有關(guān)報(bào)道很少[1]。所以,實(shí)現(xiàn)H鞭毛抗原的快速、低成本、高成功率的誘導(dǎo)表達(dá)對沙門氏菌的快速檢測和分型具有十分重要的意義。本研究探討沙門氏菌H鞭毛抗原純培養(yǎng)和H鞭毛抗原誘導(dǎo)方法的改進(jìn),使沙門氏菌的血清學(xué)分型工作省時、簡單、高效、成本低，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株 ⑴2020年3月-5月份對禽類、水產(chǎn)品等120份樣品做沙門氏菌檢測獲得14株沙門氏菌菌株：有典型生化反應(yīng)、A-F O多價陽性、O單因子抗原鑒定陽性、需要鑒定H鞭毛抗原的沙門氏菌菌株。⑵其他16份已經(jīng)血清學(xué)分型鑒定了的沙門氏菌菌株來自江西省疾病預(yù)防控制中心和宜春市疾病預(yù)防控制中心。⑶試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株是由省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.2 試驗(yàn)試劑PCA、布氏肉湯、BPW（緩沖蛋白胨水）、SC（亞硒酸鹽胱氨酸）、TTB(四硫磺酸鈉煌綠）、BS（亞硫酸鉍）、沙門氏菌顯色瓊脂平板、沙門氏菌生化鑒定試劑、半固體、雙糖鐵(青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司)、沙門氏菌診斷血清（寧波天潤生物藥業(yè)有限公司）等，試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 儀器與設(shè)備 YC-180澳柯瑪冰箱（澳柯瑪股份有限公司）、JM-A電子天平（諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司）、BSC-1300ⅡA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、CJV1500T潔凈工作臺（山東新華醫(yī)療器械廠）、LMQ.C立式滅菌器（山東新華醫(yī)療器械廠）、5V電動移液槍（DLAB Scientific Inc）

1.4 方法 試驗(yàn)整個過程用沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作對照

1.4.1 檢測前準(zhǔn)備 120份禽類及其內(nèi)臟、水產(chǎn)品，獸類等樣品按照GB 4789.4-2016檢測鑒定沙門氏菌。獲得14株沙門氏菌：有典型生化反應(yīng)、A-F O多價陽性，O單因子抗原鑒定陽性，需要鑒定H鞭毛抗原的沙門氏菌菌株。

配制所需試劑，高壓滅菌所需器材、試劑，復(fù)蘇菌株，劃線接種至沙門氏菌顯色瓊脂平板，36℃24h培養(yǎng)后，挑單個典型菌落試驗(yàn)。對30株沙門氏菌菌株鑒定生化反應(yīng)情況、A-F O多價陽性，O單因子抗原鑒定陽性。

1.4.2 沙門氏菌菌株純培養(yǎng)后H鞭毛抗原血清學(xué)鑒定 30株沙門氏株按照：同一株沙門氏菌同時用兩種試驗(yàn)法做純培養(yǎng)后H鞭毛抗原血清學(xué)鑒定（一）依據(jù)GB4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》：從沙門氏菌顯色瓊脂平板挑紫紅色，半透明，中等大小的菌落直接劃線接種到普通營養(yǎng)瓊脂平板上，36℃24h純培養(yǎng)后，用沙門氏菌診斷血清檢測H鞭毛抗原（二）改進(jìn)的沙門氏菌純培養(yǎng)試驗(yàn)法：從沙門氏菌顯色瓊脂平板挑紫紅色，半透明，中等大小的菌落直接涂布接種到加了1.5ml布氏肉湯的PCA瓊脂平板上，36℃24h純培養(yǎng)后，用沙門氏菌診斷血清檢測H鞭毛抗原因子，二者進(jìn)行24h時間培養(yǎng)后兩相H鞭毛抗原都檢出來的陽性率比較。

1.4.3 沙門氏菌H鞭毛抗原位相變異試驗(yàn)法 同一株沙門氏菌（按照GB4789.4-2016沙門氏菌H鞭毛純培養(yǎng)法檢驗(yàn)只檢出一相H鞭毛抗原的22株沙門氏菌）同時用二種試驗(yàn)法做H鞭毛抗原位相變異培養(yǎng)（一）依據(jù)GB4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》位相變異試驗(yàn)法之一簡易平板法：將0.35%--0.4%半固體瓊脂平板烘干表面水分，挑取已經(jīng)檢查出來的H鞭毛抗原因子診斷血清1環(huán)，滴在半固體平板表面，放置片刻，待血清吸收到瓊脂內(nèi)，在血清部位的中央點(diǎn)種待檢菌，36℃24h培養(yǎng)后，在形成蔓延生長的菌苔邊緣取菌，用沒有檢測出相對應(yīng)的沙門氏菌H鞭毛抗原診斷血清檢測H鞭毛抗原（二）改進(jìn)的沙門氏菌H鞭毛抗原位相變異試驗(yàn)法：在滴加了1小滴布氏肉湯的小玻璃管中滴加已檢出鞭毛H相對應(yīng)的沙門氏菌H鞭毛抗原診斷血清1小滴，混勻，從沙門氏菌純培養(yǎng)的營養(yǎng)瓊脂平板上用接種針挑取菌接種到混勻的液體中，36℃24h培養(yǎng)后，用沒有檢測出來的另外一相沙門氏菌H鞭毛抗原診斷血清檢測H鞭毛抗原，二者進(jìn)行24h培養(yǎng)后H鞭毛抗原檢出的陽性率比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 120份樣品中檢出14株沙門氏菌菌株的情況禽 類、禽類的內(nèi)臟、水產(chǎn)品中沙門氏菌檢出陽性率較高，沙門氏菌污染較嚴(yán)重。

表1 120份樣品中檢出沙門氏菌菌株的情況

2.2 兩種沙門氏菌純培養(yǎng)方法培養(yǎng)24h后兩相H鞭毛抗原都檢出的陽性率比較P<0.01差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 兩種沙門氏菌純培養(yǎng)方法培養(yǎng)24小時后檢出兩相H鞭毛抗原的陽性率比較

2.3 兩種沙門氏菌位相變異方法培養(yǎng)24h后H鞭毛抗原檢出的陽性率比較P<0.01差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 兩種沙門氏菌位相變異方法培養(yǎng)24小時后H鞭毛抗原檢出的陽性率比較

3 討論

非傷寒沙門氏菌病是全球范圍內(nèi)血液感染的主要原因之一，每年發(fā)病率340（210~650）萬的病例（總發(fā)病率49/10萬），發(fā)病人數(shù)也多（190[130~290]萬病例）非洲發(fā)病率最高（227/10萬），發(fā)病人數(shù)也多（190[130~290]萬病例），其中嬰幼兒和青年人受影響最大，病死率為20%，是全球疾病和死亡的主要原因之一[9]。通過對本市120份樣品沙門氏菌檢測情況分析,禽類、禽類的內(nèi)臟、水產(chǎn)品中沙門氏菌檢出陽性率較高,本市食品中沙門氏菌污染較嚴(yán)重。沙門氏菌是重要的食源性致病菌,能引起人和動物中毒并引起多種嚴(yán)重的疾病,對人類健康造成了巨大危害[10]。有關(guān)報(bào)道其中生禽肉中沙門氏菌的檢出率最高為37.5%[11]，如表1本實(shí)驗(yàn)室生禽肉中沙門氏菌的檢出率最高為23.33 %,比報(bào)導(dǎo)結(jié)果低,可見沙門氏菌污染食品中生禽肉比較嚴(yán)重[12]，而禽肉是人們餐桌上常見的食物，沙門菌是食源性疾病的主要致病菌[13]，沙門氏菌的污染則是嚴(yán)重危害公眾健康的大問題[14]。因此提高沙門氏菌檢測鑒定分型效率是十分必需的，改進(jìn)沙門氏菌H鞭毛抗原檢測方法，提供省時、簡單、高效，低成本的方法，具有重要意義。

對沙門氏菌檢測的研究文獻(xiàn)比較多：沙門氏菌鞭毛抗原及其多樣性研究進(jìn)展[15]、A novel DNA quantum dots/aptamer-modified gold nanoparticles probe for detection of Salmonella typhimurium by fluorescent immunoassay（新型DNA量子點(diǎn)/適體修飾金納米粒子熒光免疫 探針檢測鼠傷寒沙門菌）[16]、Recombinase Polymerase Amplification(RPA)Combined with Lateral Flow Immunoassay for Rapid Detection of Salmonella in Food（重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）結(jié)合側(cè)向流免疫法快速檢測食品中沙門氏菌）[17]等。這些方法快速，但它針對沙門氏菌核酸等分子生物學(xué)檢測，有些不能分型檢測，試驗(yàn)、操作過程等易受環(huán)境污染影響結(jié)果，技術(shù)條件、環(huán)境要求高，需要高精密儀器與設(shè)備，成本高，如PCR方法就有局限性,死亡菌體也檢出強(qiáng)陽性[18],不適應(yīng)疾病預(yù)防控制中心等基層醫(yī)療單位應(yīng)用。我國對沙門氏菌H鞭毛抗原檢測研究的文獻(xiàn)比較少：《搭橋法誘導(dǎo)腸炎沙門氏菌鞭毛抗原及鑒定》[1]、《一株 發(fā)酵乳糖且位相變異的鼠傷寒沙門氏菌的鑒定》[19]、《沙門氏菌血清學(xué)分型》[20]。這些方法細(xì)菌培養(yǎng)需時長，檢測結(jié)果滯后，操作繁雜、易受污染影響結(jié)果，技術(shù)高、成本高，不很適應(yīng)基層。

目前，全世界已發(fā)現(xiàn)2500多種沙門氏菌血清型[21]，我國目前發(fā)現(xiàn)一千多種沙門氏菌[22]，且沙門氏菌鞭毛抗原易發(fā)生H—O變異、抗原復(fù)雜、多樣性[13]；變異誘導(dǎo)培養(yǎng)經(jīng)常5～6次都難檢出[7]。食品經(jīng)過加工，由于加熱、干燥、高含鹽量、酸和冷凍等因素的作用、平板含水份過少導(dǎo)致鞭毛發(fā)育不良；培養(yǎng)基中某些成分抑制鞭毛生長；營養(yǎng)成分含量不夠；培養(yǎng)溫度不合適；某些菌株冷凍過久，性狀發(fā)生變異等，這些因素都可能使沙門氏菌的鞭毛丟失或產(chǎn)生困難[1]。沙門氏菌檢測采用GB4789.4-2016分離純培養(yǎng)和位相變異方法，靈敏度低、反復(fù)多次所需時間長、消耗試劑多,成本高、操作繁雜、結(jié)果滯后、人員勞動強(qiáng)度大。所以沙門氏菌H鞭毛抗原檢測鑒定方法改進(jìn)研究，使其方法快速、簡單、低成本、高成功率的誘導(dǎo)表達(dá)，提高效率是非常有必要的。

表2 中兩種沙門氏菌純培養(yǎng)方法培養(yǎng)24h后檢出兩相H鞭毛抗原的陽性率結(jié)果比較P＜0.01差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表3兩種沙門氏菌位相變異方法培養(yǎng)24h檢出H鞭毛抗原的陽性率結(jié)果比較P＜0.01差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。沙門氏菌按照常規(guī)GB4789.4-2016純培養(yǎng)法和鞭毛位相變異法檢測H鞭毛,用普通營養(yǎng)瓊脂平板和半固體瓊脂培養(yǎng),營養(yǎng)成分只有蛋白胨和牛肉浸出粉；而改進(jìn)法純培養(yǎng)法和H鞭毛位相變異法檢測H鞭毛用的是PCA和布氏肉湯，PCA的營養(yǎng)成分中有胰蛋白胨和酵母浸粉；布氏肉湯的營養(yǎng)成分中有蛋白胨、酵母浸粉、胰酪蛋白胨。PCA和布氏肉湯的營養(yǎng)成分豐富，并含有酵母浸粉，有利于加速細(xì)菌發(fā)育繁殖,能刺激沙門氏菌H鞭毛發(fā)育[8],酵母增菌肉湯的液體環(huán)境更有利沙門氏菌H鞭毛生長[8]；實(shí)驗(yàn)中：改進(jìn)的沙門氏菌純培養(yǎng)方法培養(yǎng)24h后檢出兩相H鞭毛抗原的陽性率為73.33%；改進(jìn)的沙門氏菌位相變異方法培養(yǎng)24h后檢出H鞭毛抗原的陽性率86.36%。改進(jìn)的純培養(yǎng)和位相變異的檢出率提高了，檢出時間縮短了，靈敏度提高了，避免了反復(fù)轉(zhuǎn)種鑒定都檢不出來的困難,是基層疾病預(yù)防控制中心應(yīng)對突發(fā)公共衛(wèi)生事件迫切需要的；改進(jìn)的純培養(yǎng)和位相變異法所用的器材：9cm平皿、接種針、吸管培養(yǎng)箱等，試劑都比較簡單、易得、操作簡便、技術(shù)條件簡單，只要高壓滅菌，整個過程注意無菌操作、生物安全。與GB4789.4-2016的方法相比只是多了一種布氏肉湯，不需要增加任何儀器設(shè)備和其他試劑。減輕了試劑配制、滅菌、清洗、等環(huán)節(jié)工作量，降低了各環(huán)節(jié)污染風(fēng)險和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染風(fēng)險。是現(xiàn)在物資困乏，任務(wù)繁重的基層疾醫(yī)療急需的。所以改進(jìn)的沙門氏菌純培養(yǎng)和位相變異法技術(shù)操作簡便、檢出率高、成本低、檢出時間短，靈敏度高，具有經(jīng)濟(jì)及時間效益,有利于基層醫(yī)療沙門氏菌鑒定技術(shù)的推廣應(yīng)用。

綜上所述,改進(jìn)的沙門氏菌H鞭毛抗原純培養(yǎng)和位相變異方法,在24h間內(nèi)H鞭毛抗原檢出陽性率高、檢出時間縮短了、操作簡便、所用的儀器設(shè)備簡單,在現(xiàn)有的基層上不需要添加任何儀器設(shè)備,試劑少、成本低，比較易得、技術(shù)條件、環(huán)境簡單,減少人員的勞動強(qiáng)度，為基層醫(yī)療提供了省時、簡單、高靈敏度、高經(jīng)濟(jì)效益的方法。改進(jìn)的沙門氏菌H鞭毛抗原純培養(yǎng)和位相變異方法具有推廣應(yīng)用價值，確保了基層食品的安全，從而提高人們的健康水平,將產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。