傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜的顯微表征及其細(xì)菌群落多樣性分析

金華，呂嘉櫪，羅瀟

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，西安 710021)

傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜通過(guò)原料中攜帶的微生物進(jìn)行發(fā)酵[1-2]。目前國(guó)內(nèi)自然發(fā)酵蔬菜代表性的產(chǎn)品有四川涪陵榨菜、四川泡菜、東北酸菜、貴州辣椒醬以及以甘肅蘭州和陜西陜南為代表的漿水菜等[3-8]。傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜中包括乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌以及少量的其他菌群[9-12]。目前的研究報(bào)道發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮作用的主要是乳酸菌，發(fā)酵后期蔬菜產(chǎn)生乳酸、乙酸等擁有獨(dú)特風(fēng)味的物質(zhì)[13-15]。

目前對(duì)發(fā)酵蔬菜的研究主要集中在自然發(fā)酵過(guò)程中各個(gè)階段微生物菌群結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢(shì)菌群以及產(chǎn)品的感官品質(zhì)等方面[16-18]，通過(guò)顯微表征對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的研究主要集中在單個(gè)樣品或樣品中分離出來(lái)的單個(gè)菌株等方面[19-20]，其樣本量少，不能全面反映傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的微生物群落結(jié)構(gòu)，而且結(jié)合泡菜與漿水菜兩者相互對(duì)照的研究未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中微生物的菌群多樣性研究，多是選用分離、純化、鑒定這些傳統(tǒng)的方法，然而環(huán)境中能夠用來(lái)培養(yǎng)的微生物只能占到微生物總數(shù)的0.1%～10%[21]，傳統(tǒng)的分離純化培養(yǎng)方法不能真實(shí)全面地反映傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中微生物的菌群多樣性。魏本良等[22]通過(guò)高通量測(cè)序分析陜西地區(qū)漿水中細(xì)菌多樣性。張安等[23]采用構(gòu)建16S rRNA基因文庫(kù)的方法對(duì)四川泡菜的微生物多樣性進(jìn)行了分析，但對(duì)陜西地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中微生物的多樣性缺乏全面分析。

因此，本研究為揭示不同的陜西地區(qū)市售發(fā)酵蔬菜制品中菌群群落結(jié)構(gòu)的差異性，以具有代表性的19種陜西省西安市市售傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜為試驗(yàn)樣品，采用掃描電子顯微鏡與Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，對(duì)樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行研究，研究結(jié)果能夠應(yīng)用到發(fā)酵蔬菜新產(chǎn)品的研制，并且為產(chǎn)品的質(zhì)量控制與品質(zhì)提高提供了依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 供試樣品

在陜西西安的不同地區(qū)采集了19種市售傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜制品為供試樣品，其中15個(gè)樣品為泡菜(HBZ1、HBZ2、HBZ3、XYL1、LHL1、LHL2、LHL3、LHL4、LHL5、SXC1、SXC2、SXC3、SXC4、LHL6、YTQ2)，4個(gè)樣品為漿水菜(YTQ1、YTQ3、GLQ1、GLQ2)。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器與試劑見(jiàn)表1。

表1 主要儀器與試劑Table 1 The main instruments and reagent

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜樣品的顯微表征分析

選取19份發(fā)酵蔬菜樣品，通過(guò)掃描電鏡觀察其發(fā)酵液中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和附著在菜體上細(xì)菌的形態(tài)數(shù)量。

1.3.1.1 發(fā)酵液的顯微表征分析

顯微表征采用掃描電子顯微鏡觀察，方法如下[24]：

首先，對(duì)發(fā)酵蔬菜樣品進(jìn)行前處理：將發(fā)酵液用離心機(jī)離心10 min，離心機(jī)轉(zhuǎn)速調(diào)至6000 r/min，只取沉淀物，然后繼續(xù)倒入發(fā)酵液離心(條件與上述相同)，經(jīng)過(guò)數(shù)次離心使得離心管底剩余更多的細(xì)菌沉淀物。

續(xù) 表

隨后進(jìn)行固定：將上一步操作的管底沉淀用已經(jīng)配制好的戊二醛溶液(2.5%)固定至少2 h，固定操作后再繼續(xù)離心10 min(6000 r/min)，只取沉淀物。

然后清洗：用現(xiàn)配的磷酸緩沖液(pH 7.2，0.1 mol/L)間隔20 min洗滌3次。每次洗滌完成后對(duì)其離心(離心條件同上)，只保留管內(nèi)沉淀物。

后續(xù)對(duì)其脫水：選取的方法為乙醇梯度脫水，對(duì)離心物按照濃度由小到大(30%、70%、100%)進(jìn)行脫水，將其在每種濃度中間隔20 min脫水3次，每次脫水操作后都要進(jìn)行離心，離心條件不變。

干燥：將管內(nèi)沉淀物置于干燥箱，50 ℃烘干。

噴金：通過(guò)真空鍍膜設(shè)備對(duì)干燥后的樣品鍍金以便于后續(xù)在掃描電鏡下觀察。

最后進(jìn)行觀察分析：將經(jīng)過(guò)一系列處理后的樣品置于掃描電鏡下觀察。

1.3.1.2 發(fā)酵菜體的顯微表征分析

發(fā)酵蔬菜樣品前處理：使用消毒鉗取少量待測(cè)樣品。后續(xù)步驟同上述發(fā)酵液的顯微表征分析步驟。

1.3.2 傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

上述對(duì)19個(gè)樣品進(jìn)行顯微表征的觀察分析，得出觀察分析結(jié)果，從中選5個(gè)細(xì)菌群落多樣的發(fā)酵蔬菜制品，并對(duì)其進(jìn)行群落多樣性分析。對(duì)5個(gè)樣品的總基因組進(jìn)行提取，并針對(duì)16S rRNA V3+V4 區(qū)基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)Illumina MiSeq高通量測(cè)序分析研究各個(gè)樣品中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 19種傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜的顯微表征

2.1.1 發(fā)酵液的顯微表征

對(duì)19個(gè)發(fā)酵蔬菜的發(fā)酵液進(jìn)行顯微表征觀察，蔬菜中的營(yíng)養(yǎng)成分與其中的微生物菌群相互作用，從而使得發(fā)酵蔬菜產(chǎn)生各種功能性成分并且還會(huì)產(chǎn)生各種風(fēng)味物質(zhì)。各樣品發(fā)酵液中的菌體形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 19個(gè)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜發(fā)酵液中菌群的顯微表征

19個(gè)傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜樣品中有15個(gè)泡菜樣品和4個(gè)漿水菜樣品，泡菜樣品中樣本號(hào)HBZ1發(fā)酵液中的優(yōu)勢(shì)菌群為球菌，根據(jù)形態(tài)初步判斷是雙球菌，而發(fā)酵液中也存在少量形態(tài)不同的桿菌，總體而言，菌群不復(fù)雜。樣本號(hào)HBZ2、HBZ3發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌群為桿菌，其中樣本號(hào)HBZ2發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌群為桿菌，而樣本號(hào)HBZ3發(fā)酵液中菌群相對(duì)復(fù)雜，有桿菌且有球菌，但桿菌所占比例要高于球菌。樣本號(hào)XYL1、YTQ2發(fā)酵液中不僅有桿菌還觀察到了酵母菌，因此菌群相對(duì)較復(fù)雜。樣本號(hào)LHL1、LHL2發(fā)酵液中比較前幾個(gè)樣品更為復(fù)雜，菌群包括了球菌、桿菌以及酵母菌，球菌在數(shù)量上要多于桿菌和酵母菌。樣本號(hào) LHL3、SXC4發(fā)酵液中包括球菌和酵母菌，球菌多于酵母菌，根據(jù)查閱相關(guān)圖片資料以及對(duì)這兩個(gè)樣品中酵母菌的形態(tài)描述進(jìn)行分析，其與釀酒酵母的形態(tài)比較符合，其中樣本號(hào)SXC4發(fā)酵液中只觀察到了球菌，由菌體形態(tài)判斷其為雙球菌。樣本號(hào)LHL4發(fā)酵液中菌群以球菌為主，由菌體形態(tài)判斷其為四聯(lián)球菌。樣本號(hào)SXC1發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌群為球菌，除了球菌還觀察到了數(shù)量較多的酵母菌，樣本號(hào)SXC2發(fā)酵液中包括球菌、桿菌和酵母菌，球菌所占比例大于桿菌和酵母菌。樣本號(hào)SXC3發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌群為球菌，但是菌群較為復(fù)雜，通過(guò)觀察形態(tài)，發(fā)現(xiàn)其中包括單球菌、雙球菌以及四聯(lián)球菌，還觀察到數(shù)量較少的桿菌。樣本號(hào)LHL5、LHL6發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌群為酵母菌，其中球菌所占比例相對(duì)較高。漿水菜樣品中樣本號(hào)YTQ1、YTQ3發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌群為桿菌，樣本號(hào)GLQ1、GLQ2發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌群則為酵母菌。19個(gè)傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜樣品中漿水菜發(fā)酵液中的菌群較泡菜樣品復(fù)雜。主要以球菌和桿菌數(shù)量居多，但大多數(shù)樣品發(fā)酵液中都存在酵母菌。總的來(lái)說(shuō)，不同樣品中的菌體種類、形態(tài)各不相同。

2.1.2 菜體表面顯微表征

環(huán)境中的一些微生物具有一定的粘附力，而發(fā)酵蔬菜的菌群包括發(fā)酵液中存在的和附著在菜體表面的菌群。顯微表征19個(gè)樣品菌群在菜體表面的存在情況見(jiàn)圖2。

圖2 19個(gè)市售傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜在菜體表面的顯微表征

由圖2可知，發(fā)酵蔬菜樣品中的泡菜樣品樣本號(hào)HBZ1、LHL3、LHL4的菜體上能明顯看到附著一些球菌。其中觀察樣本號(hào)HBZ1菜體上的球菌鑲嵌在菜體表面，通過(guò)形態(tài)分析其應(yīng)為單球菌。而樣本號(hào)LHL3在菜體表面上可看到許多球菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)分析其包括單球菌和雙球菌，其中在樣本號(hào)LHL4的菜體表面觀察到許多堆積在一起的球菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)分析其應(yīng)為四聯(lián)球菌。樣本號(hào)SXC3、YTQ2菜體表面看到一些桿菌，樣本號(hào)SXC4菜體表面能夠觀察到球菌，包括單球菌與四聯(lián)球菌。樣本號(hào)LHL6菜體表面則附著了大量的酵母菌，剩余的樣品(樣本號(hào)XYL1、HBZ2、HBZ3、SXC1、SXC2、LHL1、LHL2、LHL5)菜體表面很少觀察到附著的菌體。而漿水菜樣品中樣本號(hào)GLQ1、GLQ2菜體表面也可以觀察到附著的一些酵母菌，樣本號(hào)YTQ1、YTQ3菜體表面則很少能看到附著的菌體。總體而言，19個(gè)傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜樣品中發(fā)酵液中的菌群相對(duì)較菜體表面的豐富，而漿水菜中的菌群較泡菜中的菌群豐富，通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中存在一些球菌和酵母菌具有一定的粘附力，因此可以附著在菜體表面[25]。

2.2 細(xì)菌群落多樣性

以上述19個(gè)樣品進(jìn)行顯微表征的觀察分析結(jié)果中選擇5個(gè)細(xì)菌群落多樣的發(fā)酵蔬菜制品，分別為樣本號(hào)HBZ1、HBZ2、LHL2、LHL5、LHL6，通過(guò)Illumina MiSeq高通量測(cè)序分析研究各個(gè)樣品中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。

2.2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

分別提取5個(gè)細(xì)菌群落多樣的發(fā)酵蔬菜制品的總基因組，然后利用PCR擴(kuò)增其16 S rRNA V3+V4 區(qū)基因片段，其中瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 5個(gè)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜樣品細(xì)菌基因組PCR產(chǎn)物電泳圖

由圖3可知，PCR擴(kuò)增的目的是為了保證合適的濃度，使得后續(xù)的試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。在250～500 bp之間所對(duì)應(yīng)的位置可以看到5個(gè)發(fā)酵蔬菜制品都有明顯的條帶，說(shuō)明PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確，濃度合適，可以繼續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 細(xì)菌群落α-群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

5個(gè)菌群豐富的樣品細(xì)菌α-群落結(jié)構(gòu)多樣性分析見(jiàn)表2。

表2 5個(gè)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)Table 2 The diversity indexes of bacterial community structure of 5 traditional fermented vegetable samples

由表2可知，所選擇測(cè)試的5個(gè)菌群豐富的樣品，其中樣本號(hào)HBZ2菌群豐度指數(shù)在所有測(cè)試的5個(gè)樣品中最高，菌群豐度指數(shù)由高到低依次為樣本號(hào)HBZ2、HBZ1、LHL2、LHL6和LHL5。為反映每個(gè)樣品中細(xì)菌群落的真實(shí)情況，本次測(cè)序深度均不低于0.997。測(cè)試結(jié)果反映出細(xì)菌群落豐富，多項(xiàng)指數(shù)對(duì)比表現(xiàn)出明顯的差異。

圖4 5個(gè)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜樣品在屬的水平上的細(xì)菌組成

5個(gè)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜樣品在屬水平上的細(xì)菌組成有65個(gè)屬，此外，還存在4株無(wú)法培養(yǎng)的菌株。在這65個(gè)屬中主要為乳桿菌屬(Lactobacillus)和片球菌屬(Pediococcus)菌群豐度指數(shù)比較高。乳桿菌屬在樣本號(hào)HBZ1中的豐度為35.70%，在樣本號(hào)HBZ2中的豐度為83.36%，在樣本號(hào)LHL2中的豐度為89.24%，在樣本號(hào)LHL5中的豐度為95.03%，在樣本號(hào)LHL6中的豐度為94.83%，片球菌屬在樣本號(hào)HBZ1中的豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其余4個(gè)樣品，豐度為59.59%，其余樣品的豐度：樣本號(hào)HBZ2中的豐度為1.60%，樣本號(hào)LHL2中的豐度為2.19%，樣本號(hào)LHL6中的豐度為2.94%，其中樣本號(hào)LHL5中的豐度最低，為1.04%。此外，還在樣本號(hào)HBZ2中檢測(cè)出了豐度相對(duì)較高的假單胞菌屬(Pseudomonas，豐度為2.04%)、擬桿菌屬(Bacteroides，豐度為1.54%)和泛生菌屬(Pantoea，豐度為1.44%)。在樣本號(hào)LHL5中檢測(cè)出豐度相對(duì)較高的海細(xì)菌屬(Marinobacterium)，豐度為2.67%。在樣本號(hào)LHL6中檢測(cè)出豐度相對(duì)較高的水螺菌屬(Aquaspirillum)，豐度為1.05%。此外，還檢測(cè)到豐度較低的弓形菌屬、硫桿菌屬、食堿菌屬、棒狀桿菌屬、類芽孢桿菌屬、雙歧桿菌屬、希瓦氏菌屬、硝化螺旋菌屬、鹽單胞菌屬、魏斯氏菌屬、羅氏菌屬等。

由圖5可知，5個(gè)樣品細(xì)菌各屬的豐度存在明顯差異，圖中右側(cè)是屬名，表示不同的屬，隨著豐度指數(shù)不斷增加，其顏色由藍(lán)色逐漸過(guò)渡到紅色，顏色不同表示豐度不同。不同屬在不同的樣品中所占的比例各不相同。其中乳桿菌屬在5個(gè)樣品中所占的比例都較高，而樣本HBZ1中片球菌屬的顏色要略深于乳桿菌屬，在其余4個(gè)樣本中乳桿菌屬的顏色最深，為優(yōu)勢(shì)菌屬。而且通過(guò)顏色塊分析乳桿菌屬在樣本LHL5中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

圖5 5個(gè)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜樣品細(xì)菌核心屬及其分類水平熱圖Fig.5 The heat map of bacterial core genera and their classification level in 5 traditional fermented vegetable samples

由圖6可知，在屬水平，樣本的聚類樹(shù)由兩個(gè)分枝組成，其中一枝由樣本HBZ1與LHL6組成，而另一枝由樣本HBZ2、LHL2、LHL5組成，處于同一枝的樣本，說(shuō)明其菌群構(gòu)成在屬分類水平上相似，所以樣本HBZ1和LHL6的菌群構(gòu)成相似，而樣本HBZ2、LHL2、LHL5的菌群構(gòu)成相似。

圖6 屬水平下樣本聚類樹(shù)與柱狀圖組合分析圖

圖7 5個(gè)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜樣品在種的水平上的細(xì)菌組成Fig.7 The bacterial composition of 5 traditional fermented vegetable samples at the species level

樣本在種水平上的細(xì)菌組成分為40個(gè)種，整體而言，5個(gè)樣本中除了樣本HBZ1的優(yōu)勢(shì)菌不同于其他4個(gè)樣本，其余樣本的優(yōu)勢(shì)菌比較統(tǒng)一。不可培養(yǎng)的乳桿菌(unculturedLactobacillussp.)在樣本HBZ2、LHL2、LHL5中的豐度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于樣本HBZ1、LHL6中的豐度，在樣本HBZ1中菌群豐度指數(shù)為3.57%，在樣本HBZ2中菌群豐度指數(shù)為50.74%，在樣本LHL2中菌群豐度指數(shù)為40.69%，在樣本LHL5中菌群豐度指數(shù)為52.66%，在樣本LHL6中菌群豐度指數(shù)為9.72%。片球菌屬未知種(Pediococcusethanolidurans)在樣本HBZ1中的豐度要明顯高于其余樣本，在樣本HBZ1中菌群豐度指數(shù)為59.59%，在樣本HBZ2中菌群豐度指數(shù)為1.60%，在樣本LHL2中菌群豐度指數(shù)為2.19%，在樣本LHL5中菌群豐度指數(shù)為1.04%，在樣本LHL6中菌群豐度指數(shù)為2.94%。一株未鑒定菌(unidentified)在5個(gè)樣本中豐度所占比例都較高，在樣本HBZ1中菌群豐度指數(shù)為30.01%，在樣本HBZ2中菌群豐度指數(shù)為37.03%，在樣本LHL2中菌群豐度指數(shù)為49.00%，在樣本LHL5中菌群豐度指數(shù)為42.85%，在樣本LHL6中菌群豐度指數(shù)為84.64%。除此之外，檢測(cè)到的一些希瓦氏菌、紅串紅球菌、奧斯陸莫拉菌、糞產(chǎn)堿菌、Aeromonascaviae、芽孢桿菌、短黃桿菌、短乳桿菌等豐度比較低的菌種。

2.2.3 核心OTU在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)結(jié)果

5個(gè)傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜樣品一共分出了113個(gè)OTU，選擇其中豐度較高的4個(gè)OTU ，根據(jù)其在5個(gè)樣本中的豐度占比與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Nucleotide blast 比對(duì)及相似性搜索，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 OTU1～OTU4 16S V3+V4區(qū)序列比對(duì)結(jié)果Table 3 OTU1～OTU4 16S V3+V4 sequence alignment results

由表3可知，最后的比對(duì)結(jié)果顯示4個(gè)OUT分別為耐酸乳桿菌、乙醇片球菌、布氏乳桿菌和植物乳桿菌，其中耐酸乳桿菌、乙醇片球菌和植物乳桿菌具有100%的相似性，而布氏乳桿菌的相似性也達(dá)到了99%。結(jié)果與顯微表征的分析相符合，鑒定出豐度較高的4個(gè)優(yōu)勢(shì)菌種，其中只有植物乳桿菌在發(fā)酵蔬菜中比較常見(jiàn)，而這種耐酸桿菌通常出現(xiàn)在酸度較高的發(fā)酵后期。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)19個(gè)傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜樣品的顯微表征和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性進(jìn)行分析研究，結(jié)果表明：19個(gè)樣本的顯微表征形態(tài)各異，具有顯著差異，菌群結(jié)構(gòu)各不相同，泡菜樣品中菌群結(jié)構(gòu)相對(duì)單一，而漿水菜樣品中菌群結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜。發(fā)酵液中細(xì)菌菌群的種類和數(shù)量都較菜體上豐富。利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其中5個(gè)菌群豐富的發(fā)酵蔬菜樣本進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)樣本中細(xì)菌的屬所占的豐度各不相同，乳桿菌屬的豐度值在除樣本HBZ1之外的4個(gè)樣本中遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于豐度值低的菌屬，而在樣本HBZ1中主要為乳桿菌屬和片球菌屬，其中片球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)鑒定出的4個(gè)優(yōu)勢(shì)菌中只有植物乳桿菌常見(jiàn)于研究資料中，而且4個(gè)優(yōu)勢(shì)菌種在5個(gè)樣本中的豐度要遠(yuǎn)高于豐度低的菌種。