3種檢測布魯氏菌熒光定量PCR方法的比較

董 浩，原 霖，趙明海，許中衎，劉 巍，徐 陽，陳亞娜，梁春南*

3種檢測布魯氏菌熒光定量PCR方法的比較

董 浩1, 2，原 霖2，趙明海1，許中衎1，劉 巍1，徐 陽2，陳亞娜2，梁春南1*

(1. 中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；2. 中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102618)

為了篩選適用于家畜布魯氏菌病檢測的熒光定量PCR方法，合成目前報(bào)道最多的布魯氏菌插入序列、基因和基因的引物和探針，并分別對這3種熒光定量PCR方法的敏感性、特異性、重復(fù)性以及63份臨床樣品檢測效果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示：3種熒光定量PCR方法均具有較好的敏感性且均不與其他常見細(xì)菌發(fā)生交叉反應(yīng)；3種方法的批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于5%。在檢測臨床樣品時(shí)，3種方法的敏感性均高于套式PCR方法，其中IS711熒光定量PCR方法與套式PCR方法符合率為95.24%，其他2種方法與套式PCR方法的符合率為98.41%。比較而言，IS711熒光定量PCR敏感性最高，更適合于布魯氏菌核酸含量低的樣品的檢測。

布魯氏菌；熒光定量PCR；方法比對；插入序列

布魯氏菌?。ê喎Q布?。┦怯筛腥静剪斒暇鸬囊环N危害嚴(yán)重的人獸共患病。布魯氏菌主要侵害患病動(dòng)物的生殖系統(tǒng)，以母畜發(fā)生流產(chǎn)和公畜睪丸炎為主要特征。人感染布病以發(fā)熱、乏力、流產(chǎn)、睪丸炎等為主要癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至喪失勞動(dòng)能力和生育能力。布病感染人類時(shí)，需要及時(shí)進(jìn)行抗生素治療，若治療不及時(shí)則容易轉(zhuǎn)變成慢性感染。

目前，全球共有超過170個(gè)國家報(bào)道有人或家畜布病的發(fā)生。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，全球每年人類新發(fā)布病病例數(shù)超過50萬人，在布病高發(fā)的中東地區(qū)，每百萬人的發(fā)病數(shù)字超過200，但是世界衛(wèi)生組織（WHO）的報(bào)告指出，真實(shí)的人間發(fā)病率應(yīng)該為報(bào)告數(shù)字的10 ～ 25倍[1-2]。

由于接觸患病動(dòng)物或被污染的動(dòng)物產(chǎn)品是人感染布病的主要途徑，畜間布病的流行情況與人間布病的發(fā)生直接相關(guān)。根據(jù)現(xiàn)行的動(dòng)物布魯氏菌病診斷國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T18646—2018），家畜布病的檢測方法中血清學(xué)方法應(yīng)用最為廣泛，包括虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、乳環(huán)試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等。細(xì)菌分離試驗(yàn)是布病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是該方法分離率低、耗時(shí)費(fèi)力且存在較大的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。在現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中分子診斷方法，只推薦了Bruce-Ladder PCR方法，該方法屬于多重PCR，可以用于布魯氏菌進(jìn)行分型，但是該方法敏感性較低，只能對經(jīng)過分離培養(yǎng)的布魯氏菌核酸進(jìn)行檢測，不能用于臨床樣品的直接檢測。隨著熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于越來越多種動(dòng)物疫病的診斷。布魯氏菌病的熒光定量PCR方法也有較多的報(bào)道，其中報(bào)道最多的是針對(DegT/DnrJ/EryC1/StrS aminotransferase)、(Transposase, IS4)和(cell surface 31 kDa protein)這3個(gè)基因的熒光定量PCR方法[3-4]。本研究對上述3種熒光定量PCR的敏感性、特異性、重復(fù)性以及臨床樣品檢測效果進(jìn)行了評價(jià)，以期篩選一種合適于實(shí)驗(yàn)室布魯氏菌核酸檢測的熒光定量PCR方法，為家畜布病的分子檢測提供一種有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 布魯氏菌病S2疫苗株購自天康生物股份有限公司；大腸桿菌(CVCC4251)、鼠傷寒沙門氏菌(CVCC2220)、金黃色葡萄球菌(CVCC4098)、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(ATCC 23715)和乳酸桿菌(ATCC4356)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。免疫羊的全血和陰道拭子樣品采自河南省某羊場。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自西安天隆科技有限公司；GoTag Probe qPCR Master Mix，購自Promega公司；TE緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)mega公司；H I、I和R I限制性內(nèi)切酶以及T4連接酶購自NEB公司。

1.1.3 引物和探針 套式PCR引物、熒光定量PCR所有引物探針和構(gòu)建載體的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本研究中所應(yīng)用的引物和探針序列如表1所示。

表1 引物和探針序列

1.1.4 儀器 GeneRotex全自動(dòng)旋轉(zhuǎn)式核酸提取儀購自西安天隆科技有限公司；ABI7500熒光定量PCR儀購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基因組DNA的提取 在生物安全柜中將S2疫苗株按說明書使用生理鹽水稀釋后，取出500 μL菌液分裝至1.5 mL離心管，在80 ℃水浴鍋中滅活2 h，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行布魯氏菌基因組DNA的提取。

將大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和乳酸桿菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期，采用熱滅活的方式將細(xì)菌滅活后，取1 mL培養(yǎng)物，10 000 r·min-1離心1 min后，吸取上清即為制備的核酸樣品。

在生物安全柜中打開裝有免疫羊的抗凝血樣品、陰道拭子樣品的抗凝采血管或離心管，分別取250 μL樣品溶液加入裝有20 μL蛋白酶K的無菌EP管中，顛倒混勻。放入56 ℃水浴鍋中作用30 min后，將全部溶液組分加入預(yù)分裝的基因組DNA提取試劑中。使GeneRotex全自動(dòng)旋轉(zhuǎn)式核酸提取儀進(jìn)行提取。

1.2.2 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 熒光定量PCR的反應(yīng)體系為20 μL，包括GoTag Probe qPCR Master Mix 10 μL，10 μmol·L-1的上游引物和10 μmol·L-1的下游引物各0.6 μL，10 μmol·L-1的探針0.6 μL，DNA模板2 μL，加入ddH2O 20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min， 40個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)第二步收集熒光信號。

1.2.3 對照質(zhì)粒的構(gòu)建 以疫苗株S2的核酸為模板，分別使用插入序列、基因和基因的載體構(gòu)建引物進(jìn)行目的片段的PCR擴(kuò)增?；厥沾笮≌_的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)提取pUC19質(zhì)粒。使用H I和I限制性內(nèi)切酶對基因和基因擴(kuò)增產(chǎn)物以及pUC19質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物后使用T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，通過Amp抗性和PCR反應(yīng)鑒定陽性克隆，陽性克隆送公司使用M13F和M13R通用引物測序。構(gòu)建成功的質(zhì)粒分別命名為pUC-和pUC-。pUC-對照質(zhì)粒的構(gòu)建方法與上述過程類似，區(qū)別是使用H I和R I限制性內(nèi)切酶對基因擴(kuò)增產(chǎn)物以及pUC19質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切。

1.2.4 敏感性比較 將豬種布魯氏菌S2疫苗株的基因組DNA使用TE溶液進(jìn)行10倍系列稀釋，依次稀釋101～107倍。分別使用per、IS711和bcsp31等3種熒光定量PCR方法對上述系列稀釋的基因組DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.5 特異性比較 使用per、IS711和bcsp31等3種熒光定量PCR方法對豬種布魯氏菌S2疫苗株基因組DNA、熱滅活的大腸桿菌、熱滅活的鼠傷寒沙門氏菌、熱滅活金黃色葡萄球菌、滅活的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和滅活的乳酸桿菌進(jìn)行檢測。

1.2.6 重復(fù)性比較 將豬種布魯氏菌S2疫苗株的基因組DNA使用TE溶液進(jìn)行10倍系列稀釋，制備成100、101、102、103和104倍稀釋樣品。分別使用per、IS711和bcsp31等3種熒光定量PCR方法對上述系列稀釋的基因組DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增。批內(nèi)重復(fù)性比較，每個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行3次重復(fù)。在不同時(shí)間對上述試驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)3次，以觀察3種方法的批間重復(fù)性。

1.2.7 臨床樣品檢測比較 對臨床收集的63份免疫羊的抗凝血和陰道拭子樣品，分別使用3種熒光定量PCR方法和《奶牛布魯氏菌病PCR診斷技術(shù)》（NY/T 1467—2007）中規(guī)定的套式PCR方法進(jìn)行檢測，計(jì)算3種熒光定量PCR方法和現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中套式PCR方法的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pUC-per、pUC-IS711和pUC-bcsp31的構(gòu)建

以豬種布魯氏菌S2疫苗株的基因組DNA為模板，分別設(shè)計(jì)針對、和基因的擴(kuò)增引物，引物序列如表1所示。使用PCR擴(kuò)增上述3個(gè)片段，經(jīng)過雙酶切后插入pUC19載體中，獲得重組質(zhì)粒pUC-、pUC-1和pUC-。重組質(zhì)粒構(gòu)建完成后使用M13F和M13R通用引物測序。結(jié)果顯示，pUC-、pUC-和pUC-陽性質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物的長度分別為360、493和408 bp。將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的布魯氏菌菌株序列進(jìn)行比對，一致性均為100%。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別提取pUC-、pUC-和pUC-陽性質(zhì)粒，使用TE緩沖液進(jìn)行10倍系列稀釋，每種陽性質(zhì)粒稀釋5個(gè)梯度。分別使用3種熒光定量PCR方法對相應(yīng)的系列稀釋的質(zhì)粒溶液進(jìn)行擴(kuò)增，從而繪制各個(gè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，per、IS711和bcsp313種熒光定量PCR方法的R2值依次為0.997、0.994和0.990，3種方法的擴(kuò)增效率依次為99.19%、94.09%和112.15%（圖1）。結(jié)果表明這3種熒光定量PCR的擴(kuò)增效率均比較高，線性良好。

2.3 敏感性比較

使用TE緩沖液將豬種布魯氏菌S2疫苗株的基因組DNA進(jìn)行10倍系列稀釋，分別使用per、IS711和bcsp31等3種熒光定量PCR方法對系列稀釋的基因組DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增。3種方法對不同稀釋度樣品的熒光定量檢測結(jié)果如表2所示。使用IS711的熒光定量PCR方法可以檢測到105倍稀釋的豬種布魯氏菌S2疫苗株的核酸，而per和bcsp31熒光定量PCR方法只能檢測到104倍稀釋的豬種布魯氏菌S2疫苗株的核酸。以上結(jié)果說明IS711熒光定量PCR方法的敏感性高于其他兩種方法。

A．per熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B．IS711熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線；C．bcsp31熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Figure 1 The standard curves using the three RT-PCR methods

表2 3種熒光定量PCR方法的敏感性比較結(jié)果（Ct值）

表3 3種熒光定量PCR方法的批內(nèi)重復(fù)性結(jié)果

表4 3種熒光定量PCR方法的批間重復(fù)性結(jié)果

表5 3種熒光定量PCR和套式PCR檢測臨床樣品的結(jié)果

2.4 特異性比較

分別使用per、IS711和bcsp31 3種熒光定量PCR方法對豬種布魯氏菌S2疫苗株、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、乳酸桿菌等基因組DNA進(jìn)行檢測，結(jié)果表明3種熒光定量PCR方法均只能夠?qū)ωi種布魯氏菌S2疫苗株核酸進(jìn)行擴(kuò)增，說明3種熒光定量PCR方法均具有良好的特異性。

2.5 重復(fù)性比較

分別對per、IS711和bcsp31 3種熒光定量PCR方法的批內(nèi)和批間重復(fù)性進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，per、IS711和bcsp31 3種熒光定量PCR方法的批內(nèi)變異系數(shù)分別為：1.12%～2.59%、1.73%～2.79%和1.37%～ 2.36%（表3）。per、IS711和bcsp31 3種熒光定量PCR方法的批間變異系數(shù)分別為：2.03%～ 3.33%、1.95% ～ 3.28%和2.21% ～ 3.37%（表4）。上述3種熒光定量PCR方法的批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性的變異系數(shù)均小于5.00%，說明這3種方法的重復(fù)性良好。

2.6 臨床樣品檢測結(jié)果的比較

使用3種熒光定量PCR方法和《奶牛布魯氏菌病PCR診斷技術(shù)》中規(guī)定的套式PCR方法分別對63份免疫羊的抗凝血和陰道拭子樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果（表5）顯示，套式PCR、per和bcsp31熒光定量PCR均檢測到相同的9份陽性樣品，而IS711熒光定量PCR除了檢測到上述9份陽性樣品，還多檢測出3份免疫羊的抗凝血樣品。通過計(jì)算符合率，per和bcsp31熒光定量PCR方法與套式PCR方法的符合率為98.41%，IS711熒光定量PCR方法與套式PCR方法的符合率為95.24%。

3 討論與結(jié)論

在家畜布病診斷方法中，血清學(xué)方法應(yīng)用最為廣泛。但是大腸桿菌O:157和耶爾森菌O:9等細(xì)菌與布魯氏菌存在血清學(xué)交叉反應(yīng)，而且目前血清學(xué)方法均無法區(qū)分布病自然感染產(chǎn)生的抗體和疫苗免疫產(chǎn)生的抗體[5]。除此之外，對于特定動(dòng)物（如乳用動(dòng)物、種公畜等）進(jìn)行血液樣品采集時(shí)，可能還會影響生產(chǎn)性能，或者存在一定的危險(xiǎn)性。上述這些原因使得家畜布病血清學(xué)檢測方法的使用存在一定的局限性，也亟需其他類型檢測方法作為補(bǔ)充手段。

隨著熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展，以其高敏感性、高特異性和操作便捷的優(yōu)點(diǎn)在病原診斷中得到了廣泛的應(yīng)用。相關(guān)報(bào)道表明，感染布病的家畜尿液、糞便、陰道分泌物、流產(chǎn)物、乳汁及精液中均可能檢測到布魯氏菌的存在[6]。其中，陰道分泌物、流產(chǎn)胎兒和乳汁中含菌量較大，可以直接進(jìn)行細(xì)菌分離。相對于細(xì)菌分離培養(yǎng)的耗時(shí)費(fèi)力、分離率低、生物安全風(fēng)險(xiǎn)大而言，通過熒光定量PCR方法直接檢測樣品中的核酸，能夠快速、高效地檢測布魯氏菌，并且生物安全風(fēng)險(xiǎn)顯著降低。同時(shí)由于熒光定量PCR方法具有極高的敏感性，可以通過定期對大罐奶混合樣品、凍精樣品等進(jìn)行檢測，可作為一種有效的動(dòng)物群體布病監(jiān)測方法[7-8]。

在本研究中，為了篩選一種適用的熒光定量PCR檢測方法，對現(xiàn)在研究最多的per、IS711和bcsp31 3種熒光定量PCR進(jìn)行了敏感性、特異性、重復(fù)性和臨床樣品檢測效果的比較。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線表明3種方法均具有良好的線性和擴(kuò)增效率。敏感性方面，IS711熒光定量PCR方法要高于其他2種熒光定量PCR方法，這與IS711插入序列在布魯氏菌基因組中具有多個(gè)拷貝密切相關(guān)。在特異性方面，3種方法均不與常見的幾種細(xì)菌發(fā)生交叉反應(yīng)。在重復(fù)性方面，3種方法的批內(nèi)和批間重復(fù)性均比較好。在進(jìn)行臨床樣品檢測時(shí)，和現(xiàn)行的奶牛布病檢測行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的套式PCR相比，IS711熒光定量PCR方法多檢測了3份樣品，per和bcsp31熒光定量PCR均多檢測了1份樣品。這說明這3種熒光定量PCR方法均比現(xiàn)行布病診斷標(biāo)準(zhǔn)中套式PCR檢測方法更加敏感。鑒于熒光定量PCR方法比套式PCR和“金標(biāo)準(zhǔn)”細(xì)菌分離更加敏感，熒光定量方法比套式PCR方法多檢測出的臨床樣品是否為真正的核酸陽性則需要更加敏感的定量方法進(jìn)行確定，例如數(shù)字PCR方法[9]。

綜上，3種熒光定量PCR方法均具有擴(kuò)增效率高、線性好、敏感性高、特異性高和重復(fù)性好等特性，均適用于家畜布病臨床樣品的檢測。比較而言，IS711熒光定量PCR方法敏感性更加優(yōu)異。與常規(guī)PCR方法相比操作簡單，熒光定量PCR方法不需要通過電泳來判定結(jié)果，不易造成氣溶膠污染。因此，熒光定量PCR方法可以作為一種家畜布病檢測的重要技術(shù)手段。同時(shí)為將我國家畜布病診斷標(biāo)準(zhǔn)與世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）接軌，可考慮盡快將熒光定量PCR方法納入家畜布病診斷的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中，提升實(shí)驗(yàn)室布病檢測能力。

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Comparison of three real time PCR assays for

DONG Hao1, 2, YUAN Lin2, ZHAO Minghai1, XU Zhongkan1, LIU Wei1, XU Yang2, CHEN Yana2, LIANG Chunnan1

(1. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 102629; 2. China Animal Disease Control Center, Beijing 102618)

To select a real time PCR method for the detection of animal brucellosis, the primers and probes of three real time PCR methods (insertion sequence,gene andgene), which were most reported, were synthesized. The sensitivity, specificity and repeatability of the three methods were tested. In addition, 63 clinical samples were also tested using the three real time PCR methods. The results indicated that the three real time PCR methods had good sensitivity and did not cross-react with the DNA samples from other common bacteria. Both intra-batch coefficient of variation and inter-batch coefficient of variation of the three methods were less than 5%. When testing clinical samples, the sensitivity of the three methods were higher than the nested PCR method. The coincidence rate between the-based real time PCR method and the nested PCR method was 95.24%, and which of the other two real time PCR methods and the nested PCR method were 98.41%. In comparison, the-based real time PCR has the highest sensitivity, and it is more suitable for the detection of samples with low content ofDNA.

; real time PCR; comparison of methods;insertion sequence

S852.6

A

1672-352X (2021)06-0947-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20220106.022

2022-1-7 13:05:45

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.s.20220106.1254.044.html

2021-01-13

國家自然科學(xué)基金（31602055）資助。

董 浩，博士，獸醫(yī)師。E-mail：tunghao@163.com

通信作者:梁春南，副主任技師。E-mail：chunnan_liang@nifdc.org.cn