酶法提取淡水魚內(nèi)臟魚油的工藝優(yōu)化

顧盼祺，魏曉倩，趙利，陳麗麗，江勇，白春清，袁美蘭

(江西科技師范大學 生命科學學院，國家淡水魚加工技術研發(fā)分中心(南昌)，南昌 330013)

淡水魚是一種營養(yǎng)豐富、蛋白質(zhì)含量高的水產(chǎn)食物，是我國人民日常生活飲食的主要蛋白質(zhì)來源之一。目前大多數(shù)淡水魚的加工僅局限在利用魚體肌肉，比如魚片、冷凍魚糜、魚丸等的生產(chǎn)，而對魚內(nèi)臟、魚頭、魚骨、魚皮、魚鱗等下腳料的加工利用較少。據(jù)有關統(tǒng)計，我國每年淡水魚副產(chǎn)物產(chǎn)量超過250萬噸，除了一

小部分被加工成飼料外，絕大部分被直接丟棄，這必定會對環(huán)境造成一定污染，甚至引發(fā)疾病[1]。魚類加工副產(chǎn)物中普遍存在多種生物活性物質(zhì)，如膠原、糖胺聚糖、多不飽和脂肪酸、磷脂、維生素、酶、活性肽等[2]，因此具有一定的開發(fā)利用價值。對這類副產(chǎn)物進行深層次的加工處理，如用于生產(chǎn)魚油、魚露、內(nèi)臟鮮味醬、魚醬油等輔助食品[3-6]，既可以提高水產(chǎn)品加工的附加值，又可以避免直接丟棄而污染環(huán)境。

魚油富含ω-3系多不飽和脂肪酸，其具有較高的營養(yǎng)價值和保健功效[7]，并且魚油還可用于制備具有獨特風味的魚味香精等風味添加劑，滿足人們的飲食需求。因此魚油已成為近年來研究的熱點之一。但深海魚類資源有限，且其魚油提取成本高，所以淡水魚成為魚油提取的新選擇[8]。目前，魚油的提取方法主要有有機溶劑法、蒸煮法、淡堿水解法、酶解法和超臨界流體萃取法等[9-13]。其中，酶解法是魚油提取的主要方法之一，是利用蛋白酶對蛋白質(zhì)的水解作用，破壞蛋白質(zhì)和魚油的結(jié)合關系，從而釋放出魚油。相對于傳統(tǒng)淡堿水解法而言，酶法水解不但可以增產(chǎn)，還可充分利用酶法水解產(chǎn)生的蛋白酶水解產(chǎn)物，使資源得到充分利用。本研究通過酶解法來制備魚油，運用單因素試驗和正交試驗得出酶法提取魚油的最佳條件，旨在尋找一種從淡水魚內(nèi)臟中提取魚油的合適方法，期望能更簡便快速并且高效地處理魚內(nèi)臟，提高其經(jīng)濟價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮淡水魚內(nèi)臟；木瓜蛋白酶(800000 U/g)、堿性蛋白酶(200000 U/g)：北京索萊寶科技有限公司；中性蛋白酶(100000 U/g)：諾維信生物技術有限公司；鹽酸：西隴化工股份有限公司；氫氧化鉀：上海山浦化工有限公司。

1.2 試驗儀器

試驗儀器見表1。

表1 儀器列表Table 1 The list of instruments

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的前處理

去掉新鮮淡水魚內(nèi)臟的膽，剩余部分用蒸餾水清洗干凈并瀝干水后，放入高速組織搗碎機內(nèi)攪拌成糜狀，用保鮮袋封裝冷藏備用。

1.3.2 淡水魚內(nèi)臟酶解工藝

稱取20 g經(jīng)處理的淡水魚內(nèi)臟糜，放入錐形瓶中，加蒸餾水，調(diào)節(jié)pH，加入一定量蛋白酶粉末。在一定溫度下對其酶解一定時間后，進行滅酶處理，趁熱使用離心機在4500 r/min的速度下離心15 min，吸出上層魚油，稱取所得魚油的質(zhì)量。

1.3.3 魚油得率的計算

魚油得率(%)=提取魚油的質(zhì)量(g)/原料的質(zhì)量(g)×100%。

1.4 酶種類對淡水魚內(nèi)臟魚油得率的影響

選用3種蛋白酶(木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶)作為試驗用酶，在包裝標示的各自最適溫度和pH條件下進行酶解提取魚油。其他酶解條件為：酶加入量2%，料液比1∶1(原料∶蒸餾水)，酶解時間4 h，然后離心、收集魚油并稱重，計算得率，研究酶種類對魚油得率的影響。

1.5 單因素試驗

1.5.1 pH值對魚油得率的影響

以上述得到的最佳酶作為試驗用酶，在酶加入量2%，溫度50 ℃，料液比1∶1，酶解時間4 h的條件下，研究酶解pH為5，6，7，8，9時對魚油得率的影響。

1.5.2 酶解時間對魚油得率的影響

在酶加入量2%，溫度50 ℃，料液比1∶1以及1.5.1得到的pH值條件下，研究酶解時間為20，40，60，120，180，240，300 min時對魚油得率的影響。

1.5.3 酶解溫度對魚油得率的影響

在酶加入量2%，料液比1∶1以及前面得到的最佳pH值和酶解時間條件下研究酶解溫度為30，40，50，60，70 ℃時對魚油得率的影響。

1.5.4 酶添加量對魚油得率的影響

在前面得到的最佳pH值、酶解溫度和酶解時間以及料液比1∶1的條件下研究蛋白酶添加量在0.30%、0.60%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%時對魚油得率的影響。

1.5.5 料液比對魚油得率的影響

在前面得到的最佳pH值、酶解時間、酶解溫度和酶加入量條件下研究料液比為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶4時對魚油得率的影響。

1.6 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，將中性蛋白酶固定為水解酶，選擇pH、酶解溫度、酶解時間、料液比和加酶量為試驗因素，以淡水魚油得率為指標，根據(jù) L16(45)正交表進行正交試驗，優(yōu)化酶解條件。正交試驗因素與水平設計見表2。

表2 正交試驗因素與水平設計Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酶種類對淡水魚內(nèi)臟魚油得率的影響結(jié)果

由圖1可知，用不同蛋白酶酶解淡水魚內(nèi)臟，其對魚油得率的影響不同。由于不同酶對肽鍵的專一性不同，因此不同蛋白酶展現(xiàn)出的水解能力不同。用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶在各自的最佳酶活條件下酶解淡水魚內(nèi)臟的試驗中發(fā)現(xiàn)，中性蛋白酶的酶解效果最好，魚油得率最高，達29.23%；堿性蛋白酶的提取率最低，這與王正云等[14]在研究微波輔助酶法提取青魚內(nèi)臟魚油中，酶種類對魚油得率影響的試驗的結(jié)果基本一致。木瓜蛋白酶的提油率比中性蛋白酶的略低，但木瓜蛋白酶的價格較為昂貴，基本上是中性蛋白酶價格的2倍[15]，對應用于工業(yè)生產(chǎn)來講花費較高。因此，后續(xù)試驗選擇中性蛋白酶。

圖1 蛋白酶種類對魚油得率的影響

2.1.2 pH值對魚油得率的影響結(jié)果

由圖2可知，酶解pH在5～6范圍內(nèi)，魚油產(chǎn)量隨著pH值的升高而增加，表明pH升高可以促進蛋白水解，有利于魚油的釋放。當pH值為6時，魚油得率取得最高值，為30.82%；pH在6～7之間，魚油得率略有下降；pH為7時的魚油得率為29.61%，pH進一步增大，魚油得率則明顯下降。由此可見，不同酶其pH值適宜范圍不同，酶活性也會因此受到不同程度的影響，過酸或過堿均會引起酶活性降低，甚至導致酶不可逆性失活或者影響酶反應的動力學參數(shù)[16]。因此，選定酶法水解pH 為6。

圖2 pH值對魚油得率的影響

2.1.3 酶解時間對魚油得率的影響結(jié)果

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，魚油得率緩慢增長，原因是隨著酶解時間的增長，酶與底物反應充分，從而破壞了脂肪和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)關系。酶解4 h后，魚油得率達到最高點，王倩倩等[17]在羅非魚油的提取中，也證明酶與底物的反應隨著酶解時間的延長，提取出油脂的含量更高，然而，繼續(xù)酶解魚油得率開始下降，這可能是因為中性蛋白酶隨著時間的增加與底物接觸較為充分，基本達到平衡的作用狀態(tài)[18]。此外，淡水魚下腳料中提取的魚油在空氣中暴露的時間越長，魚油中的不飽和脂肪酸被氧化的越多，這不但會使魚油的品質(zhì)受到影響，而且會增加能源的消耗[19]。單因素方差分析后發(fā)現(xiàn)，酶解時間對魚油得率影響不顯著，即在所試驗的酶解時間內(nèi)，隨著酶解時間的增加，魚油得率變化不明顯(p>0.05)，但所提取的魚油的色澤由淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)樽睾稚姨崛◆~油的周期也越長。為了生產(chǎn)工藝經(jīng)濟效益最大化，故選定酶法水解20 min為宜。

圖3 酶解時間對魚油得率的影響

2.1.4 酶解溫度對魚油得率的影響結(jié)果

由圖4可知，魚油得率隨著酶解溫度的升高而逐漸升高，當酶解溫度為30～50 ℃范圍內(nèi)時，魚油得率升高明顯。當酶解溫度大于50 ℃時，魚油得率上升緩慢，這是由于溫度的升高加快了高分子熱運動，促使酶與底物更加充分地接觸，進而促進酶解，但溫度過高會使魚油的色澤加深，腥味變重，降低魚油的品質(zhì)。綜合考慮，酶法水解溫度以50 ℃為宜。

圖4 酶解溫度對魚油得率的影響

2.1.5 酶添加量對魚油得率的影響結(jié)果

由圖5可知，隨著酶添加量的增加，魚油得率呈先上升隨后略有下降的趨勢。當酶添加量小于1.5%時，魚油得率隨著酶添加量的增加而緩慢提高，當酶加入量大于1.5%時，隨著加酶量繼續(xù)增大，得率降低。其原因可能是加酶量不足1.5%時，底物未達到飽和，加酶量達到1.5%時底物已經(jīng)飽和，繼續(xù)增大加酶量對水解促進效果不佳，甚至導致部分酶喪失催化活性。張金哲等[20]研究以鯉魚內(nèi)臟為原料用酶解法提取油脂的試驗中，發(fā)現(xiàn)隨著酶添加量的不斷增加，提油率有先增長再下降的現(xiàn)象，這與本試驗結(jié)果相似。在酶添加量為0.3%～1.5%時，魚油得率差異不大(p>0.05)，因此，為了生產(chǎn)工藝經(jīng)濟效益最大化，最優(yōu)酶加入量為0.3%。

圖5 酶添加量對魚油得率的影響

2.1.6 料液比對魚油得率的影響結(jié)果

由圖6可知，當料液比為1∶1時魚油得率最佳，料液比持續(xù)增加，魚油得率反而逐漸下降?？赡苁堑~內(nèi)臟本身含水量較高，底物濃度相對較合適，增加料液比會增加水分的含量，使底物的濃度被稀釋，影響了酶解速度，酶解效果變差，從而降低了魚油得率。故選擇最適料液比為1∶1。

圖6 料液比對魚油得率的影響

2.2 酶解工藝的優(yōu)化

依照單因素試驗結(jié)果選擇pH、酶解時間、酶解溫度、酶添加量和料液比進行正交試驗，正交試驗結(jié)果分析和方差分析見表3。

表3 正交試驗數(shù)據(jù)及極差分析表Table 3 The orthogonal experimental data and range analysis

由表3極差分析可知，影響中性蛋白酶水解淡水魚內(nèi)臟提取魚油的各因素主次順序為B>C>A>E>D，即酶解時間>酶解溫度>pH>料液比>酶添加量。采用中性蛋白酶水解淡水魚內(nèi)臟提取魚油的最佳條件為A4B4C4D3E4，用酶解法提取魚油的最優(yōu)條件為：pH 7，酶解時間40 min，酶解溫度60 ℃，酶添加量0.50%，料液比(原料∶蒸餾水)1∶1.5。在以上最優(yōu)的條件下進行魚油提取的驗證試驗得到的魚油得率為35.67%。

3 結(jié)論

本文以淡水魚內(nèi)臟為原材料，以淡水魚魚油得率為指標，通過單因素試驗和正交試驗對酶法提取魚油的工藝條件進行優(yōu)化，得到了魚油提取的最佳工藝條件為：選擇中性蛋白酶，pH為7，酶解時間為40 min，酶解溫度為60 ℃，酶添加量為0.50%，料液比為1∶1.5。在最佳條件下，魚油得率可達35.67%。本研究結(jié)果為淡水魚內(nèi)臟的開發(fā)利用提供了一定的研究基礎。