循環(huán)腫瘤DNA與結(jié)直腸癌的研究進展

周鵬飛 廖正威 王培龍

【摘要】 結(jié)直腸癌（CRC）是一種惡性疾病，預(yù)后與結(jié)直腸癌的分期密切相關(guān)，所以早期診斷是生存的關(guān)鍵。隨著精密醫(yī)學(xué)的發(fā)展，液體活檢已成為檢測分子變化和腫瘤異質(zhì)性的重要工具。近年來，循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）以其無創(chuàng)性、方便性、綜合性、安全性等特點受到越來越多的關(guān)注。本文就ctDNA在CRC診斷、監(jiān)測及預(yù)后方面的臨床作用做一綜述。

【關(guān)鍵詞】 ctDNA 結(jié)直腸癌 診斷 監(jiān)測 預(yù)后

Circulating Tumor DNA and Colorectal Cancer Research Progress/ZHOU Pengfei， LIAO Zhengwei， WANG Peilong. //Medical Innovation of China， 2021， 18（16）： -180

[Abstract] Colorectal cancer （CRC） is a malignant disease， and the prognosis is closely related to the stage of colorectal cancer， so early diagnosis is the key to survival. With the development of precision medicine， liquid biopsy has become an important tool for detecting molecular changes and tumor heterogeneity. In recent years， circulating tumor DNA （ctDNA） has received more and more attention due to its non-invasiveness， convenience， comprehensiveness， and safety. This article reviews the clinical role of ctDNA in the diagnosis， monitoring and prognosis of CRC.

[Key words] ctDNA Colorectal cancer Diagnosis Monitoring Prognosis

First-author’s address： Changzhi Medical College， Changzhi 046000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.16.042

結(jié)直腸癌（CRC）是一種嚴重的異質(zhì)性疾病，在癌癥發(fā)病率中居第三位，是世界第二大死因，每年有近180萬新診斷患者和100萬死亡患者[1]。結(jié)直腸癌已經(jīng)成為世界的主要癌癥，部分原因可能是人口老齡化和不良的生活習(xí)慣，如吸煙，紅肉和酒精攝入量增加，缺乏運動，糖尿病，陽性的遺傳家族史，腸道菌群多樣性較低有關(guān)。篩查計劃的目的是識別癌前病變或可切除的0、Ⅰ、Ⅱ期的患者，他們的預(yù)后通常比有癥狀的患者要好[2]。盡管有篩查計劃，但許多患者被診斷時已經(jīng)是Ⅲ和Ⅳ期，導(dǎo)致總體預(yù)后較差[3]。根據(jù)美國國家癌癥研究所的數(shù)據(jù)，結(jié)腸癌（CC）和直腸癌（RC）Ⅳ期的五年生存率分別只有12%和13%[4];而早期發(fā)現(xiàn)Ⅰ期可以使CC和RC的存活率分別提高到92%和88%[5]。

傳統(tǒng)的臨床診斷方法包括血清腫瘤標志物、結(jié)腸鏡、影像學(xué)和組織活檢。癌胚抗原（CEA）和糖類抗原19-9（CA19-9）被用作血清腫瘤標記物，但由于缺乏敏感性和特異性，單獨使用這兩種標記物并不能完全滿足臨床需要[6]。腫瘤活檢在臨床上也有不足之處，由于嚴重的創(chuàng)傷和患者依從性差，很難進行重復(fù)活檢來監(jiān)測疾病進展。因此，循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）作為一種很有前途的結(jié)直腸癌診斷工具應(yīng)運而生。此外，從ctDNA獲得的信息與組織活檢具有互補性。結(jié)合來自ctDNA的信息可以克服與腫瘤異質(zhì)性和有限的組織可用性相關(guān)的一些挑戰(zhàn)。

1 ctDNA的來源

無細胞DNA（cfDNA）是高度降解的DNA片段，在外周血中可以檢測到。在健康人中，絕大多數(shù)cfDNA來自造血系統(tǒng)。在一定生理或病理狀態(tài)下，cfDNA的組成可能會發(fā)生變化。例如，懷孕女性的血液中含有胎兒的DNA片段，癌癥患者的血液循環(huán)中含有腫瘤的DNA片段。后者也被叫做ctDNA，是由150～200個堿基對組成的片段。重要的是，ctDNA保留了表觀遺傳學(xué)特征，并攜帶可在外周血中檢測到的腫瘤特異性突變[7]。ctDNA的正常半衰期小于1 h，表明ctDNA能反映腫瘤的動態(tài)特征。研究表明，ctDNA有多個來源，而不是單一來源[8]。ctDNA的三個主要來源是：（1）凋亡或壞死的腫瘤細胞;（2）活躍的腫瘤細胞;（3）循環(huán)中的腫瘤細胞[9]。由于ctDNA攜帶的遺傳信息與腫瘤細胞完全相同，且存在于外周血中，因此ctDNA是診斷大腸癌的理想工具。

2 ctDNA在臨床實踐中的作用

2.1 早期CRC患者的診斷 大腸癌的早期診斷是提高疾病治愈率的關(guān)鍵。目前，早期診斷的主要方法是糞便潛血檢測、直腸指檢（DGE）和血清腫瘤標志物（CEA、CA19-9）分析。血清腫瘤標志物CEA的檢測敏感性和特異性較低，不能完全滿足臨床需要。因此，ctDNA可能是診斷CRC的有利工具，特別是當其與CEA聯(lián)合用于早期檢測時[10]。一些研究表明，ctDNA甲基化在早期CRC患者中比傳統(tǒng)的血清腫瘤標志物具有更高的敏感性，是一種潛在的診斷的生物標志物[11-12]。此外，最近的一項研究表明，單個ctDNA甲基化標記cg10673833可以在1 493名CRC參與者中產(chǎn)生高敏感性（89.7%）和特異性（86.8%）[13]。FDA批準臨床應(yīng)用的

Epi proColon試驗被廣泛用于篩查大腸癌患者cfDNA中SEPT9啟動子的甲基化狀態(tài)[14]。

除了癌癥，血漿ctDNA水平在許多其他疾病中也可以觀察到，包括心肌梗死、嚴重感染、炎癥性疾病和妊娠[15-17]。在普通人群中，良性病變可能與癌細胞具有相同的突變，并可能將cfDNA釋放到循環(huán)中[18]。因此，ctDNA水平的升高可能是非特異性的。為了克服這個問題，最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，DNA片段長度分布呈現(xiàn)出不同的模式，健康人cfDNA片段的長度分布呈規(guī)律性;相反，來自癌癥患者的ctDNA片段的長度分布是不規(guī)則的[19]。表明根據(jù)游離DNA片段長度的分布模式可以區(qū)分健康人和癌癥患者。其他研究已經(jīng)證實了包括KRAS、BRAF和TP53的腫瘤保守的基因突變。不幸的是，當檢測結(jié)果為陽性時，很難將腫瘤定位于特定器官。在這種情況下，可以進行一種名為CancerSEEK的測試來評估循環(huán)蛋白水平和cfDNA突變。CancerSEEK對卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌和食管癌的敏感性為69%～98%，對所有腫瘤類型的特異性均大于99%，這些結(jié)果提供了CancerSEEK提高早期癌癥檢測水平的證據(jù)。最重要的是，CancerSEEK可以確定特定腫瘤類型的起源部位[20]。ctDNA主要來源于壞死性和凋亡性腫瘤細胞，因此有必要量化健康個體中cfDNA的有效水平，以建立更好的早期診斷閾值。所以，ctDNA領(lǐng)域需要大樣本研究的支持，并且檢測方法必須標準化后才能用于臨床癌癥診斷。

2.2 微小殘留病和復(fù)發(fā)監(jiān)測 進行手術(shù)或根治性治療后，即使在沒有任何其他臨床疾病證據(jù)的情況下，ctDNA的檢測也可能標志著微小殘留?。∕RD）的存在?？梢詫赾tDNA的液體活檢進行優(yōu)化，以在根治性切除后和在臨床或放射學(xué)復(fù)發(fā)之前捕獲和監(jiān)測MRD[21]。一項前瞻性隊列研究報告了ctDNA檢測的230例Ⅱ期結(jié)腸癌患者的1 046份血漿樣本中MRD的能力[22]。在未進行輔助化療的患者中，178例患者中有14例（7.9%）在術(shù)后檢測到ctDNA，這14例患者中有11例（78.6%）在隨訪期間發(fā)現(xiàn)放射學(xué)復(fù)發(fā)[22]。相比之下，178例患者中的其余164例（92.1%）術(shù)后ctDNA陰性，只有16例（9.8%）的患者發(fā)現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)。在接受化療的患者中，化療完成后，ctDNA的存在也與無復(fù)發(fā)生存期（RFS）縮短有關(guān)（P=0.001）[22]。另一項研究也報告了在計劃進行新輔助放化療的局部晚期直腸癌（T3、T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性）患者中，ctDNA檢測MRD的能力[23]。雖然在治療前可檢測到ctDNA的患者與未檢測到ctDNA的患者在RFS方面沒有差異，但ctDNA陽性的患者在放化療或手術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險增加[放化療：危險比（HR）=6.6（P<0.001）;手術(shù)：HR=13.0（P<0.001）][23]。術(shù)后ctDNA陽性患者的3年RFS估計為33%，而術(shù)后ctDNA陰性患者的3年RFS大約為87%。這些數(shù)據(jù)表明，不管是否使用輔助化療，術(shù)后ctDNA檢測對預(yù)測復(fù)發(fā)可能是有用的。因此，基于ctDNA對復(fù)發(fā)風(fēng)險較高的患者進行篩查可能會為臨床轉(zhuǎn)移前的治療干預(yù)創(chuàng)造機會。

2.3 監(jiān)測CRC的治療反應(yīng) 傳統(tǒng)上用于監(jiān)測晚期CRC的方法有CEA、影像學(xué)（CT、MRI）和結(jié)腸鏡檢查。然而，CEA由于其低敏感性和特異性而在臨床實踐中具有明顯的局限性[24]。因此，需要更好的生物標志物來監(jiān)測治療反應(yīng)，而ctDNA是合適的選擇。如前所述，由于ctDNA的半衰期很短，因此可以實時監(jiān)測腫瘤負荷。與成像方法相比，序列ctDNA分析可以用來提前幾周到幾個月追蹤治療反應(yīng)，這可以提供足夠的時間來調(diào)整治療策略和防止疾病進展[25]。血漿ctDNA水平與患者化療后預(yù)后不良有關(guān)[26]。文獻[27]報道，化療后ctDNA水平下降10倍的患者比ctDNA水平下降<10倍的患者有更長的無進展生存期[中位數(shù)無進展生存期：14.7個月vs 8.1個月，HR=1.87，95%CI（0.62，5.61）]。

除了識別治療無效的個體外，ctDNA還可以用來評估晚期患者的腫瘤負荷，并指導(dǎo)后續(xù)的治療決定。Vidal等[28]注意到ctDNA的動態(tài)變化可以反映疾病的進展，并且這些變化在診斷成像發(fā)生之前是可以測量的。最近的一項回顧性研究證實，在一線藥物以奧沙利鉑為基礎(chǔ)的化療前，ctDNA可作為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC）的預(yù)后生物標志物[29]。另外，文獻[30]中ctDNA還評估了阿帕替尼對難治性mCRC患者的單藥治療效果。mCRC患者外周血中ctDNA水平高于非轉(zhuǎn)移性大腸癌患者外周血中ctDNA水平。監(jiān)測晚期CRC患者的治療反應(yīng)具有重要的臨床意義，作為一種重要的工具，ctDNA可以為晚期疾病患者提供更好的治療策略，并具有更大的潛力來補充實體腫瘤反應(yīng)評估標準（RECIST）評估[31]。

新輔助放化療（NCRT）被廣泛應(yīng)用于局部晚期直腸癌（LARC）的治療。50%～60%的直腸癌患者在新輔助放化療后腫瘤消退，其中病理完全應(yīng)答（PCR）高達20%[32]。為了避免晚期LARC患者術(shù)后并發(fā)癥，提高生活質(zhì)量，一些研究人員提出了“觀察等待”的策略。先前的研究證實直腸癌患者對新輔助治療的反應(yīng)與疾病預(yù)后有關(guān)[33]。Yang等[34]建議可以使用ctDNA將LARC患者分為高?；虻臀喗M，選擇適合于“觀察和等待”的策略。盡管ctDNA可以為治療決策提供有價值的信息，但仍需要進行前瞻性研究來評估后續(xù)治療策略。在臨床實踐中，ctDNA在改善治療監(jiān)測方面具有很大的潛力。它避免了常規(guī)CT掃描的輻射暴露，比CEA具有更高的敏感性。因此，ctDNA可用于更好地識別疾病進展，并可以及時調(diào)整治療策略。

2.4 轉(zhuǎn)移性患者的治療耐藥性 具有野生型KRAS/NRAS/BRAF的mCRC患者通常對最初的抗EGFR治療敏感。然而，腫瘤通常在治療的最初幾個月內(nèi)產(chǎn)生獲得性耐藥，這是接受靶向腫瘤治療的個體治療失敗的主要原因。在抗EGFR治療過程中獲得性耐藥的機制被歸因于旁路信號通路的激活和EGFR受體的繼發(fā)性改變[35]。大約40%的大腸癌患者有KRAS外顯子2的第12、13密碼子突變[36]。一些研究表明，KRAS外顯子2的突變預(yù)示著抗EGFR（西妥昔單抗和帕尼單抗）治療失敗[37]。獲得性耐藥的機制在抗EGFR治療中較為復(fù)雜，在臨床實踐中難以追蹤。

然而，由于ctDNA可以用于無創(chuàng)、實時監(jiān)測EGFR信號通路的異常，因此它可以作為一種策略來識別mCRC患者對抗EGFR治療的獲得性耐藥，并指導(dǎo)后續(xù)的治療?；仡櫺苑治霰砻?，在接受抗EGFR治療時，最初為KRAS野生型的患者可以發(fā)生KRAS突變[38]。也有其他研究發(fā)現(xiàn)，西妥昔單抗治療后10個月內(nèi)出現(xiàn)KRAS突變[39]。這些結(jié)果表明，KRAS突變是抗EGFR治療獲得性耐藥的主要機制，通常在治療后發(fā)生。由于同一患者體內(nèi)的不同腫瘤病變會出現(xiàn)不同的耐藥機制，所以ctDNA可能是一種強大的工具。序列ctDNA監(jiān)測的平行分析可以非侵入性地追蹤這些突變，以減少組織活檢造成的不良影響，并指導(dǎo)后續(xù)治療[40]。目前，抗EGFR再挑戰(zhàn)策略對獲得性耐藥患者有效[41]。西妥昔單抗聯(lián)合伊立替康作為三線治療對于在產(chǎn)生耐藥性之前接受相同治療方案作為一線治療的患者有效?？梢酝ㄟ^分析ctDNA，選擇適合重新挑戰(zhàn)策略的患者[42]。

HER2與EGFR屬于同一信號激酶受體家族。值得注意的是，HER2在乳腺癌患者中的成功靶向已經(jīng)在晚期和輔助環(huán)境中實現(xiàn)。HER2在結(jié)直腸癌中過表達是罕見的，僅在大約3%的患者中發(fā)生[43]。有趣的是，野生型KRAS/NRAS/BRAF患者的HER2過度表達率為5%～14%[43]。HER2過表達也提示抗EGFR治療失敗。一項研究表明，可以用ctDNA非侵入性地檢測HER2的過度表達，并用于預(yù)測抗HER2靶向治療的療效[44]。在目前的免疫治療中，高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H）狀態(tài)的腫瘤對免疫檢查點抑制劑（ICBS）敏感，但該亞群中近一半的患者具有先天性抵抗力。Wnt/β-catenin通路的激活可導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)和對ICBS的抵抗。最近的研究表明，同樣對ICBS耐藥的MSI-H患者存在RNF43突變和APC或CT-NNB1的額外突變。有研究還表明，Wnt/β-catenin通路的激活促進了耐藥機制[45]。對ctDNA的分析以確定耐藥機制，突出了液體活檢的臨床潛力。系列ctDNA分析可以識別組織活檢種沒有捕捉到的繼發(fā)性耐藥機制，同時預(yù)測治療失敗的時間和原因。這些分析對指導(dǎo)臨床治療策略有重要意義。

3 展望

CRC的發(fā)生發(fā)展是一個從良性腺瘤到浸潤性癌的表觀遺傳和結(jié)構(gòu)修飾的綜合過程。早期發(fā)現(xiàn)并在內(nèi)窺鏡下完全切除腺瘤是生存的關(guān)鍵，這樣腫瘤發(fā)展的概率幾乎為零。ctDNA已經(jīng)被FDA批準為CRC的診斷標志物，具有廣闊的前景。但仍然存在著許多未解決的問題：（1）難以從cfDNA中分離出特定的ctDNA片段;（2）當ctDNA提示高復(fù)發(fā)風(fēng)險，但影像學(xué)檢查未提供明顯的證實，是否需要強化治療。毋庸置疑，ctDNA的主要優(yōu)勢在于它為精密醫(yī)學(xué)提供了更好的指標，并且擺脫了腫瘤組織活檢的局限性。此外，ctDNA可以進行非侵入性治療監(jiān)測，并可以為預(yù)后評估提供依據(jù)。隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，液體活檢必將在CRC的診斷和治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

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（收稿日期：2020-08-24） （本文編輯：田婧）