分子即時(shí)檢驗(yàn)(POCT)在病毒性呼吸道感染疾病診斷中的應(yīng)用前景

劉 芳，牛亞倩，常鈺玲，宋艷梅，陳 徹，楚惠媛，李鵬杰

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

近年來，病毒性呼吸道感染是引起全球感染性疾病中發(fā)病率和病死率較高的原因之一，其中包括甲型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠狀病毒等。分子即時(shí)檢驗(yàn)(POCT，point-of-care testing)具有快速、準(zhǔn)確、方便、可靠等優(yōu)點(diǎn)，逐漸用于呼吸道病原體的診斷，可縮短患者住院時(shí)間，減少不必要的抗菌藥物使用，對(duì)于患者病情診療及預(yù)后具有重要意義。本文主要介紹病毒性呼吸道感染POCT的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀及前景，為臨床病毒性呼吸道感染診斷提供參考依據(jù)。

1 病毒性呼吸道感染疾病的現(xiàn)狀

呼吸道感染疾病是致病微生物侵入呼吸道進(jìn)行繁殖，并引起相應(yīng)癥狀的一類疾病[1]，病毒是急性呼吸道疾病中最常檢測到的病原體[2]。成人病毒性呼吸道感染疾病的住院率為(5～20)/100 000[3]，高齡患者甚至高達(dá)1 200/100 000，其中流感病毒會(huì)產(chǎn)生季節(jié)性流感，可導(dǎo)致住院人數(shù)激增并且容易引起老年人死亡[4]。此外，病毒性感染并發(fā)癥也通?？梢鹱≡郝屎筒∷缆试龈?，如肺炎、病毒性心肌炎、病毒性腦炎和潛在的心肺疾病惡化癥[5-6]。

常見的流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、人間質(zhì)肺病毒和冠狀病毒均會(huì)引起急性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘急性加重以及其他急性呼吸道疾病[7]。除急性呼吸性疾病外，病毒性呼吸道感染還可能表現(xiàn)為失代償心血管疾病、糖尿病緊急情況等[8]，導(dǎo)致大規(guī)模的住院治療，并給醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來重大的負(fù)擔(dān)。而在呼吸道病毒的診治過程中，僅有少部分患者能被正確、快速診斷為某種病毒感染[9]。

2 POCT的概述

POCT具有即時(shí)檢驗(yàn)、床旁檢驗(yàn)、就地檢驗(yàn)等含義，指臨床實(shí)驗(yàn)室外，臨近或在患者護(hù)理現(xiàn)場直接進(jìn)行標(biāo)本檢測、分析，現(xiàn)也包括患者的家庭自我監(jiān)測[10]。POCT能夠就近、快速地提供結(jié)果，醫(yī)務(wù)人員可以根據(jù)檢測結(jié)果盡快采取措施。經(jīng)時(shí)間的推進(jìn)和技術(shù)的發(fā)展，POCT快速檢測、方便攜帶、容易使用的特點(diǎn)對(duì)醫(yī)療、護(hù)理和實(shí)驗(yàn)室工作人員都具有強(qiáng)大吸引力。

POCT關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素是樣本被送到臨床實(shí)驗(yàn)室時(shí)可能會(huì)延遲臨床決策。有研究[11]評(píng)估POCT和臨床實(shí)驗(yàn)室檢測的區(qū)別，對(duì)急診患者標(biāo)本分別行上述兩種檢測，發(fā)現(xiàn)相比臨床實(shí)驗(yàn)室檢測，POCT可縮短結(jié)果檢測時(shí)間和患者就診時(shí)間。POCT比臨床傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測在時(shí)間上更具有優(yōu)勢，且POCT的使用將減少部分臨床鑒別診斷和治療決策所用的時(shí)間，對(duì)患者預(yù)后具有重要意義。在當(dāng)代社會(huì)，隨著POCT可檢測的項(xiàng)目不斷增多，質(zhì)量的不斷進(jìn)步，設(shè)備的不斷更新完善，其在呼吸道感染的診斷及治療中日益發(fā)揮重要作用。

3 病毒性呼吸道感染的檢測方法

病毒性呼吸道感染的檢測方法主要分為常規(guī)檢測和FilmArray呼吸道測試條檢測。常規(guī)病原檢測主要為分離培養(yǎng)、血清學(xué)、分子生物學(xué)等方法，結(jié)果可靠，但耗時(shí)較長，延遲臨床決策。近年來，新興設(shè)備利用分子技術(shù)，在足夠小的POCT設(shè)備中快速檢測呼吸道病原體，如FilmArray呼吸道測試條，其可靠性、實(shí)用性和準(zhǔn)確度均能滿足臨床診斷，在提高病原體檢出率及患者個(gè)性化治療方面發(fā)揮重要作用。

3.1 常規(guī)檢測 流感快速診斷試驗(yàn)和其他呼吸道病毒檢測一樣，均是基于抗原檢測鼻咽樣品，但是在成人檢測中其靈敏度僅50%。基于抗原試驗(yàn)的敏感度差，限制了此類試驗(yàn)在臨床上的應(yīng)用，且不能減少臨床上對(duì)抗菌藥物的使用[12-13]。此外，常規(guī)病原學(xué)鑒定和培養(yǎng)是病原學(xué)診斷的基礎(chǔ)，但其耗時(shí)長且結(jié)果滯后，易延誤臨床決策，難以滿足臨床需要。目前，用于呼吸道病毒檢測的黃金診斷試驗(yàn)是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，該方法具有高敏感性和高特異性，且不受患者感染時(shí)間和免疫功能的限制，但PCR試驗(yàn)操作繁瑣，結(jié)果易受檢測環(huán)境影響，周轉(zhuǎn)時(shí)間至少為24 h,且需要專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)施和專業(yè)知識(shí)[14]。

3.2 POCT-FilmArray呼吸道測試條 最近開發(fā)的新的快速分子檢測方法包括FilmArray呼吸道測試條[15]。FilmArray呼吸道檢測系統(tǒng)是經(jīng)美國及歐洲食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)、有CE-IVD標(biāo)記的多重巢式PCR以及自動(dòng)化體外診斷系統(tǒng),該檢測系統(tǒng)集樣品制備、擴(kuò)增、檢測和分析功能于一體，作為體外診斷(IVD)設(shè)備，現(xiàn)已在國外大量投入臨床使用。FilmArray可以靶向20種病原體，包括17種病毒(及其亞型)和3種非典型病原體，包括甲型流感病毒(H1亞型、H1-2009亞型、H3亞型)、乙型流感病毒、腺病毒、冠狀病毒(HKU1、NL63、229E、OC43)、人類肺病毒、人類鼻病毒/腸病毒、副流感病毒(1型、2型、3型、4型)和呼吸道合胞病毒(RSV)，并能檢測出3種非典型病原體包括百日咳鮑特菌、肺炎衣原體和肺炎支原體[16-17]。該測定過程始于將300 mL未處理的生物/臨床樣品加入反應(yīng)盒中，進(jìn)行核酸提取、純化、反轉(zhuǎn)錄和多重聚合酶鏈反應(yīng)、熔解曲線分析，最后是單個(gè)PCR階段。該儀器與軟件連接，實(shí)時(shí)分析熔解曲線變化與熒光曲線變化。該系統(tǒng)通過分析樣品擴(kuò)增的DNA熔解曲線，從相應(yīng)的擴(kuò)增中自動(dòng)識(shí)別病原體，最終報(bào)告每種病原體的陰性或陽性結(jié)果[18]。見圖1。

FilmArray呼吸道檢測系統(tǒng)綜合檢測陽性率高達(dá)90%以上，且其檢測靈敏度和特異度高達(dá)95%以上。與病原體培養(yǎng)鑒定和傳統(tǒng)PCR法相比，F(xiàn)ilmArray 呼吸道檢測系統(tǒng)檢測速度快、檢測結(jié)果基本一致[18-19]。FilmArray 檢測手工操作耗時(shí)2 min，最后報(bào)告結(jié)果僅用1 h，在新生兒或感染百日咳鮑特菌的患者中，可以減少病原體的傳播概率，有助于快速將患者隔離[20]。國內(nèi)一項(xiàng)研究[21]表明，F(xiàn)ilmArray檢測肺炎支原體陽性的標(biāo)本，經(jīng)PCR 檢測也均為陽性；FilmArray檢測肺炎支原體陰性但血清學(xué)陽性的標(biāo)本或均為陰性的標(biāo)本，經(jīng)PCR檢測均為陰性，說明FilmArray呼吸道檢測和PCR法一致性較好。

操作說明：將水合溶液和未知樣本加入1號(hào)試劑管中，F(xiàn)ilmArray工具依次進(jìn)行提取和純化核酸、反轉(zhuǎn)錄和多重聚合酶鏈反應(yīng)。使用端點(diǎn)熔解曲線數(shù)據(jù)，F(xiàn)ilmArray軟件自動(dòng)為每個(gè)目標(biāo)生成結(jié)果。其中1號(hào)孔中為控制物質(zhì)(裂殖酵母)，2、3、4、5號(hào)孔中均為清洗緩沖液，6號(hào)孔為核酸清洗緩沖液，7號(hào)孔為逆轉(zhuǎn)錄/第一階段PCR預(yù)混液，8號(hào)孔為稀釋緩沖液，9、10號(hào)孔為第二階段PCR預(yù)混液，11號(hào)孔空、12號(hào)孔為第二階段PCR混合物的溢流容器[18]。

呼吸道病毒感染往往不是單一的病毒感染，可合并其他病原體感染。研究[22]發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體感染在兒童中的患病率最高，其中以肺炎支原體合并呼吸道合胞病毒感染最為常見，因此對(duì)呼吸道感染患者的檢測不能僅僅局限于某個(gè)病毒的檢測，也要考慮混合感染的可能，F(xiàn)ilmArray可檢測20種呼吸道病原體，能更高效的檢測患者感染的病原體種類。此外，在患有急性呼吸道疾病患者中，病毒是最常見的可檢測病原體，雖然可能存在普遍使用抗菌藥物的現(xiàn)象，但是檢測出細(xì)菌比病毒的概率要低?？咕幬镞^度使用的部分原因是急性呼吸道疾病病原體的不確定性，因此，可以通過FilmArray檢測早期識(shí)別病原體，從而減少抗菌藥物的過度使用。臨床研究[23]表明，使用FilmArray可縮短抗菌藥物使用的持續(xù)時(shí)間、患者住院時(shí)間和隔離時(shí)間。

FilmArray檢測相比其他檢測方法更有優(yōu)勢。一項(xiàng)大型兒童醫(yī)院FilmArray檢測評(píng)估[24]結(jié)果顯示，F(xiàn)ilmArray比直接免疫熒光法具有更高的敏感性。一項(xiàng)國外研究[25]收集315份急性呼吸道感染患者的呼吸道樣本，用免疫熒光法和FilmArray檢測法分別檢測8種呼吸道病毒，檢測結(jié)果顯示陽性率分別為75%和92%，兩種方法陽性一致率為70.5%，陰性一致率為99.6%。雖然診斷呼吸道病毒最常用的方法仍然是免疫熒光法，但將分子方法納入常規(guī)程序?qū)⒋蟠筇岣吒腥镜脑\斷率。FilmArray檢測還能夠檢測其他病毒，如冠狀病毒NL63、229E、OC43、HKU1和博卡病毒[26]，由此可知FilmArray檢測優(yōu)于傳統(tǒng)的免疫熒光法。雖然多重PCR也可以同時(shí)檢測多種呼吸道病毒，但FilmArray檢測操作更簡單、檢測時(shí)間更短、檢測混合病毒感染的敏感性更高[27]。

綜上所述，F(xiàn)ilmArray檢測為呼吸道感染的早期診斷提供了一種很好的檢測方法,可以幫助臨床醫(yī)生快速診斷病毒性呼吸道感染性疾病，有助于合理地應(yīng)用抗病毒藥物,減少抗菌藥物濫用以及減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

4 總結(jié)與展望

呼吸道感染性疾病嚴(yán)重危害著中老年人及兒童的健康?？焖偌皽?zhǔn)確地檢出病原體，對(duì)患者個(gè)性化治療及預(yù)后有著重要作用。病原體培養(yǎng)及常規(guī)PCR檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高，但耗時(shí)較長，POCT能夠簡化操作環(huán)節(jié)，縮短檢測時(shí)間，能夠快速、有效地診斷呼吸道感染性疾病，該技術(shù)是當(dāng)前轉(zhuǎn)化研究的熱點(diǎn)，不斷更新迭代。其中FilmArray呼吸道檢測能提高呼吸道病原體的檢出率，有助于合理使用抗病毒藥物，減少不必要的抗菌藥物使用，為早期診斷及治療提供良好的依據(jù)，將是以后醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)檢測呼吸道感染性疾病的重要手段之一。

雖然FilmArray可靠性、實(shí)用性和準(zhǔn)確性均能滿足臨床診斷需求，但是標(biāo)本采集方式不當(dāng)也會(huì)影響檢測結(jié)果，應(yīng)重視影響檢測結(jié)果的分析前因素，避免干擾；此外，由于每個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果還不能統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化，檢測項(xiàng)目的不同方法之間尚存在差異，因此，POCT檢測結(jié)果應(yīng)定期與臨床實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，確保醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)檢測結(jié)果的一致性；并且檢測人員應(yīng)經(jīng)過規(guī)范的培訓(xùn)，按照廠商規(guī)定的要求進(jìn)行操作，以保證檢測安全有效；最后還需要相關(guān)高質(zhì)量的臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)，以及質(zhì)量控制及臨床監(jiān)管。