特征真菌對噴氣燃料性質(zhì)的影響

蘇 鵬，牛明明，熊 云，谷科城，許天瑜，韓 森

(1.陸軍勤務(wù)學(xué)院，重慶 401311；2.解放軍第32726部隊;3.解放軍第92229部隊)

噴氣燃料在儲存過程中經(jīng)常會出現(xiàn)微生物污染問題[1-2]。微生物在噴氣燃料儲存過程中生長繁殖到一定程度，會對噴氣燃料的腐蝕性、潔凈性等產(chǎn)生一定影響，進(jìn)而影響油料儲供設(shè)施的使用壽命和用油裝備的使用安全[3-4]。目前關(guān)于微生物對噴氣燃料性質(zhì)影響的研究多是基于一種真菌展開，而實際噴氣燃料在儲存過程中會面臨多種微生物污染的情況，由微生物引起的噴氣燃料性質(zhì)變差也往往是多種菌群共同作用的結(jié)果[5-6]。此外，現(xiàn)階段關(guān)于微生物對噴氣燃料性質(zhì)的影響研究很少結(jié)合噴氣燃料中微生物的污染總量，且污染總量與噴氣燃料性質(zhì)衰變之間的關(guān)系也尚不明確。

本研究以課題組前期分離鑒定的噴氣燃料特征微生物為對象，依據(jù)我國噴氣燃料中特征真菌的豐度比構(gòu)建混合特征真菌，系統(tǒng)研究了噴氣燃料特征真菌對噴氣燃料外觀、總酸值、銀片腐蝕、水反應(yīng)試驗及燃料表面張力等指標(biāo)的影響；同時結(jié)合三磷酸腺苷(ATP)生物熒光檢測法，考察微生物污染總量與噴氣燃料質(zhì)量指標(biāo)之間的關(guān)系，為噴氣燃料微生物污染的日常監(jiān)控和預(yù)警提供依據(jù)。

1 實 驗

1.1 原料及儀器

3號噴氣燃料，取自中國石化鎮(zhèn)海煉化分公司；噴氣燃料特征真菌，枝孢霉菌(Amorphothecaresina)、互隔交鏈孢菌(Alternariaalternata)、局限青霉(Penicilliumrestrictum)、帚狀曲霉(Aspergilluspenicillioides)、毛殼屬(Chaetomiumglobosum)為課題組前期培養(yǎng)并鑒定過的真菌[5-6]。氫氧化鉀、異丙醇、甲苯、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀，分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司提供。ATP熒光檢測所用酶、裂解液、提取液均由德國Merck公司提供。

超凈工作臺ECO 1.2，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；快速自動高壓滅菌器SX-300，日本TOMY Digital Biology公司產(chǎn)品；循環(huán)水式多用真空泵SHB-ⅢA，鄭州市亞榮儀器有限公司產(chǎn)品；全自動表界面張力儀JYW-200C，承德鼎盛試驗機(jī)檢測設(shè)備有限公司產(chǎn)品；石油產(chǎn)品腐蝕試驗多用儀NJ-1A，南京陵武新技術(shù)應(yīng)用開發(fā)研究中心產(chǎn)品；純水儀Milli-Q，美國Millipore公司產(chǎn)品；ATP熒光檢測儀HY-LITE2，德國Merck公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)體系的構(gòu)建包括過濾燃料、復(fù)活菌種和構(gòu)建體系3步。

(1)過濾燃料。用0.22 μm濾膜過濾噴氣燃料，除去噴氣燃料中的微生物，并將過濾后的噴氣燃料裝至滅菌的1 L玻璃瓶中。

(2)復(fù)活菌種。在250 mL三角燒瓶中配制100 mL沙保氏液體培養(yǎng)基，并置于高壓滅菌器中滅菌20 min(121 ℃)；在超凈工作臺中，將平板培養(yǎng)基中保存的不同菌種分別接種至沙保氏液體培養(yǎng)基中，封口膜封口后置于水浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)3 天(30 ℃、170 rmin)，混合真菌菌液按枝孢霉菌、互隔交鏈孢菌、局限青霉、帚狀曲霉、球毛殼菌按體積比7∶6∶5∶3∶1配制，并置于潔凈的4 ℃冰箱中待用。

(3)構(gòu)建體系。在超凈工作臺內(nèi)，分別將700 mL 經(jīng)0.22 μm濾膜過濾的3號噴氣燃料和200 mL滅菌的Bushnell Haas培養(yǎng)基(簡稱BH培養(yǎng)基，配方為0.2 g硫酸鎂、0.026 5 g二水氯化鈣、1 g磷酸二氫鉀、1 g磷酸氫二銨、1 g硝酸鉀、0.083 g六水三氯化鐵溶入1 L去離子水中)加入滅菌的1 L廣口試劑瓶中，構(gòu)建適宜微生物生長的培養(yǎng)體系；在培養(yǎng)體系中加入1 mL震蕩培養(yǎng)3天(30 ℃、170 rmin)的菌液，然后置于30 ℃水浴中培養(yǎng)，分別于非檢測日的上午、下午和晚上將廣口瓶放置于敞開式搖床震蕩15 min(170 rmin)，并定期檢測相關(guān)指標(biāo)。設(shè)置空白培養(yǎng)體系(噴氣燃料和培養(yǎng)基體系)，并定期檢測相關(guān)指標(biāo)。從培養(yǎng)體系中加入菌液開始按第1天計。

1.2.2 培養(yǎng)體系外觀試驗過程中，每天在室溫、自然光線下觀察培養(yǎng)體系外觀情況，目測噴氣燃料及培養(yǎng)基的顏色變化、培養(yǎng)基和燃料界面現(xiàn)象變化、燃料相透明度變化、培養(yǎng)基是否有沉淀產(chǎn)生，并在取樣時判斷培養(yǎng)基和噴氣燃料氣味變化，判斷特征真菌生長繁殖情況和對噴氣燃料外觀的影響。

1.2.3 水相、油相表面張力試驗過程中，從第1天開始，每隔3天分別在油水界面上方和下方1～2 cm處各取30 mL噴氣燃料和20 mL培養(yǎng)基，按照GBT 22237—2008《表面活性劑 表面張力的測定》要求，采用吊環(huán)法分別檢測噴氣燃料和培養(yǎng)基表面張力，每次各測試3次，取平均值。

1.2.4 噴氣燃料總酸值試驗過程中，從第1天開始，每隔3天在油水界面上方1～2 cm處取30 mL噴氣燃料油樣，按照GBT 12574—1990《噴氣燃料總酸值測定法》，將噴氣燃料溶解于滴定溶劑中，以對-萘苯酚溶液作指示劑，用標(biāo)定好的氫氧化鉀異丙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，檢測噴氣燃料總酸值。

1.2.5 噴氣燃料水反應(yīng)試驗試驗過程中，從第1天開始，每隔3天在油水界面上方1～2 cm處取噴氣燃料油樣，根據(jù)GBT 1793—2008《航空燃料水反應(yīng)試驗法》規(guī)定，按磷酸鹽緩沖溶液與噴氣燃料按體積比1∶4的比例取樣進(jìn)行水反應(yīng)試驗，以水相體積變化、油水分離程度和油水界面現(xiàn)象反映噴氣燃料中表面活性物質(zhì)變化情況。

1.2.6 噴氣燃料銀片腐蝕試驗過程中，從第1天開始，每隔3天在油水界面上方1～2 cm處取噴氣燃料油樣，按照SHT 0023—1990《噴氣燃料銀片腐蝕實驗法》規(guī)定進(jìn)行銀片腐蝕試驗，檢測微生物生長繁殖過程中產(chǎn)生的活性硫化物。

1.2.7 噴氣燃料ATP含量測定試驗過程中，從第1天開始，每隔3天分別在油水界面上方和下方1～2 cm處各取50 mL噴氣燃料和10 mL培養(yǎng)基，按照下述方法檢測噴氣燃料和培養(yǎng)基中的ATP含量，分別監(jiān)控特征真菌在噴氣燃料和培養(yǎng)基中的生長情況。

(1)噴氣燃料ATP含量測定步驟如下：①取50 mL噴氣燃料至滅菌的100 mL高密度聚乙烯(HDPE)瓶中，并加入1 000 μL提取液，搖晃30 s，靜置5 min，然后用移液槍將藍(lán)色提取液移至5 mL離心管中。②用移液槍取500 μL提取液至另一個5 mL離心管中，并加入500 μL裂解液，蓋上蓋子，搖晃30 s，使裂解液和培養(yǎng)基充分混合。③用移液槍取50 μL裂解液和提取液的混合液至拭子管中，加入400 μL酶液，震蕩20 s，使提取液、裂解液混合液與酶液充分混合，然后將拭子管放入ATP檢測儀測試，每次測試3次，取平均值。

(2)培養(yǎng)基ATP含量測步定驟如下：①測試時，先用移液槍吸管取500 μL培養(yǎng)基至5 mL離心管中，再用移液槍取500 μL裂解液至離心管中與培養(yǎng)基混合，蓋上離心管蓋子后上下顛倒搖晃30 s，使裂解液和培養(yǎng)基充分混合。②用移液槍從離心管中取50 μL培養(yǎng)基和裂解液混合液至拭子管中，往拭子管中加入400 μL酶液，震蕩20 s，使培養(yǎng)基、裂解液混合液與酶液充分混合，然后將拭子管放入ATP檢測儀測試，每次測試3次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物對體系外觀的影響

外觀特性是檢查噴氣燃料質(zhì)量最直觀的方法，是國家標(biāo)準(zhǔn)GB 6537—2018《3號噴氣燃料》規(guī)定的第一個檢查項目，也是ASTM D6469—2014《燃料和燃料系統(tǒng)中微生物污染標(biāo)準(zhǔn)指南》規(guī)定的第一個檢查項目。GB 6537要求，合格的噴氣燃料在室溫下應(yīng)清澈透明，目視無不溶解水和固體物質(zhì)；ASTM D6469認(rèn)為，一旦在燃料和水之間存在第三相，或在任何一相中存在棕紅色至黑色物質(zhì)，或底部有大量沉淀，或底部樣(油水界面上方5 cm內(nèi))顏色、透明度等指標(biāo)與上部樣不同，則表明燃料系統(tǒng)中可能有大量微生物。試驗過程中，混合菌培養(yǎng)體系外觀變化如圖1所示。

圖1 混合菌培養(yǎng)體系外觀變化

由圖1可知：試驗開始時噴氣燃料和培養(yǎng)基均清澈透明，油水界面清晰可見，界面處沒有乳化物、帶狀物或泡沫；隨著真菌的生長繁殖，兩者不僅顏色逐漸變暗，尤其是培養(yǎng)基顏色變化更為明顯，而且油水界面處逐漸出現(xiàn)乳化物，從第7天起界面處局部出現(xiàn)塊狀泡沫，并且泡沫逐漸變大；在第22天時泡沫將油水界面完全覆蓋，并且界面處泡沫還向噴氣燃料和培養(yǎng)基中延伸生長。此時噴氣燃料已不符合GB 6537《3號噴氣燃料》對噴氣燃料外觀的要求。真菌在噴氣燃料中生長繁殖，不僅會影響噴氣燃料外觀，而且生成的泡沫和乳化物還可能會在使用中引起過濾器堵塞、計量系統(tǒng)失效等問題，影響噴氣燃料的正常供給。

2.2 微生物對兩相表面張力的影響

表面張力雖不是GB 6537—2018《3號噴氣燃料》要求的噴氣燃料檢測項目，但表面張力的變化能夠反映真菌生長繁殖過程中生成生物表面活性物質(zhì)的多少。ASTM D6469—2014《燃料和燃料系統(tǒng)中微生物污染的標(biāo)準(zhǔn)指南》規(guī)定，應(yīng)定期檢測儲罐底部水和近底部噴氣燃料表面張力，確定各自表面張力的變化，可以反映出蛋白質(zhì)、脂肪酸等生物表面活性物質(zhì)的變化，從而間接反映微生物生長情況。

隨著微生物的生長繁殖，培養(yǎng)基和噴氣燃料表面張力變化情況如圖2所示。由圖2可知，培養(yǎng)基和噴氣燃料表面張力均隨培養(yǎng)時間的延長總體呈下降趨勢，與初始噴氣燃料和培養(yǎng)基表面張力相比，混合菌培養(yǎng)體系中噴氣燃料表面張力下降了1.74%，培養(yǎng)基表面張力下降了16.17%，培養(yǎng)基表面張力較噴氣燃料表面張力下降更為明顯。

圖2 噴氣燃料和培養(yǎng)體系表面張力變化曲線

引起培養(yǎng)基和噴氣燃料表面張力下降的原因，可能是真菌在代謝過程中產(chǎn)生的生物表面活性物質(zhì)引起的。以烴類為碳源生長的微生物在生長代謝過程中會產(chǎn)生一些具有表面活性的兩性物質(zhì)，如糖類、多糖脂、脂肽等，這是微生物攝取烴類的機(jī)理決定的[7-8]。

2.3 微生物對噴氣燃料總酸值的影響

總酸值是反應(yīng)噴氣燃料中酸性物質(zhì)(主要指高分子有機(jī)酸)總含量的指標(biāo)，在一定程度上能夠表示對油料儲運(yùn)設(shè)備和用油裝備的腐蝕性，其變化從宏觀上反應(yīng)了噴氣燃料化學(xué)組成的變化。該指標(biāo)對噴氣燃料質(zhì)量控制和儲存管理具有重要意義，也是GB 65373—2018和ASTM D6469—2014規(guī)定的重要檢測項目。

試驗過程中，噴氣燃料總酸值的變化情況如圖3所示。由圖3可知，在試驗過程中混合菌培養(yǎng)體系噴氣燃料總酸值呈明顯增加趨勢，且在第22 天時達(dá)到0.015 14 mgKOHg，已超出GB 6537《3號噴氣燃料》規(guī)定的0.015 mgKOHg，特征真菌的協(xié)同效應(yīng)加快了其對噴氣燃料的影響。試驗過程中，空白體系(BH培養(yǎng)基、噴氣燃料)中噴氣燃料總酸值變化不大，均未超出GB 6537規(guī)定的0.015 mgKOHg。

圖3 噴氣燃料總酸值變化曲線

噴氣燃料總酸值的增加，可能是真菌在以噴氣燃料為碳源進(jìn)行生長繁殖過程中將烴類氧化生成的有機(jī)酸引起的。Varjani和牛明明等[9-10]認(rèn)為，微生物氧化烷烴的途徑有末端氧化和亞末端氧化兩種。末端氧化指烷烴在加氧酶的作用下會被微生物氧化生成伯醇，然后在脫氫酶的作用下伯醇被氧化生成伯醛，醛在脫氫酶的作用下會被氧化成羧酸；亞末端氧化指烷烴先被氧化成仲醇，再被氧化成酮。芳香族化合物雖然較烷烴難以降解，但是在酶的作用下也能被微生物依次氧化成酚和羧酸。微生物氧化烴類生成的大分子羧酸能夠進(jìn)入噴氣燃料中，增加噴氣燃料酸值，增大燃料的腐蝕性，影響燃料儲運(yùn)系統(tǒng)和用油裝備的安全和使用壽命。

2.4 微生物對培養(yǎng)基pH的影響

水相pH檢測雖不是國家標(biāo)準(zhǔn)GB 6537—2018《3號噴氣燃料》要求的噴氣燃料檢測項目，但在噴氣燃料日常儲存管理過程中要求及時排放水分，也不允許油罐底部長期有水層存在，培養(yǎng)體系中水相pH在一定程度上能夠反映真菌在生長繁殖過程中生成酸性物質(zhì)的量及其對噴氣燃料使用性能的影響，能夠預(yù)測對用油設(shè)備可能造成的危害。因此ASTM D6469—2014《燃料和燃料系統(tǒng)中微生物污染的標(biāo)準(zhǔn)指南》將水相pH作為一個重要的必檢項目。

試驗過程中，培養(yǎng)基pH變化如圖4所示。由圖4可知，培養(yǎng)基pH隨時間的延長總體呈下降趨勢，pH下降過程中出現(xiàn)小幅度波動，培養(yǎng)基pH前期下降較快，后期穩(wěn)定。結(jié)合圖3可知，真菌在以噴氣燃料為唯一碳源進(jìn)行生長繁殖過程中，可能將烴類氧化成了酸性物質(zhì)，其中大分子有機(jī)酸進(jìn)入油相，增加了噴氣燃料總酸值，小分子酸性物質(zhì)進(jìn)入水相，降低了培養(yǎng)基pH。不管是溶于噴氣燃料的大分子有機(jī)酸，還是溶于水相中的小分子有機(jī)酸，均會增加對燃料儲運(yùn)設(shè)施和用油裝備的腐蝕。

圖4 培養(yǎng)基pH變化曲線

2.5 微生物對噴氣燃料水反應(yīng)試驗的影響

表面活性物質(zhì)是噴氣燃料潔凈性指標(biāo)，也是影響噴氣燃料水反應(yīng)試驗的主要因素。表1為試驗過程中混合菌培養(yǎng)體系噴氣燃料水反應(yīng)試驗結(jié)果。結(jié)果表明，試驗過程中真菌代謝繁殖產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)雖能顯著降低噴氣燃料的表面張力，但還不足以影響到水反應(yīng)試驗。真菌在生長過程中長期積累的表面活性物質(zhì)對噴氣燃料水反應(yīng)試驗有潛在影響，因此微生物對噴氣燃料水反應(yīng)試驗的影響需要引起一定關(guān)注。

表1 噴氣燃料水反應(yīng)試驗結(jié)果

2.6 微生物對噴氣燃料銀片腐蝕試驗的影響

相比銅片腐蝕試驗，銀片對油品的腐蝕性物質(zhì)更加敏感。腐蝕試驗的目的是定性判斷石油產(chǎn)品中是否存在腐蝕性物質(zhì)，如活性硫化物(元素硫、硫化氫或硫醇)，特征真菌對噴氣燃料銀片腐蝕的影響見表2。由表2可知，銀片腐蝕試驗過程中，銀片表面未出現(xiàn)明顯變化，始終保持為0級，因此未進(jìn)行銅片腐蝕試驗。對噴氣燃料腐蝕試驗產(chǎn)生影響的主要是活性硫化物。試驗過程中，特征真菌對銀片腐蝕試驗沒有影響，可能是因為特征真菌在生長繁殖過程中不能將非活性硫化物(如培養(yǎng)基中的硫酸鎂等)轉(zhuǎn)化為活性硫化物。但有報道表明，噴氣燃料中的硫酸鹽還原菌會引起噴氣燃料銀片腐蝕不合格[11-12]。因此，噴氣燃料出現(xiàn)微生物污染時，銀片腐蝕也是需要重點關(guān)注的指標(biāo)。

表2 噴氣燃料銀片腐蝕試驗結(jié)果(50 ℃)

2.7 培養(yǎng)基和噴氣燃料ATP含量

培養(yǎng)體系中，噴氣燃料和培養(yǎng)基ATP含量變化曲線分別如圖5和圖6所示。

圖5 噴氣燃料ATP含量變化曲線

圖6 培養(yǎng)基ATP含量變化曲線

由圖5可知，隨著培養(yǎng)時間增長，噴氣燃料中微生物含量先下降，然后保持相對平穩(wěn)，再快速上升。培養(yǎng)初期微生物含量下降，可能是由于接種初期特征真菌處于遲緩期，體系中缺乏足夠的酶等中間產(chǎn)物，真菌生長緩慢，總數(shù)量有所下降；隨著培養(yǎng)時間的增加，噴氣燃料中ATP含量在一定時間的穩(wěn)定后開始快速增加，對噴氣燃料性質(zhì)的影響也逐漸明顯，在第22 天時ATP含量達(dá)到5 533.4 RLUL，比試驗開始時增加了80.44%，此時噴氣燃料總酸值達(dá)到了0.015 14 mgKOHg，超出了GB 6537規(guī)定的0.015 mgKOHg。

由圖6可知，培養(yǎng)基中微生物含量在接入培養(yǎng)體系初期很高，然后經(jīng)歷短暫下降后再次上升。試驗初期，培養(yǎng)基中微生物含量高，而噴氣燃料中微生物含量迅速下降，說明試驗初期微生物主要在培養(yǎng)基中生長繁殖；之后由于缺乏足夠的酶等中間產(chǎn)物，兩相中的微生物含量均保持較低水平；進(jìn)入對數(shù)期后，微生物在兩相中同時快速繁殖，這可能是因為此時微生物已產(chǎn)生大量表面活性物質(zhì)，引起兩相表面張力下降，增大了油在水中的溶解度和水在油中的溶解度，使兩相均具備微生物生長的條件。

結(jié)合圖3和圖5可知：噴氣燃料中ATP含量達(dá)到2 500 RLUL(13～16 d)之前，真菌含量變化較為平穩(wěn)，增加比較緩慢，但是在ATP含量達(dá)到2 500 RLUL后真菌生長加速，噴氣燃料中真菌含量快速增加；噴氣燃料中ATP含量低于5 533.4 RLUL時，雖然真菌對噴氣燃料總酸值有一定的影響，但總酸值一直處于標(biāo)準(zhǔn)允許的范圍內(nèi)，噴氣燃料質(zhì)量依然合格，當(dāng)ATP含量達(dá)到5 533.4 RLUL時，總酸值超出規(guī)定范圍，噴氣燃料質(zhì)量不再合格。

3 結(jié) 論

(1)特征真菌在生長繁殖過程中，會使底部噴氣燃料顏色變暗，并產(chǎn)生乳化物，引起底部噴氣燃料外觀不符合標(biāo)準(zhǔn)要求；會產(chǎn)生表面活性物質(zhì)，使噴氣燃料和培養(yǎng)基表面張力下降，但在試驗周期內(nèi)對噴氣燃料水反應(yīng)試驗無顯著影響；會產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使噴氣燃料總酸值顯著上升，甚至出現(xiàn)酸值指標(biāo)不合格的情況，但在試驗周期內(nèi)對銀片腐蝕試驗無顯著影響。