枯草芽孢桿菌S-16產(chǎn)抗菌蛋白發(fā)酵條件優(yōu)化及蛋白分離純化

路妍 楊鑫 吳文慶 連紫倩 扈景晗 周洪友

摘要：以抑菌率為指標(biāo)，采用單因素試驗和響應(yīng)面法對枯草芽孢桿菌S-16菌株產(chǎn)抗菌蛋白的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，以可溶性淀粉為碳源，大豆蛋白胨為氮源，初始pH值為7.5的LB液體培養(yǎng)基，接種量為4.74%，在溫度為34 ℃條件下振蕩培養(yǎng) 53 h，轉(zhuǎn)速為 200 r/min為菌株最佳發(fā)酵條件。在此條件下純化得到的抗菌蛋白分子量約為35 ku，對向日葵核盤菌抑菌率達(dá)58.6%，比優(yōu)化前提高了3.19倍。穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，抗菌蛋白0～80 ℃、pH值為2～10時均有抑菌活性，說明該蛋白具有很好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌;抗菌蛋白;核盤菌;響應(yīng)面法;純化;發(fā)酵條件優(yōu)化

中圖分類號： S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2021）02-0063-08

收稿日期：2020-05-14

基金項目：內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金（編號：2017BS0303）;內(nèi)蒙古高等學(xué)校科學(xué)研究項目（編號：NJZY17069）

作者簡介：路妍（1982—），女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，博士，講師，從事植物真菌病害研究。E-mail：luyan820918@126.com。

通信作者：周洪友，博士，教授，從事植物病害生物防治研究。E-mail：hongyouzhou2002@aliyun.com。

向日葵菌核病是由核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary]引起的真菌病害，是世界范圍向日葵生產(chǎn)上危害重大并且具有毀滅性的病害之一[1-3]。向日葵核盤菌是一種兼性寄生菌，寄主范圍廣，侵染形式多樣，帶菌的種子和菌核為初侵染來源，可侵染向日葵的根、莖、葉、花盤等各個部位，造成植株局部或整體腐爛死亡，在我國發(fā)病最嚴(yán)重的是盤腐和根莖腐[4]。菌核病的有效控制包括使用以下1種或多種方法的組合：抗病品種、栽培控制和化學(xué)控制。種植抗病品種是控制土傳病害最經(jīng)濟(jì)且有效的措施，但至今沒有發(fā)現(xiàn)對菌核病免疫和高抗的向日葵材料[1，5]。目前對于該病害的防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，然而殺菌劑的大量使用導(dǎo)致了潛在危害人類和環(huán)境的有毒化合物的積累，也導(dǎo)致了病原體耐藥性的增強(qiáng)[6]。鑒于此，研究和應(yīng)用生物防治是一種很有前途的方法。根際細(xì)菌是控制土傳植物病原菌的優(yōu)良藥劑[7]，細(xì)菌種類如芽孢桿菌、假單胞菌、沙雷氏菌和節(jié)桿菌等已被證明能控制真菌病害[8]。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種廣泛存在于自然生態(tài)系統(tǒng)的非致病根際土壤細(xì)菌，具有發(fā)達(dá)的分泌系統(tǒng)、很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和抗逆能力，具有促進(jìn)植物生長和生物防治的雙重功效。能夠產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，包括蛋白質(zhì)[9]、脂肽類[10]和揮發(fā)性物質(zhì)[11]等。這些物質(zhì)通過抑制病原菌的生長，抑制孢子的萌發(fā)以及誘導(dǎo)激發(fā)植物自身的防御系統(tǒng)發(fā)揮抑菌作用[12]?？咕鞍资强莶菅挎邨U菌分泌的主要活性物質(zhì)，關(guān)于抗菌蛋白功能的研究也受到人們廣泛關(guān)注。劉伊強(qiáng)等從枯草芽孢桿菌TG26中分離的抗菌蛋白對禾谷鐮孢菌（Gibberella zeae）有較強(qiáng)的抑菌活性[13]。劉永峰等從枯草芽孢桿菌Bs-916中分離的抗菌蛋白對水稻紋枯病病菌（Rhizoctonia solani）和水稻惡苗病病菌（Fusarium moniliforme）具有較強(qiáng)的抑菌活性[14]。彭兵等從枯草芽孢桿菌菌株A發(fā)酵液中分離得到一種抗真菌活性蛋白FV，可抑制玉米小斑病病菌（Helminthosporium maydis）孢子萌發(fā)和附著胞形成，并影響菌絲細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)[15]。研究表明，枯草芽孢桿菌及其分泌物對多種土傳病害的田間防效顯著。例如，Sha等在幾個不同地點進(jìn)行的2年田間試驗中，使用枯草芽孢桿菌SYX04和SYX20可將水稻葉瘟病發(fā)病率降低73.5%～83.5%，穗瘟病發(fā)病率降低64.0%～85.6%[16]。馬新等用枯草芽孢桿菌的微囊劑防治番茄立枯病，防效明顯，可達(dá)到7276%?？莶菅挎邨U菌B908（百抗）對水稻紋枯病的大田防效達(dá)70%以上[17]。陳延熙等研制的增產(chǎn)菌，其有效成分是枯草芽孢桿菌，在全國10多個?。ㄊ小^(qū)）50多種作物中使用增產(chǎn)率達(dá)10%～50%，主要用于防治水稻稻瘟病、小麥紋枯病、油菜菌核病等土傳病害[18]。然而，由于抗菌蛋白是枯草芽孢桿菌的次級代謝產(chǎn)物，產(chǎn)量低，使其在生物防治中的應(yīng)用受到很大限制[17]。

提高抗菌代謝物的產(chǎn)量對后續(xù)抗菌機(jī)制的研究和抗菌蛋白制劑的研制至關(guān)重要。因此，對發(fā)酵條件的優(yōu)化是非常有必要的。響應(yīng)面法已經(jīng)成功應(yīng)用于多種微生物培養(yǎng)條件的優(yōu)化。王全等采用響應(yīng)面法對解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后抗菌蛋白對棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae Kleb.）的抑菌圈面積從優(yōu)化前的171.95 mm2 提高至? 320.3 mm2[19]。楊潔等采用響應(yīng)面法將枯草芽孢桿菌E1R-j分泌的抗菌脂肽產(chǎn)量提高了2倍[20]。全鑫等利用響應(yīng)面法優(yōu)化全蝕病生防菌YB-81的發(fā)酵條件，優(yōu)化后該菌株對全蝕病病菌的抑制率達(dá)到872%，較優(yōu)化前提高了32.5%[21]。

本研究選用從向日葵根際土壤中分離得到的1株枯草芽孢桿菌菌株S-16。前期研究發(fā)現(xiàn)，該菌株的無菌培養(yǎng)濾液對向日葵核盤菌具有拮抗作用，而且大田防效明顯。本研究利用單因素法和響應(yīng)面法對菌株發(fā)酵產(chǎn)生抗菌蛋白的條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在提高抗菌蛋白的產(chǎn)量，并在此條件下分離純化抗菌蛋白，為后續(xù)生物農(nóng)藥的研發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試菌種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）S-16和向日葵核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum），均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室提供。

1.1.2培養(yǎng)基LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基：5 g/L酵母粉，10 g/L 蛋白胨，10 g/L NaCl，pH值為7.0。

1.2試驗方法

1.2.1種子液制備及其生長曲線繪制用滅菌牙簽挑取枯草芽孢桿菌菌株S-16單菌落，接種于LB固體培養(yǎng)基上，在溫度為28 ℃條件下活化培養(yǎng)24 h后備用。將活化培養(yǎng)好的單菌落接入LB液體培養(yǎng)基（6 mL/100 mL），置于37 ℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為 200 r/min。分別于0、12、24、36、48、72 h取樣測定D600 nm，并繪制生長曲線以確定種子液的最佳接種時間。

1.2.2發(fā)酵上清液制備將培養(yǎng)好的種子液按6%（體積比）的接種量接入LB液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基（150 mL/250 mL），置于37 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液于4 ℃，4 800 r/min離心20 min，然后用細(xì)菌過濾器（直徑為0.22 μm）過濾后，收集上清液。

1.2.3發(fā)酵液最佳硫酸銨濃度的確定及抗菌蛋白的制備發(fā)酵上清液用不同飽和度的（NH4）2SO4分級鹽析，（NH4）2SO4飽和度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，在4 ℃冰箱中靜置24 h。于4 ℃，12 000 r/min離心 20 min后，棄上清液，將沉淀用磷酸鹽緩沖液（0.02 mol/L，pH值為6.8）溶解，經(jīng)透析袋透析48 h去鹽，取出樣品，于 4 ℃，12 000 r/min離心20 min后去除沉淀，收集上清液，即為蛋白質(zhì)粗提液。由于70%飽和度下蛋白質(zhì)沉淀量最大，因此，后續(xù)試驗均選擇70% （NH4）2SO4來沉淀上清液。

1.2.4單因素試驗設(shè)計本試驗以王祺等報道的枯草芽孢桿菌S-16的培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)[22]，選取影響微生物發(fā)酵的7個主要因素：培養(yǎng)基碳源、培養(yǎng)基氮源、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、初始pH值、接種量和搖床轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素試驗，考察各因素對粗蛋白抑菌活性的影響，從而確定響應(yīng)面試驗的因素及水平。每個試驗處理設(shè)置3次重復(fù)，結(jié)果采用統(tǒng)計軟件SPSS進(jìn)行分析。不同因素的梯度條件見表1。

1.2.5響應(yīng)面法設(shè)計基于單因素試驗結(jié)果，采用中心組合試驗Box-Behnken設(shè)計方案，以發(fā)酵溫度（℃）、時間（h）和接種量（%）為自變量因素，以抑菌率（Y）為響應(yīng)值。自變量分別用X1、 X2、X3 來表示，變量水平用1、0、-1表示（表2）。按方程xi=（Xi-X0）/ΔX 對自變量進(jìn)行編碼，其中，xi表示變量的編碼值，Xi表示變量的真實值，X0表示試驗中心點變量的真實值，ΔX表示變量的步長變化。

1.2.6穩(wěn)定性試驗

1.2.6.1溫度對抗菌蛋白活性的影響取4支 10 mL 的離心管，每支離心管加入5 mL抗菌蛋白，分別置于0、10、20、30、40、60、80、100 ℃水浴中處理1 h，以未處理的樣品置于室溫作對照，冷卻后若液體有揮發(fā)，用無菌水補(bǔ)液至5 mL，然后采用平板對峙法，以核盤菌為指示菌分別測定其抑菌活性。

1.2.6.2pH值對抗菌蛋白活性的影響取10支離心管，每支管中加入5 mL抗菌蛋白，用HCl（1 mol/L）和NaOH（1 mol/L）將其pH值分別調(diào)為2.0、3.0、4.5、5.5、6.5、6.8、7.5、8.0、9.0、10.0，置于室溫培養(yǎng)2 h后，在溫度為 4? ℃條件下過夜，次日再分別將 pH 值調(diào)至 7，以未處理的蛋白粗提液為對照，然后采用“1.2.6.1”節(jié)中的平板對峙法測定其抗菌活性。

1.2.6.3紫外線對抗菌蛋白活性的影響取5個培養(yǎng)皿，開蓋，向每個培養(yǎng)皿中加入10 mL抗菌蛋白，在距離紫外燈20 cm處分別處理15、30、60、120 min，以日光燈處理為對照，然后采用“1.2.6.1”節(jié)中的平板對峙法測定其抗菌活性。

1.3數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件和Design-Expert（ version 8.0.6）軟件進(jìn)行處理分析。

1.4抗菌蛋白的分離純化

將培養(yǎng)好的種子液按照優(yōu)化后的培養(yǎng)條件培養(yǎng)，用細(xì)菌過濾器（直徑為0.22 μm）過濾后，收集上清液。按照“1.2.3”節(jié)的方法提取蛋白質(zhì)。將獲得的粗蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）（12%分離膠，4%濃縮膠）檢測。預(yù)先在透析袋中加入1 mL電洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris、50 mmol/L 甘氨酸、0.1% SDS，pH值 8.9），再用刀片切下目的蛋白條帶，放入透析袋中。將收集有目的蛋白條帶膠塊的透析袋放在BioRad 電泳槽的上槽中，上、下槽均加入電洗脫緩沖液，在BioRad小型電泳槽中穩(wěn)壓100 V電泳 2 h，洗脫目的蛋白。最后取出透析袋中的膠塊，經(jīng)過透析和凍干，得到純化的目的蛋白，通過SDS-PAGE檢測純化結(jié)果。

1.5抗菌蛋白對核盤菌的抑制作用

采用平板對峙法，用7 mm打孔器，將活化好的核盤菌在邊緣打取菌餅，接于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基平板中央。培養(yǎng)至菌落直徑大小為 2 cm 時，在距離中央3 cm處用打孔器（7 mm）打取2個孔，取滅菌后的3片濾紙片蘸取抗菌蛋白，放入其中一個孔中，另取濾紙片3片蘸取磷酸緩沖液，放入等距的另外一個孔中作為空白對照，每個處理重復(fù)3次，培養(yǎng)3 d，每天用十字交叉法測定1次抑菌圈直徑，連續(xù)測定3 d，取平均值，計算抑菌率。

2結(jié)果與分析

2.1種子液生長曲線

由圖1可知，在12～48 h菌體數(shù)量增加速度較快，處于對數(shù)生長期，48 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體數(shù)量基本保持穩(wěn)定。因此，選取搖床培養(yǎng)48 h的菌液，用無菌水調(diào)D600 nm至1.8作為種子液。

2.2單因素試驗

2.2.1不同發(fā)酵溫度對粗蛋白抑菌活性的影響由圖2可知，隨著溫度升高，抑菌率呈先升后降的趨勢，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃時，抑菌活性最強(qiáng)，抑菌率為53%。說明溫度過低或過高均不適合細(xì)菌的生長繁殖及分泌蛋白的產(chǎn)生。顯著性測驗結(jié)果表明，發(fā)酵溫度對抗菌蛋白的產(chǎn)生影響極顯著（P<0.01）。

2.2.2不同碳源對粗蛋白抑菌活性的影響由圖3可知，各碳源的抑菌率表現(xiàn)為可溶性淀粉>酵母提取物>葡萄糖>蔗糖>乳糖。結(jié)果表明，以可溶性淀粉為碳源時，粗蛋白的抑菌能力最強(qiáng)，抑菌率為52.2%，明顯高于其他碳源，因此可溶性淀粉為最佳碳源。顯著性測驗結(jié)果表明，不同碳源對粗蛋白的抑菌活性影響不顯著。

2.2.3不同氮源對粗蛋白抑菌活性的影響由圖4可知，各氮源的抑菌率表現(xiàn)為大豆蛋白胨>胰蛋白胨>硝酸銨>硫酸銨。以大豆蛋白胨為氮源時，粗蛋白的抑菌能力最強(qiáng)，抑菌率為513%，明顯高于其他氮源，因此大豆蛋白胨為最佳氮源。顯著性測驗結(jié)果顯示，不同氮源對粗蛋白的抑菌活性影響不顯著。

2.2.4不同pH值對粗蛋白抑菌活性的影響由圖5可知，粗蛋白抑菌活性隨著pH值升高呈先增加后下降的趨勢。pH值在5.0～7.5之間，蛋白產(chǎn)量逐漸增加， 且pH值在7.5 時抑菌活性達(dá)到最高，

抑菌率為51.7%;隨著pH值的增加，蛋白產(chǎn)量逐漸降低。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)分泌在過酸過堿條件下影響較大。顯著性測驗結(jié)果表明，pH值在6.0～8.0時對粗蛋白的抑菌活性影響不顯著。

2.2.5不同接種量對粗蛋白抑菌活性的影響由圖6可知，以2%為最低接種量，粗蛋白抑菌活性隨著接種量的增加呈先增加后逐漸降低的趨勢，接種量在4%時抑菌率最大，為54%。結(jié)果表明，接種量為4%時，粗蛋白的抑菌活性最大。顯著性測驗結(jié)果表明，接種量對粗蛋白的抑菌活性影響極顯著（P<0.01）。

2.2.6不同轉(zhuǎn)速對粗蛋白抑菌活性的影響由圖7可知，粗蛋白抑菌活性受到搖床轉(zhuǎn)速的影響，在轉(zhuǎn)速為200 r/min 時，抑菌率最大，為52.5%。顯著性測驗結(jié)果表明，搖床轉(zhuǎn)速對粗蛋白的抑菌活性影響不顯著。

2.2.7不同發(fā)酵時間對粗蛋白抑菌活性的影響由圖8可知，在發(fā)酵初期，菌株沒有產(chǎn)生大量代謝物。隨著發(fā)酵時間的不斷延長，粗蛋白抑菌活性不斷增加，并在48 h時達(dá)到最大，抑菌率為53.3%，48 h 后抑菌活性開始降低。顯著性測驗結(jié)果表明，發(fā)酵時間對粗蛋白的抑菌活性影響極顯著（P<001）。

2.3響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.3.1響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果分析根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對發(fā)酵條件影響顯著的因素有發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時間;因此，選擇上述3個因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

2.3.2模型的建立和方差分析在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert （ version 8.0.6） 軟件對表3中試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，獲得抑菌率（Y）對發(fā)酵溫度（X1）、時間（X2）和接種量（X3）的二次多項回歸模型為Y=55.6+10.575×X1+0.4×X2+6.55×X3-2225×X1X2+4.475×X1X3+13075×X2X3-15412 5×X21-1.3125×X22-13.462 5×X23。

從表4中可知，模型F值為72.66，P<0.01，達(dá)到極顯著水平，可用此模型預(yù)測枯草芽孢桿菌抗菌蛋白發(fā)酵條件對抑菌率的影響。回歸方程系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果：X1（溫度）和X3（接種量）的一次項影響極顯著（P<0.01），X1、X2和X3的二次項影響極顯著（P<0.01），交互項X1X2（溫度和時間組合）和X2X3（接種量和時間組合）影響極顯著（P<001），X1X3（溫度和接種量組合）影響顯著（P<005）。由F值得出，試驗各因素對抑菌活性影響的主次順序表現(xiàn)為X1>X3>X2，即溫度>接種量>時間。

2.3.3響應(yīng)面分析結(jié)果根據(jù)二次多項模型并利用Design-Expert軟件繪制出響應(yīng)面分析結(jié)果（圖9、圖10、圖11），每個響應(yīng)面分別表示2個獨立變量之間的相互作用，第3個變量保持在0水平，圖9是發(fā)酵溫度與時間對抑菌率的交互效應(yīng)，圖10是發(fā)酵溫度和接種量對抑菌率的交互效應(yīng)，圖11是發(fā)酵時間和接種量對抑菌率的交互效應(yīng)。利用響應(yīng)面優(yōu)化器，得到優(yōu)化后的發(fā)酵條件：發(fā)酵時間為53 h，發(fā)酵溫度為34.0 ℃，接種量為4.74%，預(yù)測最大抑菌率為56.5%。

2.4回歸模型的驗證試驗

為驗證預(yù)測值，用以上最優(yōu)培養(yǎng)條件重復(fù)試驗5次，抑菌率分別為51.5%、58.6%、57.7%、562%、54.1%，平均值為55.6%，與預(yù)測值有較好的擬合性，證明利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化抗菌蛋白發(fā)酵條件是可行的。在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，抗菌蛋白最高抑菌活性可達(dá)58.6%，比試驗設(shè)計初期的抗菌蛋白最低抑菌活性提高3.19倍。

2.5穩(wěn)定性試驗

2.5.1溫度對抑菌蛋白活性的影響由圖12可知，抗菌蛋白在0～30 ℃抑菌活性與對照相比變化很小，其中20 ℃時抑菌活性最接近對照;抗菌蛋白在 40～50 ℃處理 30 min 后，其抑菌效果與對照比，變化不大;蛋白經(jīng)80 ℃水浴處理 30 min后，與對照相比其抑菌活性下降21%，但仍有抑菌作用，且抑菌率接近30%;經(jīng) 100 ℃ 水浴處理 30 min后抑菌活性明顯下降。結(jié)果表明，該抗菌蛋白在0～80 ℃時具有良好的熱穩(wěn)定性，溫度適應(yīng)范圍廣。

2.5.2pH值對抑菌蛋白活性的影響由圖13可知，處理后的抗菌蛋白與對照相比，pH值在6.5～

8.0范圍內(nèi)抑菌活性有微小變化，pH值為2.0、10.0時仍分別保留原有活性的35.2%、47.1%。結(jié)果表明，該抗菌蛋白的pH值適應(yīng)范圍較寬，同時也說明其具有良好的酸堿穩(wěn)定性。由此說明，該蛋白在實際應(yīng)用中，對土壤酸堿環(huán)境適應(yīng)范圍較廣。

2.5.3紫外線對蛋白抑菌活性的影響由圖14可知，經(jīng)過不同時間紫外線照射處理后，抗菌蛋白抑菌作用有明顯變化，未經(jīng)紫外線照射時，抗菌蛋白對核盤菌的抑制效果最好，抑菌率達(dá)到最大，為551%。經(jīng)過紫外線照射后，短時間內(nèi)抑菌圈減小不明顯，抑菌活性稍有減弱，但隨著時間的增長，抑菌活性越來越低，經(jīng)過120 min紫外照射后其抑菌活性基本消失。

2.6抗菌蛋白的分離純化

對分離純化的抗菌蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測表明，在分子量約35 ku處有1條單一條帶（圖15）。

2.7抗菌蛋白對核盤菌的抑菌活性

采用平板對峙法培養(yǎng)3 d后，觀察發(fā)現(xiàn)，純化的抗菌蛋白對核盤菌有明顯的抑菌效果，采用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件比優(yōu)化前抑菌圈的直徑明顯增加，抑菌率增加了3.19倍（圖16）。

3結(jié)論與討論

向日葵是我國東北和內(nèi)蒙古中西部地區(qū)的主

要經(jīng)濟(jì)作物，近年來連作現(xiàn)象普遍，使土壤中養(yǎng)分消耗過度，病蟲害越來越嚴(yán)重。化學(xué)農(nóng)藥施用量不斷增加，土壤污染嚴(yán)重，地力難恢復(fù)，亟待采用合理的栽培方法，科學(xué)的防治措施，以便提高作物產(chǎn)量，推進(jìn)向日葵產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。大量研究表明，枯草芽孢桿菌能夠促進(jìn)植物生長發(fā)育，增加產(chǎn)量，能夠改善鹽堿地土壤理化性狀，使土壤微生物數(shù)量增多。此外，由于枯草芽孢桿菌無致病性，并且可以分泌多種酶和抗生素，可以起到防病促生產(chǎn)的作用[23-25]。

本研究所用枯草芽孢桿菌S-16菌株經(jīng)過室內(nèi)抑菌測驗、盆栽試驗、種子處理試驗已驗證其對向日葵菌核病有較好的抑制作用，并且發(fā)現(xiàn)該菌株可在向日葵根際土壤中大量定殖[22，26]?？咕鞍资茄挎邨U菌的次生代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)量通常受到培養(yǎng)基營養(yǎng)成分、發(fā)酵條件和高度復(fù)雜的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制的影響。本研究旨在探究提高抗菌蛋白產(chǎn)量的最佳發(fā)酵條件，以純化出目的蛋白。許多研究表明，合理地使用優(yōu)化方法可以顯著提高微生物代謝物的產(chǎn)量[27-31]。本試驗首先選擇7個對抗菌蛋白抑菌活性有影響的因素進(jìn)行單因素試驗，結(jié)果篩選出3個因素對抑菌活性有顯著影響，分別是發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量。然后，進(jìn)一步針對上述3個因素做響應(yīng)面試驗，最終得出該菌株產(chǎn)生抗菌蛋白的最佳發(fā)酵條件：可溶性淀粉為碳源，大豆蛋白胨為氮源，初始pH值為7.5，接種量為474%，培養(yǎng)溫度為34 ℃，培養(yǎng)時間為 53 h，轉(zhuǎn)速為 200 r/min，并且通過驗證，在此最佳發(fā)酵條件下，抗菌蛋白的抑菌活性比之前提高3.19倍。

據(jù)報道，枯草芽孢桿菌抗菌蛋白具有抗真菌和細(xì)菌等特性，其抗菌譜廣、穩(wěn)定性高、對熱不敏感[32]。在本研究中，S-16菌株所產(chǎn)抗菌蛋白經(jīng)熱穩(wěn)定性測驗發(fā)現(xiàn)，在0～80 ℃熱穩(wěn)定性良好，在 100 ℃ 條件下處理 30 min，抑菌活性明顯下降，且該抗菌蛋白具有較寬的pH值適應(yīng)范圍，說明其酸堿穩(wěn)定性好。另外，該蛋白經(jīng)紫外線照射30 min以內(nèi)，對抑菌活性影響小，處理1、2 h，抑菌活性明顯下降。根據(jù)上述試驗數(shù)據(jù)，說明該蛋白對溫度、pH值和短時間的紫外線不敏感。這些結(jié)果將為抗菌蛋白后續(xù)的抗菌機(jī)制研究和生防制劑的研制提供理論依據(jù)，也將為其應(yīng)用于向日葵菌核病的生物防治提供參考。

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