甘藍(lán)蔗糖合成酶基因家族鑒定及響應(yīng)低溫脅迫表達(dá)模式分析

張偉 余方偉 李建斌 王神云

摘要：蔗糖合成酶（SUS）是植物蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一，它不僅影響植物的產(chǎn)量和品質(zhì)，還在植物抵御逆境脅迫中起重要作用。基于已經(jīng)公布的甘藍(lán)全基因組數(shù)據(jù)信息，利用生物信息學(xué)方法對(duì)甘藍(lán)BoSUS基因家族成員進(jìn)行鑒定，分析其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子順式作用元件和低溫脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果表明，甘藍(lán)全基因組共鑒定到7個(gè)BoSUS基因成員，系統(tǒng)進(jìn)化分析分成3個(gè)亞組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）。BoSUS蛋白氨基酸長(zhǎng)度范圍為805（BoSUS1a）～940（BoSUS6b）個(gè)，均是親水性蛋白。在蕓薹族特異的全基因組3倍化事件后，與擬南芥AtSUS4共線性的甘藍(lán)BoSUS4基因發(fā)生了丟失，與AtSUS1、AtSUS6共線性的BoSUS1和BoSUS6基因均發(fā)生了擴(kuò)張，出現(xiàn)了雙拷貝（BoSUS1a、BoSUS1b和BoSUS6a、BoSUS6b）。表達(dá)模式分析表明，BoSUS1a、BoSUS1b和BoSUS3基因在甘藍(lán)不同器官/組織尤其在花器官的蔗糖代謝中起著重要作用，為庫(kù)器官（花）的發(fā)育提供能量和物質(zhì)。耐冷甘藍(lán)CT-923葉片中BoSUS1a和BoSUS1b基因表達(dá)水平在低溫處理6、24 h后相比對(duì)照急劇升高，BoSUS1a和BoSUS1b酶活性增強(qiáng)，為甘藍(lán)產(chǎn)生保護(hù)性反饋機(jī)制提供能量，使得耐冷甘藍(lán)CT-923耐寒性增強(qiáng)。綜上所述，本研究為解析甘藍(lán)BoSUS基因響應(yīng)低溫脅迫的分子機(jī)制和指導(dǎo)甘藍(lán)耐寒種質(zhì)資源創(chuàng)新具有重要意義。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán);低溫脅迫;蔗糖合成酶;表達(dá)模式

中圖分類號(hào)： S188文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2021）02-0024-09

收稿日期：2020-09-02

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31902009）;國(guó)家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-23-G42）;江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（18）2006]。

作者簡(jiǎn)介：張偉（1989—），男，安徽安慶人，博士，副研究員，主要從事甘藍(lán)耐寒機(jī)理及育種研究。E-mail：zhangwei@jaas.ac.cn。

通信作者：王神云，碩士，研究員，主要從事甘藍(lán)抗病、抗逆機(jī)理及遺傳育種研究。E-mail：wangshenyun@jaas.ac.cn。

蔗糖合成酶（sucrose synthase，SUS，EC 2.4.1.13）通常被認(rèn)為是一種胞質(zhì)可溶性酶，分布在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，也廣泛存在于膜系統(tǒng)和細(xì)胞壁。在大多數(shù)植物中，蔗糖是光合作用的主要產(chǎn)物之一，儲(chǔ)存在庫(kù)器官中的蔗糖不能被直接利用，須要通過(guò)SUS或蔗糖轉(zhuǎn)化酶（invertase，INV，EC3.2.1.26）分解。SUS催化蔗糖和尿苷二磷酸（UDP）產(chǎn)生尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和果糖，此反應(yīng)可逆[1]，水解的六碳糖參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成、物質(zhì)貯藏和細(xì)胞新陳代謝等[2-3]。SUS還參與植物生長(zhǎng)的多個(gè)代謝過(guò)程，包括蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)、淀粉與纖維素合成、生物及非生物逆境響應(yīng)等[4-5]。

低溫對(duì)蔬菜的危害一方面影響植物的外部形態(tài)，另一方面引發(fā)植物生理生化的強(qiáng)烈變化，導(dǎo)致減產(chǎn)和品質(zhì)下降[6-7]。甘藍(lán)（Brassica oleracea var. capitata L.）屬于十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種中頂芽能形成葉球的變種，是我國(guó)一種重要的十字花科蔬菜，其營(yíng)養(yǎng)豐富，適應(yīng)性及抗逆性均較強(qiáng)，在全國(guó)各地普遍種植，在蔬菜供應(yīng)中具有舉足輕重的地位[8]。15～20 ℃為甘藍(lán)最適宜結(jié)球的溫度，但其生長(zhǎng)受溫度影響較大，早春易發(fā)生倒春寒現(xiàn)象，造成甘藍(lán)的先期抽薹，或是溫度低到超過(guò)甘藍(lán)的耐受程度，幼苗直接凍死或葉球凍傷，嚴(yán)重影響甘藍(lán)的產(chǎn)量。

在低溫脅迫下，植物可溶性糖含量明顯增加，作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的可溶性糖主要有蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖等，其含量與植物抗寒性之間呈正相關(guān)。Sasaki等提出甘藍(lán)葉片中的可溶性糖含量與甘藍(lán)的耐寒性密切相關(guān)[9]。王磊等的研究表明，在感受低溫脅迫后，抗凍性強(qiáng)的甘藍(lán)品種中可溶性糖含量上升幅度高于抗凍性差的品種;感受凍害低溫后，可溶性糖含量下降，但抗凍性強(qiáng)的品種下降幅度小于抗凍性差的品種[10]。蔡青等的研究表明，在 -1 ℃ 低溫條件下處理6 h，耐寒性強(qiáng)的甘藍(lán)品種與耐寒性弱的品種葉片中可溶性糖含量存在顯著性差異，且抗寒性強(qiáng)的品種可溶性糖含量上升幅度較大[11]。由此可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)低溫鍛煉的植株體內(nèi)可溶性糖含量的增加使得作物耐寒能力增強(qiáng)，且在適應(yīng)溫度范圍內(nèi)耐寒性強(qiáng)的材料比耐寒性弱的材料含量高。

隨著越來(lái)越多物種基因組測(cè)序的完成，SUS家族成員已經(jīng)在擬南芥[12]、水稻[13]、玉米[14]、楊樹(shù)[15]、大豆[16]等物種中被鑒定。不同物種的SUS家族成員存在較大差異，但蛋白序列保守性比較高，均具有蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域和糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。研究表明，在低氧脅迫下，玉米根[1]和馬鈴薯塊莖[17]中一些SUS亞型的表達(dá)被誘導(dǎo)或增強(qiáng)。抑制SUS基因的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致玉米[1]和棉花[18]的種子萎縮，馬鈴薯塊莖[19]中淀粉積累減少。SUS家族成員間不同的表達(dá)模式表明它們?cè)谥参锷L(zhǎng)發(fā)育及脅迫響應(yīng)中具有不同的生理功能。但是BoSUS基因在甘藍(lán)中的全基因組鑒定以及如何響應(yīng)低溫脅迫均尚未可知。因此，鑒定分析甘藍(lán)BoSUS家族成員具有重要意義。本研究對(duì)甘藍(lán)進(jìn)行全基因組BoSUS基因家族的鑒定，分析甘藍(lán)BoSUS蛋白的進(jìn)化歷程、結(jié)構(gòu)特征以及表達(dá)模式，探究甘藍(lán)BoSUS基因在低溫脅迫響應(yīng)中的作用。

1材料與方法

1.1甘藍(lán)BoSUS基因家族的鑒定

根據(jù)前人的報(bào)道從擬南芥TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.arabidopsis.org/）下載了6條SUS蛋白序列（AtSUS1～AtSUS6）[12]。大白菜和甘藍(lán)全基因組序列分別從BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//brassicadb.org/brad/）和甘藍(lán)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Bolbase，http：//ocri-genomics.org/bolbase/）[20-21]下載獲得。

為了在全基因組鑒定出甘藍(lán)和白菜中的SUS基因序列，通過(guò)Pfam 31.0數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.xfam.org/）獲取蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域（Sucrose_synth，PF00862）和糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（Glycos_transf_1，PF00534）的隱馬爾科夫模型（HMM），利用hmmer（http：//www.hmmer.org/）軟件在全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索含有該結(jié)構(gòu)域的序列，將僅含有PF00862和PF00534結(jié)構(gòu)域的蛋白序列作為候選SUS基因家族候選序列。利用在線Pfam 31.0數(shù)據(jù)庫(kù)、SMART數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和Conserved Domain數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/）進(jìn)一步驗(yàn)證SUS候選序列的保守結(jié)構(gòu)域，最終確定目的SUS基因。甘藍(lán)BoSUS和大白菜BrSUS基因的命名根據(jù)其與AtSUS1～AtSUS6序列的同源性及共線性關(guān)系并添加后綴（a、b、…）來(lái)命名。

1.2甘藍(lán)BoSUS蛋白特征預(yù)測(cè)、系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化樹(shù)分析

利用在線ProtParam工具（https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)獲得的甘藍(lán)SUS蛋白質(zhì)序列分子量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪族指數(shù)和親水性平均系數(shù)進(jìn)行分析。使用CELLO v2.5（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）和BaCelLo（http：//gpcr2.biocomp.unibo.it/bacello/index.htm）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。利用Gene Structure Display Server（GSDS 2.0，http：//gsds.gao-lab.org/）根據(jù)每個(gè)BoSUS基因組序列和相應(yīng)的CDS序列繪制基因結(jié)構(gòu)圖[22]。利用MEGA 7.0對(duì)甘藍(lán)BoSUS、擬南芥AtSUS和大白菜BrSUS蛋白質(zhì)序列繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ），設(shè)置Bootstrap值為 1 000，其他參數(shù)保持默認(rèn)值[23]。

1.3BoSUS基因的染色體定位、共線性及進(jìn)化約束值（Ka/Ks）分析

根據(jù)甘藍(lán)BoSUSs基因在染色體上的物理位置，使用MapChart 2.30[24]對(duì)BoSUSs基因進(jìn)行染色體定位。利用BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)分析甘藍(lán)和擬南芥之間的直系和旁系同源基因關(guān)系，利用TBtools[25]繪制共線性圖。通過(guò)使用DnaSP 6計(jì)算同義替換率（Ks）、非同義替換率（Ka）和進(jìn)化約束值（Ka/Ks）。使用公式T=Ks/2r計(jì)算同源基因之間的分化時(shí)間，雙子葉植物中每個(gè)位點(diǎn)每年的同義替換率r=1.5×10-8[26]。

1.4甘藍(lán)BoSUS基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件分析

利用在線軟件New PLACE（https：//sogo.dna.affrc.go.jp/）分析BoSUS成員起始密碼子上游 1 500 bp 序列中ABRE（ABA-響應(yīng)元）、ARE（厭氧誘導(dǎo)的順式作用元件）、CGTCA-motif、GARE-motif、LTRE（低溫響應(yīng)元件）、TCA-元件和TGACG-motif等順式作用元件。

1.5甘藍(lán)BoSUS基因在不同器官/組織以及低溫脅迫下的表達(dá)模式分析

為了分析甘藍(lán)不同器官/組織中BoSUS基因的表達(dá)水平，在NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載甘藍(lán)不同器官/組織（愈傷組織、根、莖、葉、芽、花和角果）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（登錄號(hào)為GSE42891），以BoSUS基因的FPKM（fragments per kilobase per million mapped reads）值來(lái)表示甘藍(lán)BoSUS在不同器官/組織中的表達(dá)水平，并繪制柱形圖。

耐冷甘藍(lán)923（CT-923）和冷敏甘藍(lán)D9（CS-D9）的種子發(fā)芽后播種在無(wú)菌基質(zhì)中，放在人工氣候室中進(jìn)行生長(zhǎng)，環(huán)境條件設(shè)定為：白天25 ℃/夜晚18 ℃，光照14 h/黑暗10 h。為了開(kāi)展低溫脅迫處理，將5葉1心期的幼苗轉(zhuǎn)移至春化室（4 ℃）處理，作為對(duì)照的幼苗仍處于正常條件下。在處理6、24 h后，分別對(duì)春化室和人工氣候室的幼苗同時(shí)進(jìn)行取樣。對(duì)于每個(gè)甘藍(lán)材料每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的取樣，至少選取18株幼苗，隨機(jī)選取6株作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)（3個(gè)生物學(xué)重復(fù)），每株材料取頂部第3張完全展開(kāi)葉，剪碎后放進(jìn)錫箔紙?jiān)谝旱欣鋬霾?chǔ)存在-80 ℃冰箱中。利用Trizol試劑（Invitrogen，USA）提取樣品的總RNA，將獲得的高純度和完整性好的RNA用于RNA-Seq文庫(kù)構(gòu)建。構(gòu)建好的24個(gè)RNA-Seq文庫(kù)在Illumina HiSeqTM 2500平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)RNA-Seq數(shù)據(jù)中獲取的每個(gè)BoSUS基因的FPKM值來(lái)繪制柱形圖。

2結(jié)果與分析

2.1甘藍(lán)BoSUS基因家族的鑒定、系統(tǒng)發(fā)育和蛋白特征分析

通過(guò)對(duì)全基因組蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定和結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證，在甘藍(lán)和大白菜基因組中分別鑒定到7個(gè)BoSUS蛋白和7個(gè)BrSUS蛋白。根據(jù)命名規(guī)則，將這些蛋白分別命名為BoSUS1～BoSUS6和BrSUS1～BrSUS6。將甘藍(lán)、大白菜和擬南芥的20個(gè)SUS蛋白序列構(gòu)建了鄰接法（NJ）無(wú)根系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，從而來(lái)闡明它們的進(jìn)化關(guān)系（圖1）。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這些SUS蛋白成員根據(jù)聚類被分為3個(gè)不同的亞組（Ⅰ～Ⅲ）。亞組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別包含6、6、8個(gè)SUS成員。其中亞組Ⅰ包括BoSUS1a和BoSUS1b，亞組Ⅱ包括BoSUS2和BoSUS3，亞組Ⅲ包括BoSUS5、BoSUS6a和BoSUS6b。

通過(guò)在線ProtParam工具預(yù)測(cè)了BoSUS蛋白的物理和化學(xué)特征。BoSUS蛋白的氨基酸長(zhǎng)度范圍為805（BoSUS1a）～940（BoSUS6b）個(gè)，相對(duì)應(yīng)的開(kāi)放閱讀框（ORF）分布為2 418～2 823 bp（表1）。BoSUS蛋白的分子量分布為92.1（BoSUS2）～106.5（BoSUS6b） ku，理論等電點(diǎn)（pI）范圍為5.67（BoSUS1b）～7.20（BoSUS6b）（表1）。除了BoSUS6b，其余所有的BoSUS家族成員的pI均小于7，這說(shuō)明甘藍(lán)BoSUS蛋白主要是弱酸性蛋白。BoSUS蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)范圍為34.41（BoSUS1b）～41.52（BoSUS3）。除BoSUS3外，其余的不穩(wěn)定指數(shù)均未超過(guò)臨界值（大于40被認(rèn)為不穩(wěn)定）。此外，脂肪族氨基酸指數(shù)和總平均親水性分別為8266～94.09和-0.382～-0.245（表1）。所有BoSUS蛋白的總平均親水性值均為負(fù)值，表明均是親水性蛋白。

2.2BoSUS基因的染色體分布和共線性分析

在本研究中，7個(gè)BoSUS家族基因均分布在3個(gè)亞基因組上，其中LF亞基因組中有4個(gè)BoSUS基因，MF1亞基因組中有2個(gè)BoSUS基因，MF2亞基因組中有1個(gè)BoSUS基因（表1）。此外，與擬南芥AtSUS基因相比，甘藍(lán)中除了BoSUS4基因丟失之外，其他所有的BoSUS基因在蕓薹族特異的全基因組3倍化事件[20]（WGT）后均被保留了下來(lái)?？偣灿?個(gè)BoSUS基因（BoSUS2、BoSUS3和BoSUS5）保留了單拷貝，2個(gè)BoSUS基因（BoSUS1和BoSUS6）保留了雙拷貝（表1）。同一BoSUS基因不同拷貝之間具有相同的共線性區(qū)塊，結(jié)果如圖2所示。此外，還分析了BoSUS基因在甘藍(lán)染色體上的物理定位。BoSUS1b定位于染色體C03上，BoSUS6a和BoSUS6b位于染色體C06上，BoSUS3和BoSUS1a位于染色體C09上，而B(niǎo)oSUS2和BoSUS5只錨定到Scaffolds上，未能錨定到甘藍(lán)的任何染色體上（圖2）。

此外，將鑒定到的直系同源和旁系同源SUS基因用于分析BoSUS和BrSUS、AtSUS基因之間的共線性關(guān)系。利用BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)分析了甘藍(lán)和大白菜之間的直系和旁系同源SUS基因關(guān)系。共鑒定到甘藍(lán)之間2對(duì)旁系同源基因、甘藍(lán)和擬南芥之間7對(duì)直系同源基因、甘藍(lán)和大白菜之間11對(duì)直系同源基因以及大白菜之間2對(duì)旁系同源基因（圖3）。

2.3甘藍(lán)和擬南芥SUS基因的Ka、Ks分析

通過(guò)計(jì)算分析了甘藍(lán)和擬南芥中7個(gè)SUS直系同源基因?qū)Γ玫搅怂鼈兊耐x替換率（Ks）、非同義替換率（Ka）和進(jìn)化約束值（Ka/Ks）（表2）。結(jié)果表明，進(jìn)化約束值Ka/Ks均小于1，說(shuō)明甘藍(lán)和擬南芥在與共同祖先分化之后，SUS基因家族經(jīng)歷了純化（負(fù)向）選擇作用。Ks值的分布還能體現(xiàn)基因家族的分化時(shí)間。在甘藍(lán)和擬南芥的直系同源基因?qū)χ?，非同義替換率Ks值范圍為0.324 2～0529 7。雙子葉植物中每個(gè)位點(diǎn)每年的同義替換率，表明甘藍(lán)BoSUS基因與擬南芥的同源基因的分化大致發(fā)生在10.8×106～17.7×106年， 與蕓薹族特異的全基因組3倍化時(shí)間（13×106～17×106年）基本相符[20，27]。

2.4甘藍(lán)BoSUS基因結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析

本研究根據(jù)甘藍(lán)BoSUS基因家族成員的CDS序列和基因組DNA序列，繪制甘藍(lán)BoSUS基因結(jié)構(gòu)圖（圖4）。結(jié)果顯示，除了BoSUS1b含有10個(gè)外顯子，BoSUS5含有13個(gè)外顯子，BoSUS2含有14個(gè)外顯子外，其余的BoSUS基因均含有12個(gè)外顯子，但是各成員外顯子的位置和長(zhǎng)度存在較大差異。其中，相比BoSUS1a，旁系同源基因BoSUS1b發(fā)生了可變剪切和內(nèi)含子插入，導(dǎo)致其丟失第6、第11位外顯子，且第2、第6位內(nèi)含子長(zhǎng)度增長(zhǎng)（圖4）。而B(niǎo)oSUS6a和BoSUS6b之間外顯子、內(nèi)含子數(shù)量以及長(zhǎng)度均沒(méi)有發(fā)生明顯變化，屬于高度保守的。

分別通過(guò)在線軟件CELLO v2.5和BaCelLo對(duì)甘藍(lán)BoSUS蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果如表3所示，2種軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果均表明甘藍(lán)BoSUS蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.5甘藍(lán)BoSUS基因啟動(dòng)子的順式作用元件分析

用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)甘藍(lán)BoSUS基因家族成員的上游1 500 bp啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行順式作用元件的預(yù)測(cè)（表4）。預(yù)測(cè)有7個(gè)與逆境和激素反應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，包括ABRE（ABA響應(yīng)元件）、ARE（厭氧誘導(dǎo)調(diào)控元件）、GARE-motif（赤霉素響應(yīng)元件）、LTR（低溫響應(yīng)元件）、TCA-element（水楊酸響應(yīng)元件）、CGTCA-motif、TGACG-motif（茉莉酸甲酯響應(yīng)元件）。這些順式作用元件在5個(gè)BoSUS基因中均有分布，但是BoSUS6b基因啟動(dòng)子中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)此類調(diào)控元件。

2.6甘藍(lán)BoSUS基因在不同器官/組織及低溫脅迫下表達(dá)模式分析

研究7個(gè)BoSUS基因在甘藍(lán)愈傷組織、根、莖、葉、芽、花和角果中的基因表達(dá)水平（圖5）。其中，BoSUS2基因在各個(gè)器官/組織中均沒(méi)有表達(dá)量（FPKM）（圖5未列出）。從整體表達(dá)水平看，BoSUS1a、BoSUS1b和BoSUS3基因在各個(gè)器官/組織中的表達(dá)水平（根和葉除外）要高于BoSUS5、BoSUS6a和BoSUS6b基因。此外，BoSUS1a、BoSUS1b和BoSUS3均在花中高水平表達(dá)，BoSUS1a基因在花中的表達(dá)量FPKM值最大，為867（圖5）。

此外，還分析了BoSUS基因在低溫脅迫下不同耐寒性甘藍(lán)材料中的表達(dá)模式差異。如圖6所示，總體而言，BoSUS1a基因低溫處理下的整體表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他幾個(gè)BoSUS基因。耐冷甘藍(lán)CT-923葉片中BoSUS1a和BoSUS1b在低溫處理6、24 h后的表達(dá)量相比對(duì)照（Mock）急劇升高。冷敏甘藍(lán)CS-D9葉片中BoSUS1a和BoSUS1b基因的表達(dá)水平在低溫處理6 h后出現(xiàn)了緩慢的升高，而在低溫處理24 h后，處理組的表達(dá)量相比對(duì)照也是出現(xiàn)了表達(dá)量急劇升高。而B(niǎo)oSUS3基因僅僅在冷敏甘藍(lán)CS-D9葉片被低溫處理24 h后出現(xiàn)了2.5倍的上升，其他時(shí)期均沒(méi)有明顯變化（圖6）。此外，BoSUS5、BoSUS6a和BoSUS6b整體表達(dá)水平很低，這與圖5的組織表達(dá)水平相類似，且低溫處理后的表達(dá)量沒(méi)有發(fā)生明顯變化。綜上所述，BoSUS1a和BoSUS1b是響應(yīng)低溫脅迫的關(guān)鍵蔗糖合成酶基因。

3討論與結(jié)論

糖代謝不僅是植物發(fā)育的核心，也是非生物脅迫響應(yīng)的核心， 因此了解其潛在的機(jī)制對(duì)于提高植物對(duì)干旱、高溫和冷脅迫的耐受性至關(guān)重要[28]。由于蔗糖本身就是一種重要的信號(hào)分子，參與到植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，SUS參與的蔗糖代謝過(guò)程產(chǎn)生的己糖分子也可以作為感知能量和代謝物變化的信號(hào)分子[29]，參與到細(xì)胞壁信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期和激素調(diào)節(jié)等過(guò)程中，以此來(lái)調(diào)控種子的發(fā)育過(guò)程[5，30-31]。

SUS蛋白是一種胞質(zhì)可溶性酶，有助于淀粉和蛋白質(zhì)的生物合成以及能量的產(chǎn)生，在植物生長(zhǎng)發(fā)育中有重要的作用。基于甘藍(lán)基因組，鑒定出7個(gè)SUS家族成員，擬南芥、水稻和桃中也鑒定出6個(gè)SUS基因[12-13，32]，葡萄中鑒定出5個(gè)SUS基因[33]，楊樹(shù)中鑒定出4個(gè)SUS基因[15]。外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)被認(rèn)為在多基因家族的進(jìn)化中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)BoSUS基因內(nèi)含子的數(shù)目為9～13個(gè)，其中包含11個(gè)內(nèi)含子的BoSUS基因數(shù)目最多，為4個(gè)，這與大豆和楊樹(shù)的內(nèi)含子數(shù)目均在11～14個(gè)之間[15-16]相符合，這表明SUS家族的內(nèi)含子數(shù)目在不同物種間具有高度保守性。此外，旁系同源基因BoSUS1a、BoSUS1b之間發(fā)生了部分可變剪切和內(nèi)含子插入，導(dǎo)致BoSUS1a與BoSUS1b基因之間功能的多樣性，使得出現(xiàn)了BoSUS1a與BoSUS1b基因在不同器官/組織以及響應(yīng)低溫脅迫的基因表達(dá)水平的極大差異。通過(guò)甘藍(lán)BoSUS基因在不同器官/組織中的表達(dá)水平可以看出，BoSUS1a、BoSUS1b和BoSUS3基因在甘藍(lán)不同器官/組織中蔗糖代謝過(guò)程中起著重要作用。此外，BoSUS1a、BoSUS1b和BoSUS3基因均在花器官中表達(dá)水平最高，表明花器官作為庫(kù)器官，在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中需要大量的物質(zhì)和能量，需要蔗糖合成酶將庫(kù)器官里的蔗糖分解，形成從源到庫(kù)的蔗糖濃度梯度，為蔗糖由韌皮部向庫(kù)器官的運(yùn)輸提供壓力，保證蔗糖向庫(kù)中持續(xù)供應(yīng)。

耐冷甘藍(lán)CT-923葉片中BoSUS1a和BoSUS1b基因的表達(dá)水平在低溫處理6、24 h后相比對(duì)照急劇升高，而冷敏甘藍(lán)CS-D9中BoSUS1a和BoSUS1b基因表達(dá)水平雖然出現(xiàn)了升高，但表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于耐冷甘藍(lán)CT-923。表明耐冷甘藍(lán)CT-923在低溫脅迫下，葉片中BoSUS1a和BoSUS1b基因迅速響應(yīng)，表達(dá)量急劇上升，使得BoSUS1a和BoSUS1b酶活性增強(qiáng)，為產(chǎn)生保護(hù)性反饋機(jī)制提供能量，還增加了細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞液濃度，冰點(diǎn)降低，抑制了細(xì)胞內(nèi)冰核的形成，使得耐冷甘藍(lán)CT-923耐寒性增強(qiáng)。這與Fenando等的“當(dāng)植物受到脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的可溶性糖含量迅速增加，來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜穩(wěn)定”的結(jié)論[34]相一致。有研究還發(fā)現(xiàn)，SUS促進(jìn)蔗糖分解所需要的能量相比其他蔗糖代謝需要的更少，所以在逆境脅迫下，植物更傾向于通過(guò)SUS促進(jìn)蔗糖分解來(lái)提供還原糖維持生長(zhǎng)[35]。Klotz等研究發(fā)現(xiàn)，在低溫、干旱、高鹽和傷害脅迫下，甜菜SUS基因都會(huì)被誘導(dǎo)而表達(dá)上調(diào)[36]。同樣在小麥的研究中發(fā)現(xiàn)，遭遇冷害的小麥SUS蛋白含量升高了5～6倍，這表明SUS蛋白可能參與小麥冷馴化的過(guò)程，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)可溶性糖的含量以及滲透壓的方式來(lái)增強(qiáng)耐寒性[37]。此外，在水稻研究中還發(fā)現(xiàn)，水稻種子在受到高溫脅迫時(shí)，通過(guò)過(guò)表達(dá)OsSUS3基因可使種子的堊白減少，來(lái)降低高溫對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的造成危害[38]。總之，SUS蛋白可以參與多個(gè)逆境脅迫響應(yīng)，通過(guò)過(guò)表達(dá)SUS基因大多數(shù)都能提高植物抵抗逆境脅迫的能力[39]。本研究發(fā)現(xiàn)的耐冷甘藍(lán)CT-923葉片中BoSUS1a和BoSUS1b基因在低溫脅迫后的表達(dá)水平急劇變化，為后續(xù)進(jìn)一步開(kāi)展BoSUS1a和BoSUS1b基因的具體功能研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Koch K E. Carbohydrate-modulated gene expression in plants[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1996，47（1）：509-540.

[2]Chourey P S，Taliercio E W，Carlson S J，et al. Genetic evidence that the two isozymes of sucrose synthase present in developing maize endosperm are critical，one for cell wall integrity and the other for starch biosynthesis[J]. Molecular & General Genetics，1998，259（1）：88-96.

[3]Lutfiyya L L，Xu N F，DOrdine R L，et al. Phylogenetic and expression analysis of sucrose phosphate synthase isozymes in plants[J]. Journal of Plant Physiology，2007，164（7）：923-933.

[4]Ruan Y L，Jin Y，Yang Y J，et al. Sugar input，metabolism，and signaling mediated by invertase：roles in development，yield potential，and response to drought and heat[J]. Molecular Plant，2010，3（6）：942-955.

[5]Chinnusamy V，Zhu J H，Zhu J K. Cold stress regulation of gene expression in plants[J]. Trends in Plant Science，2007，12（10）：444-451.

[6]Brill E，van Thournout M，White R G，et al. A novel isoform of sucrose synthase is targeted to the cell wall during secondary cell wall synthesis in cotton fiber[J]. Plant Physiology，2011，157（1）：40-54.

[7]Ngele T，Heyer A G. Approximating subcellular organisation of carbohydrate metabolism during cold acclimation in different natural accessions of Arabidopsis thaliana[J]. The New Phytologist，2013，198（3）：777-787.

[8]楊麗梅，方智遠(yuǎn)，莊木，等. “十二五”我國(guó)甘藍(lán)遺傳育種研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)蔬菜，2016（11）：1-6.

[9]Sasaki H I，Ichimura K A，Oda M A. Changes in sugar content during cold acclimation and deacclimation of cabbage seedlings[J]. Annals of Botany，1996，78（3）：365-369.

[10]王磊，李建勇，張振賢，等. 凍害低溫下越冬甘藍(lán)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化和作用[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，32（4）：487-490，494.

[11]蔡青，李成瓊，司軍. 結(jié)球甘藍(lán)耐寒性研究進(jìn)展[J]. 長(zhǎng)江蔬菜，2009（2）：1-3.

[12]Baud S，Vaultier M N，Rochat C. Structure and expression profile of the sucrose synthase multigene family in Arabidopsis[J]. Journal of Experimental Botany，2004，55（396）：397-409.

[13]Hirose T，Scofield G N，Terao T. An expression analysis profile for the entire sucrose synthase gene family in rice[J]. Plant Science，2008，174（5）：534-543.

[14]Duncan K A，Hardin S C，Huber S C. The three maize sucrose synthase isoforms differ in distribution，localization，and phosphorylation[J]. Plant & Cell Physiology，2006，47（7）：959-971.

[15]Zhang D Q，Xu B H，Yang X H，et al. The sucrose synthase gene family in Populus：structure，expression，and evolution[J]. Tree Genetics & Genomes，2011，7（3）：443-456.

[16]晁毛妮，張自陽(yáng)，王潤(rùn)豪，等. 大豆蔗糖合成酶家族成員的全基因組鑒定及表達(dá)分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2018，38（2）：232-241.

[17]Fu H，Park W D. Sink-and vascular-associated sucrose synthase functions are encoded by different gene classes in potato[J]. The Plant Cell，1995，7（9）：1369-1385.

[18]Ruan Y L，Llewellyn D J，F(xiàn)urbank R T. Suppression of sucrose synthase gene expression represses cotton fiber cell initiation，elongation，and seed development[J]. The Plant Cell，2003，15（4）：952-964.

[19]Zrenner R，Salanoubat M，Willmitzer L，et al. Evidence of the crucial role of sucrose synthase for sink strength using transgenic potato plants（Solanum tuberosum L.）[J]. The Plant Journal，1995，7（1）：97-107.

[20]Wang X W，Wang H Z，Wang J，et al. The genome of the mesopolyploid crop species Brassica rapa[J]. Nature Genetics，2011，43（10）：1035-1039.

[21]Liu S Y，Liu Y M，Yang X H，et al. The Brassica oleracea genome reveals the asymmetrical evolution of polyploid genomes[J]. Nature Communications，2014，5：3930.

[22]Hu B，Jin J P，Guo A Y，et al. GSDS 2.0：an upgraded gene feature visualization server[J]. Bioinformatics，2015，31（8）：1296-1297.

[23]Kumar S，Stecher G，Tamura K. MEGA7：molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Molecular Biology and Evolution，2016，33（7）：1870-1874.

[24]Voorrips R E. MapChart：software for the graphical presentation of linkage maps and QTLs[J]. The Journal of Heredity，2002，93（1）：77-78.

[25]Chen C J，Chen H，Zhang Y，et al. TBtools：an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data[J]. Molecular Plant，2020，13（8）：1194-1202.

[26]Koch M A，Haubold B，Mitchell-Olds T. Comparative evolutionary analysis of chalcone synthase and alcohol dehydrogenase loci in Arabidopsis，Arabis，and related genera（Brassicaceae）[J]. Molecular Biology and Evolution，2000，17（10）：1483-1498.

[27]Cheng F，Mandáková T，Wu J，et al. Deciphering the diploid ancestral genome of the mesohexaploid Brassica rapa[J]. The Plant Cell，2013，25（5）：1541-1554.

[28]Kakumanu A，Ambavaram M M，Klumas C A，et al. Effects of drought on gene expression in maize reproductive and leaf meristem tissue revealed by RNA-Seq[J]. Plant Physiology，2012，160（2）：846-867.

[29]Lastdrager J，Hanson J，Smeekens S. Sugar signals and the control of plant growth and development[J]. Journal of Experimental Botany，2014，65（3）：799-807.

[30]Ruan Y L. Signaling role of sucrose metabolism in development[J]. Molecular Plant，2012，5（4）：763-765.

[31]Barratt D H，Derbyshire P，F(xiàn)indlay K，et al. Normal growth of Arabidopsis requires cytosolic invertase but not sucrose synthase[J]. PNAS，2009，106（31）：13124.

[32]Zhang C H，Yu M L，Ma R J，et al. Structure，expression profile，and evolution of the sucrose synthase gene family in peach（Prunus persica）[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2015，37（4）：81.

[33]Zhu X D，Wang M Q，Li X P，et al. Genome-wide analysis of the sucrose synthase gene family in grape（Vitis vinifera）：structure，evolution，and expression profiles[J]. Genes，2017，8（4）：111.

[34]Fenando E P，Boero C，Gallardo M，et al. Effect of NaCl on germination，growth，and soluble sugar content in Chenopodium quinoa Willd. seeds[J]. Botanical Bulletin-Academia Sinica Taipei，2000，41（1）：27-34.

[35]房經(jīng)貴，朱旭東，賈海鋒，等. 植物蔗糖合酶生理功能研究進(jìn)展[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，40（5）：759-768.

[36]Klotz K L，Haagenson D M. Wounding，anoxia and cold induce sugarbeet sucrose synthase transcriptional changes that are unrelated to protein expression and activity[J]. Journal of Plant Physiology，2008，165（4）：423-434.

[37]Crespi M D，Zabaleta E J，Pontis H G，et al. Sucrose synthase expression during cold acclimation in wheat[J]. Plant Physiology，1991，96（3）：887-891.

[38]Takehara K，Murata K，Yamaguchi T，et al. Thermo-responsive allele of sucrose synthase 3（Sus3） provides high-temperature tolerance during the ripening stage in rice（Oryza sativa L.）[J]. Breeding Science，2018，68（3）：336-342.

[39]何藝濤，王廣亞，范春芬，等. 植物蔗糖合酶研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2020，56（6）：1165-1176.魏后軍，胡波，陳萌萌，等. 新西蘭兔RBM4基因的克隆、序列分析及組織表達(dá)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（2）：33-36.