黑烏龍茶茶多糖提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化與抑菌性分析

吳存兵，吳君艷，李家春，楊 嵐，王夢(mèng)媛

黑烏龍茶茶多糖提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化與抑菌性分析

吳存兵1，吳君艷2，李家春1，楊 嵐1，王夢(mèng)媛1

(1. 江蘇財(cái)經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院糧食與食品藥品學(xué)院，淮安 223003；2. 江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，淮安 223001)

為優(yōu)化黑烏龍茶茶多糖提取工藝，測(cè)定其抗氧化能力與抑菌性，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化茶多糖提取工藝，以蒽酮-硫酸法測(cè)定黑烏龍茶茶多糖含量，以還原力和DPPH清除能力為指標(biāo)，研究黑烏龍茶茶多糖的體外抗氧化，采用抑菌圈法研究茶多糖的抑菌性能。結(jié)果表明影響從黑烏龍茶中提取茶多糖的因素從高到低排序?yàn)椋撼樘釙r(shí)間﹥pH﹥料液比﹥抽提溫度。茶多糖的最佳提取條件為：試驗(yàn)原料經(jīng)處理過(guò)60目篩，浸提時(shí)間70 min，液料比21:1 mL·g-1，浸提溫度76 ℃，乙醇濃度75%，pH 5，提取2次，在此條件下黑烏龍茶多糖提取率為4.25%，與預(yù)測(cè)值接近。體外抗氧化表明，不同濃度的茶多糖抗氧化活性不同，隨著濃度的升高，抗氧化遞增趨勢(shì)；茶多糖對(duì)DPPH的清除率變化趨勢(shì)與茶多糖質(zhì)量濃度基本呈正相關(guān)。抑菌性研究表明茶多糖對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用，且對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出較好的抑制效果。試驗(yàn)所需設(shè)備簡(jiǎn)單、易操作，適合茶多糖的提取，為黑烏龍茶資源的精深加工和高值利用提供參考。

黑烏龍茶；多糖；提取工藝；抗氧化性；抑菌性

黑烏龍茶是商品烏龍茶的一種分類，又名油切黑烏龍茶，是選擇烏龍茶作為加工原材料，加入炭火，高溫烘焙，制作而成。黑烏龍茶可以促進(jìn)多余油脂排出體外，從而有效地抑制脂肪吸收。研究表明，茶多糖具有降血脂[1-3]、降血糖[4]等方面的功效。同時(shí)在抗凝[5]、防血栓形成、保護(hù)血相和增強(qiáng)人體非特異性免疫能力等方面均有明顯效果[6-7]。由于多糖多種多樣的生物活性功能以及在功能食品和臨床上廣泛使用，使多糖生物資源的開發(fā)利用和研究日益活躍，成為天然藥物、生物化學(xué)、生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，茶多糖在治療糖尿病方面具有一定的功效[8-10]。茶多糖在黑烏龍茶中含量高于紅茶和綠茶[11]，并且在粗老的芽葉中的含量高于嫩茶葉[12]。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)茶多糖提取工藝與生物活性進(jìn)行了試驗(yàn)研究。Scoparo等[13]以綠茶多糖與紅茶多糖分別作用于膿毒癥小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者分別降低致死率為40%和25%，試驗(yàn)通過(guò)處理顯著減少小鼠機(jī)體中嗜中性粒細(xì)胞的回流，研究分析此作用機(jī)制可能與其糖醛酸含量多少相關(guān)。林中正等[14]以黑烏龍茶和烏龍茶為研究對(duì)象，對(duì)比研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑烏龍茶中的可可堿和沒食子酸的含量略高。尚進(jìn)等[15]以鐵觀音茶梗為試驗(yàn)對(duì)象，研究茶多糖提取工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在浸提溫度100 ℃、浸提時(shí)間120 min、料液比為1: 40 g·mL-1、醇沉?xí)r間60 min的條件下，茶多糖提取率為2.97%。彭天祥等[16]采用水提醇沉法提取分離純化梯棱羊肚菌子實(shí)體多糖（MIP），研究發(fā)現(xiàn)，MIP具有優(yōu)良的自由基清除活性，對(duì)DPPH自由基的IC50值為（1.18 ± 0.04）mg·mL-1。王賀等[17]以茶粕多糖為原料，研究發(fā)現(xiàn)粗多糖的抗氧化優(yōu)于純化處理的多糖，在抑菌性能上，純化處理的多糖抑菌效果更好。鄭霖華等[18]以鐵觀音茶末為試驗(yàn)對(duì)象，研究了茶多糖提取及清除自由基能力，結(jié)果表明茶多糖具有較高的DPPH清除率。另外，Lee等[19]研究了茶多糖對(duì)致病菌黏附的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶葉多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌、幽門螺桿菌等病原菌均有抑制效果，對(duì)表皮葡萄球菌、大腸桿菌和嗜酸乳桿菌則沒有影響。

目前已有不少關(guān)于多糖的提取分離、檢測(cè)方法以及生物活性的研究，但主要集中在綠茶、紅茶、烏龍茶等茶類，關(guān)于響應(yīng)面設(shè)計(jì)水提醇沉黑烏龍茶多糖工藝及其抗氧化與抑菌性試驗(yàn)還鮮見報(bào)道。作者在前人研究的基礎(chǔ)上，選擇熱水浸提與醇沉淀的方法相結(jié)合，采用熱水—乙醇沉淀的方法來(lái)提取茶多糖，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化多糖提取工藝，以蒽酮—硫酸法測(cè)定黑烏龍茶多糖含量，以還原力和DPPH清除能力為指標(biāo)，研究黑烏龍茶多糖的體外抗氧化，采用抑菌圈法研究茶多糖的抑菌性能，以期為發(fā)掘黑烏龍茶作為高附加值產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)，從而提高茶葉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

黑烏龍茶購(gòu)自安溪思泓茶業(yè)有限公司，粉碎后過(guò)60目篩；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、硫酸、蒽酮、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、DPPH和Vc均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

篩網(wǎng)（60目）購(gòu)自九峰篩網(wǎng)金屬絲網(wǎng)廠，紫外可見分光光度計(jì)（UV1801）購(gòu)自北京北分瑞利分析儀器有限公司，電子天平（BSA-CW）購(gòu)自北京賽多利斯天平有限公司，離心沉淀機(jī)（80-2型）購(gòu)自北京天創(chuàng)尚邦儀器設(shè)備有限公司，電動(dòng)鼓風(fēng)干燥箱（DHZG-9070A）購(gòu)自南京電器三廠，電熱恒溫水浴鍋（HWS28型）購(gòu)自上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司，多用振蕩器（HY-3型）購(gòu)自常州越新儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黑烏龍茶多糖提取工藝 準(zhǔn)確稱取處理好的黑烏龍茶粉2.0 g于錐形瓶中，加入一定體積蒸餾水將其溶解，調(diào)整溶液pH值，放置水浴鍋中，加熱，取出冷卻，離心（2 000 r·min-1，25 min）后，吸取上清液，過(guò)濾合并濾液，濃縮，加入一定濃度的乙醇沉淀，低溫靜置24 h，離心分離沉淀物，干燥后稱重[20]。用少量水溶解定容配制成茶多糖溶液，取適量茶多糖溶液，利用蒽酮—硫酸法測(cè)出吸光值，從而計(jì)算多糖提取率。

其中，為茶多糖溶液濃度（mg·mL-1）；為茶多糖溶液體積（mL）；為換算因子；為黑烏龍茶茶葉的質(zhì)量（g）。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確稱取0.2 g葡萄糖于50 mL燒杯中，用蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至500 mL的容量瓶?jī)?nèi)，定容。然后分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mL于具塞試管中，再用蒸餾水定容至1.0 mL，分別加入現(xiàn)配的蒽酮—硫酸試劑4 mL，立即搖勻，溶液呈現(xiàn)翠綠色，用連續(xù)不斷的水流沿試管外壁，緩緩流下，以手背觸及外壁無(wú)明顯熱度為止，將各試管一起置于沸水浴中加熱7 min，迅速置于冷水中冷卻10 min，在478 nm處測(cè)得吸光度[21]，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖溶液濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為：= 4.094 3– 0.003 4，R= 0.999 3。

表1 Box-Behnken8.0設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 考察浸提時(shí)間（30、40、50、60和70 min）、液料比（10:1、15:1、20:1、25:1和30:1 mL·g-1）、浸提溫度（60、65、70、75和80 ℃）、乙醇濃度（55%、65%、75%、85%和95%）、pH（1、4、7、10和13）和抽提次數(shù)（1、2、3和4次）對(duì)黑烏龍茶多糖提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參考單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box－Benhnken8.0設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化黑烏龍茶多糖提取工藝，以提取率為響應(yīng)值，選取浸提時(shí)間、液料比、浸提溫度和pH 4因素為自變量，以–1、0、1分別代表變量的3個(gè)水平。中心組合設(shè)計(jì)的因素與水平見表1。

一年級(jí)《荷葉圓圓》這篇課文里，小水珠把荷葉當(dāng)作搖籃，蜻蜓把荷葉當(dāng)作停機(jī)坪，小青蛙把荷葉當(dāng)作歌臺(tái)，小魚兒把荷葉當(dāng)作雨傘。學(xué)生初讀后就產(chǎn)生一種快樂(lè)的情感體驗(yàn)。我趁機(jī)問(wèn)：“此時(shí)此刻你們想把這圓圓的、綠綠的荷葉當(dāng)作什么呢？”這個(gè)問(wèn)題簡(jiǎn)直像“開窗放入大江來(lái)”，一下子打開學(xué)生相互交流的閘門。學(xué)生有的說(shuō)，在這炎炎夏日，我把荷葉當(dāng)作涼帽；有的說(shuō)，我把荷葉當(dāng)作扇子；還有的說(shuō)，我喜歡穿裙子，我把荷葉圍在身上，當(dāng)作天然的美麗的裙子……眾說(shuō)紛紜，智慧飛揚(yáng)。

1.2.5 抗氧化性測(cè)定 （1）還原力測(cè)定。采用普魯士藍(lán)法[22-23]中的實(shí)驗(yàn)步驟加以改進(jìn)，具體操作如下：取不同質(zhì)量濃度（2、6、10、14和18 mg·mL-1）茶多糖試驗(yàn)樣品2.0 mL于試管中，依次加入0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液1.0 mL、1%鐵氰化鉀溶液1.0 mL、10%的三氯乙酸溶液1.0 mL和0.1%氯化鐵溶液0.1 mL，靜置10 min，于700 nm檢測(cè)吸光度值的變化。

（2） DPPH自由基清除率測(cè)定[24]。取不同質(zhì)量濃度樣品液0.5 mL于試管中，添加無(wú)水乙醇至3.0 mL使其最終質(zhì)量濃度為（2、6、10、14和18 mg·mL-1），然后再加入0.1 mmol·L-1的DPPH溶液3.0 mL，總體積為6.0 mL，混勻靜置反應(yīng)30 min，于517 nm處比色測(cè)定吸光值。其中，對(duì)照為3.0 mL無(wú)水乙醇與3.0 mL的DPPH溶液靜置反應(yīng)后的吸光度數(shù)值。DPPH自由基清除率計(jì)算公式為：

式中:0為未加樣品的DPPH自由基吸光度；1為加入樣品后的吸光度；2為樣品的空白對(duì)照吸光度。

1.2.6 抑菌活性測(cè)定 將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌接種至斜面培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，將菌種稀釋于無(wú)菌水中，制備成菌懸液，再將滅菌后的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，待其凝固后，取1 mL 菌懸液倒入培養(yǎng)皿中，涂布均勻，將浸泡過(guò)無(wú)菌水和茶多糖溶液(10 mg·mL-1) 的濾紙片(直徑6 mm)，輕放在培養(yǎng)基表面，將培養(yǎng)皿置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，24 h后觀察測(cè)量培養(yǎng)皿中抑菌圈直徑大小[17]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

單因素試驗(yàn)結(jié)果采用Duncan法進(jìn)行多重比較分析，顯著性水平為< 0.05；響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Box－Benhnken8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸提時(shí)間對(duì)黑烏龍茶多糖提取率的影響

在固定液料比20:1 mL·g-1、提取溫度75 ℃、提取2次、pH7、乙醇濃度75%的條件下，考察浸提時(shí)間30、40、50、60和70 min對(duì)多糖提取率的影響。由圖1（a）可知，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，黑烏龍茶多糖提取率不斷增加，在30～50 min內(nèi)，茶多糖提取率不斷增加，且上升趨勢(shì)顯著，在50～70 min之間增加幅度變小。這可能因?yàn)殡S著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，多糖分子中的五碳環(huán)或六碳環(huán)可能裂解成為可溶于乙醇的寡糖、低聚糖或單糖，造成多糖在醇沉過(guò)程中溶解損失增加。此外，超聲波空化效應(yīng)作用力減小，會(huì)影響多糖溶出。這些因素都會(huì)導(dǎo)致多糖得率的下降[25-26]?？紤]到提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)增加其他溶解性雜質(zhì)，選擇提取時(shí)間為70 min。

2.2 液料比對(duì)黑烏龍茶多糖提取率的影響

在固定浸提時(shí)間70 min、提取溫度75 ℃、提取2次、pH7、乙醇濃度75%的條件下，考察液料比10:1、15:1、20:1、25:1 和30:1 mL·g-1對(duì)多糖提取率的影響。由圖1（b）可知，液料比在10:1～20:1 mL·g-1之間增加明顯，茶多糖提取得率較高；當(dāng)液料比為20:1 mL·g-1時(shí)，提取率最高，其原因可能為溶劑體積的增加使得溶液中多糖濃度下降，多糖分子擴(kuò)散的壓力差增大，有利于多糖分子的擴(kuò)散和溶出；在20:1～30:1 mL·g-1之間，提取率有降低趨勢(shì)，當(dāng)液料比增大至一定程度，可能會(huì)致使后續(xù)的提取濃縮隨時(shí)間增加，多糖損失升高，導(dǎo)致多糖提取率下降[27]。因此，液料比選擇為20:1 mL·g-1。

2.3 浸提溫度對(duì)黑烏龍茶多糖提取率的影響

浸提溫度對(duì)多糖提取率的影響如圖1（c）所示。在固定浸提時(shí)間70 min、液料比20:1 mL·g-1、提取2次、pH 7、乙醇濃度75%的條件下，考察提取溫度60、65、70、75和80 ℃對(duì)多糖提取率的影響。由圖1（c）可知，浸提溫度在60～75 ℃之間，隨著溫度的不斷增加，黑烏龍茶多糖提取得率也逐漸升高，在75 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最高，浸提溫度在75～80 ℃之間，提取率逐漸減少，其原因可能是在一定范圍內(nèi)，提取溫度的升高，有利于分子的運(yùn)動(dòng)和多糖的溶出；溫度過(guò)高則會(huì)影響到多糖的結(jié)構(gòu)，會(huì)促使多糖提取率降低[28]。因此，黑烏龍茶多糖浸提溫度在75 ℃左右較好。

圖1 各因素對(duì)茶多糖提取率影響

Figure 1 Effects of different factors on the extraction rate of tea polysaccharide

2.4 乙醇濃度對(duì)黑烏龍茶多糖提取率的影響

2.5 pH值對(duì)黑烏龍茶多糖提取率的影響

在固定浸提時(shí)間70 min、液料比20:1 mL·g-1、提取溫度75℃、提取2次、乙醇濃度75%的條件下，考察pH為1、4、7、10和13條件下對(duì)多糖提取率的影響。pH對(duì)多糖提取率的影響結(jié)果（圖1（e））顯示：當(dāng)pH在 1～4之間，隨著pH的不斷升高，茶多糖提取率逐漸升高；當(dāng)pH在4～13之間，隨著pH的不斷升高，茶多糖提取率降低。因此pH為4時(shí)提取茶多糖較適宜。

2.6 浸提次數(shù)對(duì)黑烏龍茶多糖提取率的影響

在固定浸提時(shí)間70 min、液料比20:1 mL·g-1、提取溫度75 ℃、pH 7、乙醇濃度75%的條件下，考察浸提次數(shù)1、2、3和4次對(duì)多糖提取率的影響。浸提次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響結(jié)果（圖1（f））表明，在浸提2次之后，提取率趨于穩(wěn)定，為了降低生產(chǎn)成本，建議浸提2次即可。

2.7 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.7.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)各單因素試驗(yàn)對(duì)黑烏龍茶多糖提取率的影響及分析，選擇浸提時(shí)間、液料比、浸提溫度和pH等4個(gè)因素作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)安排29個(gè)處理組合，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析

注：*表示顯著差異（<0.05），**表示極顯著差異（<0.01）。

根據(jù)表2中的29個(gè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)組合的結(jié)果，利用Design Expert軟件建立的茶多糖提取率對(duì)浸提時(shí)間、液料比、浸提溫度和pH的二次方程模型為：

=3.84 – 0.26+ 0.059+ 0.035+0.076+ 9.500–003+0.075–0.017–0.067+ 0.10– 0.060+0.0462– 0.192– 0.242– 0.122

對(duì)響應(yīng)面設(shè)計(jì)模型開展方差分析，結(jié)果（表3）表明，模型的＝25.93和＜0.01，即該模型是顯著的。模型失擬項(xiàng)= 0.067 9＞0.05，相關(guān)系數(shù)2= 0.962 9，調(diào)整系數(shù)2= 0.925 7，即模型失擬項(xiàng)不顯著，擬合程度好，響應(yīng)值的變化有92.57%源于試驗(yàn)所選影響因素，即來(lái)源于浸提時(shí)間、液料比、浸提溫度和pH，說(shuō)明模型擬合度較好，具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，變異系數(shù)CV為1.85%，說(shuō)明試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭噩F(xiàn)性好，即模型適用于黑烏龍茶多糖提取工藝的優(yōu)化。

在回歸模型中，一次項(xiàng)A、B和D（＜0.01）極顯著，一次項(xiàng)C（＜0.05）顯著；二次項(xiàng)B２、C２和D２極顯著（＜0.01），二次項(xiàng)A２不顯著（＞0.05）。交互項(xiàng)BD 對(duì)提取率的影響極顯著（＜0.01），交互項(xiàng)AC 和BC對(duì)提取率的影響顯著（＜0.05），交互項(xiàng)AB、AD和CD對(duì)提取率的影響不顯著（＞0.05）。4項(xiàng)因素對(duì)提取率影響的大小依次為浸提時(shí)間> pH > 液料比> 浸提溫度。

2.7.2 響應(yīng)面分析 浸提時(shí)間、液料比、浸提溫度和pH這4因素間的交互作用對(duì)黑烏龍茶多糖提取效果影響的三維空間響應(yīng)面圖如圖2所示。從4個(gè)試驗(yàn)因素交互作用的響應(yīng)面3D及等值線分布可以看出，每個(gè)雙因素交互作用的響應(yīng)面曲張程度不同，液料比（B）與浸提時(shí)間（D）交互作用響應(yīng)面曲張程度最為突出，即液料比（B）與浸提時(shí)間（D）的交互項(xiàng)的影響相對(duì)其他交互項(xiàng)顯著，這與試驗(yàn)的方差分析結(jié)果一致。

圖2 各因素交互作用對(duì)茶多糖提取率影響的響應(yīng)

Figure 2 Response surface factors on the extraction yield of tea polysaccharide

2.7.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 在最佳提取工藝條件下，浸提時(shí)間70 min，液料比21.17:1 mL·g-1，浸提溫度75.8 ℃，乙醇濃度75%，pH 5.28，提取2次，在此條件下黑烏龍茶多糖提取率的預(yù)測(cè)值為4.17%。為驗(yàn)證響應(yīng)面法獲得結(jié)果的可信度，在實(shí)際試驗(yàn)中選取修正條件為：浸提時(shí)間70 min，液料比21:1 mL·g-1，浸提溫度76 ℃，乙醇濃度75%，pH 5，提取2次。在此條件下實(shí)際測(cè)得的黑烏龍茶多糖提取率為4.25%，與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差約為1.88%。說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑烏龍茶多糖的提取工藝具有可行性。

圖3 不同質(zhì)量濃度茶多糖還原力變化

Figure 3 Changes in reducing power of different concentrations of tea polysaccharide

圖4 不同質(zhì)量濃度茶多糖對(duì)DPPH清除的效果

Figure 4 Scavenging effects of tea polysaccharides from dark oolong tea on DPPH free radical

圖5 茶多糖的抑菌活性

Figure 5 Antibacterial activity of tea polysaccharides from dark oolong tea

2.8 抗氧化性分析

2.8.1 茶多糖還原力表達(dá) 茶多糖的還原力分析結(jié)果（圖3）表明，不同濃度的茶多糖抗氧化活性不同，隨著濃度的升高，抗氧化呈遞增趨勢(shì)。在茶多糖濃度由2 mg·mL-1升高至10 mg·mL-1時(shí)，抗氧化遞增趨勢(shì)顯著，在茶多糖濃度由10 mg·mL-1升高至18 mg·mL-1時(shí)，吸光度達(dá)到0.627，抗氧化遞增趨勢(shì)放緩。說(shuō)明低濃度茶多糖還原力明顯弱于Vc，隨著濃度增加，其還原力有一定增加的趨勢(shì)，但仍低于Vc，這說(shuō)明其還原力較弱[30]。

2.8.2 茶多糖對(duì)DPPH清除率效果 茶多糖對(duì)DPPH的清除率變化結(jié)果（圖4）顯示，DPPH清除率變化趨勢(shì)與茶多糖質(zhì)量濃度基本呈正相關(guān)，隨著茶多糖濃度升高，DPPH清除率逐漸升高，茶多糖濃度為18 mg·mL-1時(shí)，DPPH清除率達(dá)到72.47%。低濃度茶多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力明顯弱于Vc，隨著濃度增加，其清除率有一定增加的趨勢(shì)，其DPPH清除率IC50值為8.41 mg·mL-1。

2.9 抑菌活性分析

采用濾紙片法研究茶多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抑制效果，以抑菌圈直徑的大小為評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果（圖5）顯示，黑烏龍茶多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有抑制作用，抑菌圈直徑分別為（8.70 ± 0.08）、（9.82 ± 0.05）和（7.81 ± 0.05）mm，其中，對(duì)大腸桿菌的抑制效果較好。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)篩選出最佳提取工藝條件為：試驗(yàn)原料經(jīng)處理過(guò)60目篩，浸提時(shí)間70 min，液料比21:1 mL·g-1，浸提溫度76 ℃，乙醇濃度75%，pH 5，提取2次，在此條件下實(shí)際測(cè)得的黑烏龍茶多糖提取率為4.25%，與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差約為1.88%。說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑烏龍茶多糖的提取工藝具有可行性。

通過(guò)茶多糖的抗氧化性和抑菌性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出：不同濃度的茶多糖抗氧化活性不同，抗氧化性與茶多糖濃度呈正相關(guān)，茶多糖濃度為18 mg·mL-1時(shí)，吸光度達(dá)到0.627；茶多糖對(duì)DPPH的清除率變化趨勢(shì)與茶多糖質(zhì)量濃度基本呈正相關(guān)，茶多糖濃度為18 mg·mL-1時(shí)，DPPH清除率達(dá)到72.47%。采用濾紙片法研究茶多糖對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑最大為（9.82±0.05） mm，對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出較好的抑制效果。本研究?jī)?yōu)化了黑烏龍茶多糖提取工藝，所需設(shè)備簡(jiǎn)單、易操作，適合茶多糖的提取，具有較高的可行性，為茶類資源的精深加工和高值利用奠定一定的基礎(chǔ)。

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Optimized extraction condition of tea polysaccharide from dark oolong tea and analysis of its antioxidant and antibacterial activity

WU Cunbing1, WU Junyan2, LI Jiachun1, YANG Lan1, WANG Mengyuan1

(1. School of Grain and Food & Pharmacy, Jiangsu Vocational College of Finance & Economics, Huai’an 223003; 2. Jiangsu Food & Pharmaceutical Science College, Huai’an 223001)

In this research, in order to optimize extraction conditions of tea polysaccharide from dark oolong tea and determine its antioxidant activity and bacteriostatic capacities, tea polysaccharide content in dark oolong tea was determined by anthrone-sulfuric acid method, and the extraction process of tea polysaccharide was optimized by response surface method. The antioxidant activity of tea polysaccharide from dark oolong tea was explored by using reducing power and DPPH scavenging rate, meanwhile, the antimicrobial activities of tea polysaccharide from dark oolong tea were further investigated. The variance analysis showed that the extraction rate of tea polysaccharide from dark oolong tea was affected by following: extracting time > pH > liquid-to-material ratio > extraction temperature. The optimal extraction conditions were: 60 mesh; extracting time, 70 min; liquid-to-material ratio, 21:1 mL·g-1; extraction temperature, 76 ℃; ethanol concentration, 75%; pH 5; and extraction times, twice．Under these conditions, the extraction rate of tea polysaccharide from dark oolong tea was 4.25%，which was close to the predicted value. The results ofantioxidant and bacteriostatic experiments showed that the antioxidant activity of tea polysaccharides in different concentrations was different through the analysis of the reducing power of tea polysaccharides. The scavenging activity of DPPH radicals and reducing capacity showed that its extracts had dose-effect relationship with the increase of the concentration. Tea polysaccharides had inhibitory effect on,and, and showed better inhibitory effect onthanand. The equipment used in the experiment is simple and easy to operate, and the experimental method is suitable for the extraction of tea polysaccharide from dark oolong tea, which provides references for the deep processing and high-value utilization of dark oolong tea resources.

dark oolong tea; polysaccharide; extraction process; antioxidant activity; antibacterial activity

TS272.59

A

1672-352X (2021)06-1005-08

10.13610/j.cnki.1672-352x.20220106.004

2022-1-7 13:52:40

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.s.20220106.1230.008.html

2021-07-14

國(guó)家中藥標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目（ZYBZH-C-JS-28），科技部重大新藥創(chuàng)制（2013ZX09402203），江蘇高校“青藍(lán)工程”項(xiàng)目和淮安市“ 533”英才工程項(xiàng)目共同資助。

吳存兵，副教授。E-mail：wucunbingw@163.com