高效液相色譜法測定乳粉中三聚氰胺的方法優(yōu)化

盧竹陽 沈蕾 陳丹瑩 柏寧

三聚氰胺含氮量高，俗稱“偽蛋白”，幾乎無味，微溶于水，可溶于甲醇、乙酸、甲醛等，經(jīng)常被用作化工原料，對健康有害，我國明確規(guī)定三聚氰胺不是食品原料，也不是食品添加劑，禁止人為添加。“三鹿奶粉”事件影響惡劣，也給食品檢驗機構(gòu)敲響警鐘，三聚氰胺參數(shù)在乳品檢測中成了必檢指標，研究其檢測方法尤為重要。

GB/T 22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》明確規(guī)定，測定三聚氰胺有三種方法，即液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和高效液相色譜法。前兩種方法涉及的儀器高端精密，費用昂貴，后續(xù)維護保養(yǎng)較為繁瑣，不具備普遍性，本文對高效液相色譜法檢測乳粉中三聚氰胺的前處理和色譜條件進行了優(yōu)化。

一、材料和方法

1.儀器。Agilent-1200高效液相色譜儀（VWD），多功能氮吹儀，高速冷凍離心機，數(shù)控超聲波清洗器，電子天平（Ⅰ級），固相萃取聯(lián)用儀，SPE小柱：Poly-Sery MCX，60mg/3mL。

2.試劑。三聚氰胺標樣（1.0mg/mL），甲醇、乙腈、正己烷均為色譜純，檸檬酸、辛烷磺酸鈉、氨水、三氯乙酸均為分析純。

3.樣品前處理。（1）提取。準確稱取1g乳粉置于50ml具塞離心管中，加入8ml三氯乙酸溶液（1%）和2ml乙腈，超聲提取約10min，渦旋提取約10min，9500r/min離心8min，取上清液于50ml離心管中；殘渣重復提取一次，合并兩次提取液，加入10ml三氯乙酸溶液和飽和的正己烷溶液，渦旋振蕩1min，9500r/min離心6min，取下層清液，待凈化。（2）凈化。依次用3ml甲醇和5ml水對SPE小柱進行活化和平衡，抽至近干；將待凈化的清液轉(zhuǎn)至SPE小柱中，用3ml水和3ml甲醇進行淋洗，抽至近干；用6mL氨化甲醇溶液（5%）洗脫，洗脫液于50℃氮氣吹干，殘留物用1ml流動相定容，渦旋混合1min，過0.22μm微孔水相濾膜后，供測定。

4.色譜參考條件。色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱，4.6mm×250mm，5μm。流動相：離子對試劑緩沖液（稱取2.16g辛烷磺酸鈉和2.10g檸檬酸于燒杯中，加入約980ml水溶解，調(diào)節(jié)pH3.0，轉(zhuǎn)移至1L容量瓶，定容）-乙腈（93+7），混勻。流速：1.0ml/min，柱溫：40℃，波長：240nm，進樣量：20μL。

5 .標準曲線的繪制。用流動相將標準儲備液（1.0mg/mL）逐級稀釋成0.5、2.0、10.0、20.0和40.0mg/kg標準工作液，低濃度到高濃度依次進樣。以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標作曲線，得到標準曲線回歸方程，即y=84.47216x+6.65842，r2=0.99998，符合檢測要求。

二、結(jié)果與分析

1.前處理方法優(yōu)化。在乳粉前處理過程中，將國標中的振蕩提取優(yōu)化成渦旋提取，讓蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)沉淀更充分。這樣做減少了過濾的環(huán)節(jié)，減少了目標物損失，并增加了二次提取步驟，將目標物充分提取，增加回收率。分別在空白乳粉中添加標樣（10.0mg/kg）1ml和2ml，檢測到的三聚氰胺含量分別為9.23mg/kg和13.24mg/kg，回收率分別為92.3%和93.2%，滿足檢測要求。

2.色譜條件優(yōu)化。根據(jù)GB/T 22388-2008國標要求，流動相：離子對試劑緩沖液-乙腈（90+10），混勻，按此條件進樣，三聚氰胺于9.27min出峰，查看光譜圖，會發(fā)現(xiàn)此峰前半部分和后部分是兩個不同的光譜，詳見圖1、圖2。為了分開兩物質(zhì)，將流動相比例優(yōu)化為93+7，混勻，按此條件進樣，進樣時間調(diào)至16min，查看光譜后確認兩物質(zhì)出峰時間為11.833min和14.034min，成功分離，所以93+7的液相比例更能準確測得三聚氰胺含量。

本文在國家標準GB/T 22388-2008的基礎上，對高效液相色譜法的前處理過程和色譜條件進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的回收率高達93%，并成功解決了兩物質(zhì)重疊峰的問題，標準工作曲線、質(zhì)控樣檢測和加標回收等一系列的質(zhì)量控制實驗均表明優(yōu)化后的方法具有可行性，對于檢測乳粉中三聚氰胺殘留量具有實際的應用價值。