紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)卵黃蛋白原未知功能結(jié)構(gòu)域(DUF1943)的原核表達(dá)及純化鑒定

王 瑞，韋孜娜，呂 敏，楊彥豪，黃黎明，韋秀穎，盧天和，黃光華，楊慧贊*

紅螯螯蝦()卵黃蛋白原未知功能結(jié)構(gòu)域(DUF1943)的原核表達(dá)及純化鑒定

王 瑞1，韋孜娜1，呂 敏1，楊彥豪1，黃黎明1，韋秀穎2，盧天和1，黃光華1，楊慧贊1*

(1. 廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，南寧 530021; 2. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005)

通過(guò)外源表達(dá)并純化得到紅螯螯蝦()卵黃蛋白原(Vitellogenin,Vg)的DUF1943結(jié)構(gòu)域片段，為開展其后續(xù)相關(guān)功能及機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的紅螯螯蝦卵基因序列(登錄號(hào)AF306784.1)，查找到DUF1943結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(617—918aa)，對(duì)其理化性質(zhì)與基本結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了理論評(píng)估，結(jié)合大腸桿菌密碼子偏好對(duì)其進(jìn)行了序列改造和密碼子優(yōu)化，采用全基因合成的方法得到了的基因片段，將其連接到Pet28a(+)內(nèi)構(gòu)建了Pet28a(+)-的融合表達(dá)載體，探索了該融合載體在大腸桿菌系統(tǒng)中的最佳表達(dá)參數(shù)，采用溶解法和上柱層析法對(duì)收獲到的蛋白包涵體進(jìn)行復(fù)性。全基因合成方法制備得到的目的基因?yàn)?21 bp，成功構(gòu)建了Pet28a(+)-的融合表達(dá)載體，誘導(dǎo)Pet28a(+)-表達(dá)的最佳條件為：當(dāng)單克隆菌液OD600達(dá)到0.6 時(shí)，添加0.5 mmol·L-1的誘導(dǎo)劑IPTG，置于37 ℃條件下培養(yǎng)4 h。表達(dá)的DUF1943多肽以包涵體形式為主，在SDS-PAGE膠的35 kDa附近呈現(xiàn)特異性條帶，收集包涵體進(jìn)行破碎，經(jīng)2 mol·L-1鹽酸胍溶解和Ni-NTA層析后最終收獲到的活性蛋白濃度為0.6 mg·mL-1。成功構(gòu)建了Pet28a(+)-原核表達(dá)載體并優(yōu)化了表達(dá)系統(tǒng)及蛋白復(fù)性方案，獲得了DUF1943活性多肽，為進(jìn)一步研究其生物功能及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

卵黃蛋白原；基因；原核表達(dá)；純化；復(fù)性

卵黃發(fā)生是指各種卵黃物質(zhì)的形成及其在卵母細(xì)胞中的積累，是卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的必要前提，也是雌性甲殼動(dòng)物生殖周期的決定性時(shí)期[1]。卵黃是由母體供應(yīng)的，含有多種營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì)成分，為蝦類正在發(fā)育的早期胚胎和幼體提供所必需的能量物質(zhì)。因此，卵黃的產(chǎn)生對(duì)于蝦類的早期生長(zhǎng)發(fā)育有著關(guān)鍵性的作用。Abdu等[2]分別提純和鑒定了斑節(jié)對(duì)蝦()、中國(guó)對(duì)蝦()和羅氏沼蝦()的卵黃蛋白（yolk protein），均為一種雌性的高密度脂蛋白(HDL)。Oberd?rste證明了卵黃蛋白是胚胎發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)源[3]。

卵黃蛋白原(vitellogenin，Vg)是卵黃蛋白的前體，最初是Pan等[4]用于描述雌性昆蟲血液中一種特殊淋巴蛋白，后來(lái)逐漸成為一些魚類、禽類等性成熟的雌性脊椎動(dòng)物的特異性血清蛋白的代名詞[5-8]。卵生動(dòng)物在雌激素誘導(dǎo)作用下，于卵巢以外的不同組織中(如海膽體腔細(xì)胞；魚類、鳥類肝臟；甲殼動(dòng)物濾泡細(xì)胞等)表達(dá)和合成卵黃蛋白原，經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)分泌運(yùn)送到卵巢組織，在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入卵細(xì)胞，準(zhǔn)確地表達(dá)了卵細(xì)胞的正常發(fā)育，為早期發(fā)育的胚胎組織提供了所需的脂肪、氨基酸、碳水化合物、磷和硫、維生素等功能性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)卵細(xì)胞的生長(zhǎng)分化[9-14]。對(duì)卵黃蛋白原的結(jié)構(gòu)研究表明，卵黃原蛋白編碼的3個(gè)結(jié)構(gòu)域，它們分別是位于N端功能序列的結(jié)構(gòu)域(vitellogenin-N)、位于C端的蛋白成分結(jié)構(gòu)域(von Willebrand factor type D domain, vWD)以及富含磷酸化的結(jié)構(gòu)域(domain of unknow function, DUF1943, DUF1944)[15-16]。這些結(jié)構(gòu)域的分子結(jié)構(gòu)在不同物種中，具有一定的保守性[17]。紅螯螯蝦()俗稱澳洲淡水龍蝦，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)極具潛力的淡水經(jīng)濟(jì)蝦類之一。卵黃發(fā)生過(guò)程中，消化酶和同工酶對(duì)卵黃的水解作用使其為紅螯螯蝦胚胎發(fā)育提供了重要的結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì)保障。近年來(lái)，對(duì)甲殼動(dòng)物消化酶和同工酶的結(jié)構(gòu)及功能研究多集中在幼體和成體的發(fā)育階段[18-19]。而對(duì)于Vg的研究多集中在蛋白整體功能上，而具體針對(duì)其結(jié)構(gòu)域的功能研究較少。結(jié)構(gòu)決定功能，Vg蛋白結(jié)構(gòu)域的差異正是其種間特異性的基礎(chǔ)，因此對(duì)Vg蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行獨(dú)立的研究有利于更深入地認(rèn)識(shí)和發(fā)現(xiàn)其功能和作用機(jī)制。

本研究根據(jù)紅螯螯蝦的Vg序列上的DUF1943結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行理論評(píng)估，結(jié)合大腸桿菌密碼子的偏好性，對(duì)目的序列進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，采用全基因合成的方法克隆出了Vg的序列，并成功構(gòu)建了Pet28a(+)-原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)其在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中表達(dá)，進(jìn)而純化獲得DUF1943蛋白，為進(jìn)一步研究DUF1943的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒Pet28a(+)、LB肉湯瓊脂培養(yǎng)基、非預(yù)染蛋白Marker、預(yù)染蛋白Marker、非干擾型蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、TMB顯色試劑盒、IPTG均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶均購(gòu)自Promega公司；其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)。

緩沖液A為pH 8.0的PBS；緩沖液B為8 mol·L-1Urea, 50 mmol·L-1Tris-HCl和300 mmol·L-1NaCl的混合液，pH 8.0；緩沖液C為50 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，0.2 mmol·L-1PMSF和0.1% Triton X-100，pH 8.0；Binding buffer為50 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，pH 8.0；Washing buffer為50 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl和20/50 mmol·L-1Imidazole，pH 8.0；Elution buffer為50 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl 和500 mmol·L-1Imidazole，pH 8.0。

JY88-II超聲波細(xì)胞破碎儀(天津津立儀器設(shè)備科技發(fā)展有限公司)；HZQ-F280全溫度振蕩培養(yǎng)箱(常州銳品精密儀器有限公司)；GL-21M高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 DUF1943生物信息學(xué)分析 登錄NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ipg/?term=AF306784.1)查找到紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)基因的mRNA序列(登錄號(hào)：AF306784.1)，定位到其中DUF1943(617—918aa)結(jié)構(gòu)域的基因序列，利用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)查找序列的開放閱讀框并翻譯其編碼的氨基酸序列，將翻譯的氨基酸序利用ExPAsy數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.expasy.org/)的在線工具：ProtParam tool、ProtScale和InterProscan及TMHMM (http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)DUF1943的親水性、信號(hào)肽、跨膜域、基本結(jié)構(gòu)等生物學(xué)信息進(jìn)行分析和理論評(píng)估。利用在線平臺(tái)Cell-PLoc-2 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)選擇真核生物系統(tǒng)(Euk-mPLoc2.0)對(duì)紅螯螯蝦DUF1943編碼的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位；NetPhos 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0)分析其磷酸化位點(diǎn)，借助SignalP 5.0在線服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，選擇真核生物類型(Eukaryotes)進(jìn)行蛋白常規(guī)的分泌通路(Sec/secretory)和I型信號(hào)肽酶(SPaseI)，即真核生物僅含有的Sec/SPI信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)。最后，采用在線工具SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 Pet28a(+) -重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)序列的評(píng)估結(jié)果以及大腸桿菌的密碼子偏好性，利用在線分析系統(tǒng)OPTIMIZER (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/")和DNA Works (https://hpcwebapps.cit.nih.gov/dnaworks/)對(duì)(617—918aa)序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化和序列改造，設(shè)計(jì)出目的片段的全基因合成方案委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。全基因合成的策略是將優(yōu)化后的目的片段分割成42段帶有重疊序列的寡核苷酸片段(即Oligos引物，其外側(cè)首尾引物分別為：F: 5′-GACACAAATACTCTC-3′；R: 5′- GTGTCTTACGG-3′,下劃線是H I和l的酶切位點(diǎn))，先將合成的42段寡核苷酸混合到一個(gè)體系中，通過(guò)第1輪PCR反應(yīng)中多個(gè)熱循環(huán)和退火實(shí)現(xiàn)目的片段的全長(zhǎng)序列拼接，再利用首尾引物，通過(guò)第2輪PCR進(jìn)一步擴(kuò)增和富集全長(zhǎng)目的基因。PCR反應(yīng)采用的是高溫聚合酶，第一輪重疊延伸PCR反應(yīng)體系為50 μL：42對(duì)引物mix 0.5 μL×42，共22.0 μL(引物濃度為1 OD溶于400 μL ddH2O)，dNTP(25 mmol·L-1)1.0 μL，10×Buffer 5.0 μL，0.4 μL(5 U·μL-1)，補(bǔ)充ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性22 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。以第1輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL：首尾引物各2 μL(引物濃度同上)，第1輪PCR產(chǎn)物1.0 μL，dNTP(25 mmol·L-1)1.0 μL，10×Buffer 5.0 μL，0.4 μL(5 U·μL-1)，補(bǔ)充ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性22 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸60 s，24個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。對(duì)最后一輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并對(duì)特異性條帶進(jìn)行純化回收。

選取pET28a作為表達(dá)載體，根據(jù)引物設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，利用H I和l對(duì)PCR反應(yīng)后純化回收得到的目的片段和質(zhì)粒載體Pet28a(+)分別進(jìn)行雙酶切。酶切體系為50 μL：純化的目的片段1.0 μg, 10×FD buffer 5.0 μL,H I 1.0 μL(10 U·μL-1)，l 1.0 μL(10 U·μL-1), 補(bǔ)充ddH2O至50 μL。載體Pet28a(+)的酶切體系為50 μL：Pet28a(+) 1.0 μg, 10×FD buffer 5.0 μL,H I1.0 μL(10 U·μL-1),l 1.0 μL(10 U·μL-1)補(bǔ)充ddH2O 至50 μL。將上述兩個(gè)體系分別放入37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)2 h。對(duì)酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳檢測(cè)，并對(duì)目的產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。

將酶切后純化回收的目的基因片段和Pet28a(+)載體進(jìn)行連接，連接體系為20 μL：目的片段的酶切產(chǎn)物8 μL，載體Pet28a(+)的酶切產(chǎn)物 4 μL，10×T4 DNA ligase buffer 2.0 μL，T4 DNAigase 1 μL (5 U·μL-1)，補(bǔ)充ddH2O 至20 μL。將上述連接混合液放入16 ℃的PCR儀內(nèi)反應(yīng)1 h以上，轉(zhuǎn)入Top10感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，均勻涂布到含有卡拉霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，篩選出陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，再次進(jìn)行酶切驗(yàn)證，反應(yīng)體系為：質(zhì)粒100 ng，10×FD buffer 1.0 μL，H I 1.0 μL(10 U·μL-1),l 1.0 μL(10 U·μL-1), 補(bǔ)充ddH2O 至10 μL，置于37 ℃恒溫水浴鍋中消化2 h。取5.0 μL消化產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。經(jīng)電泳分析正確后，將陽(yáng)性克隆接種到含卡拉霉素的LB肉湯中，250 r·min-1，培養(yǎng)過(guò)夜，菌液送往北京華大(BGI)公司測(cè)序分析。測(cè)序采用的引物是Pet28a(+)載體上的T7啟動(dòng)子和終止子的通用引物序列(上游測(cè)序引物為：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′，下游測(cè)序引物為：5′- GCTAGTTATTGCTCAGCGGG-3′)。

1.2.3 DUF1943蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 經(jīng)電泳和測(cè)序驗(yàn)證后，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為 Pet28a(+)-，挑取陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(λDE3)，熱激后涂布在含有卡拉霉素的LB平板上37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單克隆菌落接種到含有卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃進(jìn)行活化培養(yǎng)；當(dāng)菌液OD600達(dá)到 0.6 時(shí)，添加一定濃度的誘導(dǎo)劑IPTG，分別于16 ℃以及20 ℃條件下培養(yǎng)16 h，37 ℃條件下培養(yǎng)4 h，設(shè)置未添加誘導(dǎo)劑的為陰性對(duì)照；取菌液經(jīng)12 000 r·min-1離心5 min，棄上清，收集菌體沉淀；向其中加入PBS(pH 7.4)使其懸浮，利用超聲破碎儀使其充分溶解，離心，棄上清，向沉淀中加入緩沖液A(8 mol·L-1Urea, 50 mmol·L-1Tris-HCl, 300 mmol·L-1NaCl, pH 8.0)進(jìn)行溶解，再次離心，向上清和沉淀中分別加入等體積的2×Loading buffer煮沸，上樣，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，由考馬斯亮藍(lán)(R250)染色的深淺程度來(lái)來(lái)確定蛋白表達(dá)情況，進(jìn)而確定誘導(dǎo)表達(dá)所需的最佳的IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度以及誘導(dǎo)時(shí)間。最后，以最佳的誘導(dǎo)條件進(jìn)行大量表達(dá)，菌液在4 ℃下經(jīng)3 000 r·min-1離心10 min后，收集菌體沉淀。

1.2.4 DUF1943重組蛋白的純化 向收集到的菌體中加入緩沖液B(8 mol·L-1Urea，50 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，0.1% Triton X-100，pH 8.0) 4 ℃靜置30 min，置于冰上進(jìn)行200 W的多次間歇性超聲破碎，見菌液澄清后，再行4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，收集上清粗蛋白(包涵體)，加入2 mol·L-1的鹽酸胍對(duì)其進(jìn)行溶解，接著取 5 mL 的Ni-NTA柱子，用5倍柱床體積的 Binding buffer 清洗平衡柱子，流速 5 mL·min-1；將粗蛋白與平衡后的柱填料孵育1 h；將孵育后的產(chǎn)物上柱進(jìn)行提純和復(fù)性，收集流出；首先用Binding buffer 清洗平衡柱子；接著用Washing buffer 洗柱子，并收集流出液；最后用Elution buffer 再次洗脫，收集流出液，對(duì)粗蛋白、洗雜流出液、洗脫流出液分別處理，進(jìn)行10% SDS-PAGE和R250染色分析。將純度較好的6個(gè)組分分別加入到緩沖液C(50 mmol·L-1Tris，300 mmol·L-1NaCl，0.1% SKL，pH 8.5)進(jìn)行透析，透析結(jié)束后用PEG20000濃縮，0.45 μm濾膜過(guò)濾后分裝為1 mL·tube-1，–80 ℃保存。

1.2.5 DUF1943蛋白的鑒定 對(duì)復(fù)性且純化后的目的蛋白進(jìn)行制樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，在200 mA恒定電流及低溫條件下磚模(PVDF) 2 h，再用5% 脫脂奶粉的TBST封閉2 h后，將兔抗His-Tag單抗進(jìn)行1 : 2 000稀釋，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體進(jìn)行1 : 5 000稀釋，常溫下孵育過(guò)夜，洗膜3次，將TMB顯色液滴加到PVDF膜上進(jìn)行顯色，拍照分析，進(jìn)行Western Blot特異性驗(yàn)證。最后，采用非干擾型蛋白定量試劑盒測(cè)定最終純化產(chǎn)物的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DUF1943結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)信息

2.1.1 DUF1943結(jié)構(gòu)域的基本理化性質(zhì) DUF1943結(jié)構(gòu)域的的相對(duì)分子質(zhì)量W為37 445.7，理論等電點(diǎn)pI為6.85，負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)總數(shù)為36，正電荷殘基(Arg+Lys)總數(shù)為31，說(shuō)明DUF1943結(jié)構(gòu)域?yàn)閹д姷牡鞍住５鞍坠灿?jì)5 201個(gè)原子，分子式為: C1673H2562N454O498S14，不穩(wěn)定系數(shù)為37.57，小于40，表明DUF1943結(jié)構(gòu)域?yàn)榉€(wěn)定型蛋白。

圖1 DUF1943蛋白的疏水性分析

Figure 1 Analysis of the hydrophobicity of DUF1943 protein

圖2 DUF1943蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)分析

Figure 2 Prediction and analysis of transmembrane region of DUF1943 protein

2.1.2 DUF1943蛋白疏水性及跨膜區(qū)分析基因編碼蛋白由336個(gè)氨基酸組成，其脂肪指數(shù)為76.37，親水性平均值(grand average of hydropathicity, GRAVY)為- 0.285，結(jié)合Protscale的在線評(píng)估表明：序列中含有較多的親水性氨基酸，親水性區(qū)段主要為：1～9、11～22、29～40、52～61、70～82、91～99、102～121、122～132、151～163、172～180、190～193、210～220、222～231、238～245、255～260、262～282和289～302(圖1)，序列親水性較好。疏水性氨基酸Ala、Cys、Ile、Leu、Met、Phe和Val分別占編碼的1.80%、2.50%、4.50%、3.80%、1.90%、2.80%和4.20%。跨膜區(qū)分析結(jié)果顯示(圖2)，DUF1943蛋白無(wú)典型的跨膜區(qū)，DUF1943蛋白的302個(gè)氨基酸均位于細(xì)胞膜表面，降低了跨膜區(qū)疏水性氨基酸對(duì)蛋白折疊的影響，易于表達(dá)和純化。

2.1.3 DUF1943蛋白的抗原性分析 采用Protean模塊中的的Jameson-Wolf方法結(jié)合預(yù)測(cè)DUF1943蛋白的抗原指數(shù)，發(fā)現(xiàn)DUF1943蛋白序列具有豐富且分布均勻的抗原表位位點(diǎn)，其中抗原指數(shù)較高的區(qū)段為：1～9、70～88、90～115、122～135、171～182、188～217、223～229、238～245、262～280和288～299(圖3)，并且這些區(qū)段具有強(qiáng)的表面可及性和親水性位點(diǎn)，因此利用該蛋白制備抗體具有較強(qiáng)的可行性。

圖3 DUF1943蛋白的抗原性分析

Figure 3 Antigenicity analysis of DUF1943 protein

M: 10 kb DNA Marker; S: DUF1943基因的PCR產(chǎn)物。

Figure 4 PCR amplification ofgene

M: 10 kb DNA Marker; 1: pET-28a-雙酶切產(chǎn)物。

圖5重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

Figure 5 Double enzyme digestion identification of pET- 28a-

2.2 pET28a-DUF1943重組表達(dá)載體的鑒定

全基因合成所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示在1 000 bp附近出現(xiàn)了特異性的目的條帶，符合基因序列的預(yù)期大小(圖4)。將合成的基因，連接到載體Pet28a(+)上，得到的重組質(zhì)粒，經(jīng)H I和l雙酶切后，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示如(圖5)所示，酶切產(chǎn)物為兩條大小約為5 300 bp和1 000 bp的片段，其條帶大小與Pet28a(+)和基因的實(shí)際大小一致，初步斷定目的基因已成功接入載體，Pet28a(+)-重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M：Protein Marker；1：誘導(dǎo)前總蛋白；2：20 ℃上清；3：20 ℃沉淀；4：37 ℃上清；5：37 ℃沉淀。

Figure 6 Expression of the DUF1943 protein in

M: Protein Marker;1:上樣；2：流出；3和4：20 mmol·L-1 Imidazole 洗脫組分；5和6：50 mmol·L-1 Imidazole 洗脫組分；7：500 mmol·L-1 Imidazole 洗脫組分。

Figure 7 SDS-PAGE analysis of the purified products by fusion protein nickel agarose affinity chromatography

對(duì)篩選出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行增菌培育，菌液經(jīng)測(cè)序分析，結(jié)果與NCBI上公布的紅螯螯蝦的Vitellogenin:AAG17936.1的相似性(identity)為100%，說(shuō)明本次全基因合成并克隆轉(zhuǎn)化所得的序列就是紅螯螯蝦Vg上的序列片段?？梢源_認(rèn)Pet28a(+)-重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 DUF1943蛋白的表達(dá)鑒定

將重組質(zhì)粒Pet28a(+)-轉(zhuǎn)化大腸桿菌B21感受態(tài)細(xì)胞后,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果(圖6)顯示，泳道5與其他泳道相比，出現(xiàn)了一條大小約35 kDa的特異性蛋白條帶，大小與目的蛋白(37.4 kDa)預(yù)期一致。說(shuō)明重組蛋白Pet28a(+)-在菌體內(nèi)主要以包涵體的形式表達(dá)，且誘導(dǎo)其表達(dá)的最佳條件為：37 ℃培養(yǎng)4 h。

2.4 DUF1943蛋白的分離及純化

將超聲破菌、重懸后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果(圖7)顯示，各泳道在35 kDa附近都出現(xiàn)了一條明顯的特異性條帶，其大小與目的蛋白(37.4 kDa)一致。泳道3、4、5、6和7是采用不同濃度的洗脫液進(jìn)一步純化后的產(chǎn)物，與泳道1、2所示的未經(jīng)洗脫的粗蛋白條帶相比，條帶更清晰，雜帶更少。其中又以第5泳道的條帶最清晰，純度最高，說(shuō)明50 mmol·L-1Imidazole為最佳的洗脫條件。

M: Protein Marker (Cat..No.C600525); 1: Pet28a(+)-純化產(chǎn)物。

圖8 純化產(chǎn)物SDS-PAGE分析

Figure 8 SDS-PAGE analysis of the purified products

M：Protein Marker;1:融合目的蛋白。

Figure 9 Analysis of expressed recombinant DUF1943 by Western Blot

表1 Pet28a(+)-DUF1943蛋白濃度測(cè)定

注：待測(cè)樣品體積為10 μL。

2.5 DUF1943蛋白的驗(yàn)證

收集最佳條件下大量表達(dá)的重組蛋白Pet28a(+)-，采用50 mmol·L-1的Imidazole洗脫液層析，得到的最終純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果(圖8)顯示，在35 kDa附近出現(xiàn)一條清晰的目的條帶，大小與預(yù)期結(jié)果一致。可確定純化得到的即為目的蛋白。

為進(jìn)一步驗(yàn)證最終純化所得目的蛋白的特異性，對(duì)其進(jìn)行Western Blot試驗(yàn)，并采用TMB進(jìn)行顯色，同樣在35 kDa附近的相應(yīng)位置出現(xiàn)了明顯的特異性條帶，再次表明該蛋白為目的蛋白（圖9）。

圖10 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線

Figure 10 The standard curve of BSA

2.6 DUF1943蛋白濃度鑒定

采用非干擾型蛋白定量試劑盒測(cè)定最終純化蛋白的濃度，結(jié)果如表1和圖10所示。將表1所測(cè)定的融合蛋白OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的回歸方程，計(jì)算出融合蛋白Pet28a(+)-的濃度為0.60 mg·mL-1。

3 討論與結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)卵黃蛋白原的DUF1943、DUF1944和VWD結(jié)構(gòu)域都能夠與革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌結(jié)合，并能與其表面的病原相關(guān)分子模式LTA和LPS相結(jié)合[20]。Sun等研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚的Vg2具有明顯的抑菌作用，但是其DUF1943、DUF1944 和VWD結(jié)構(gòu)域卻不能夠直接抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，而是作為模式識(shí)別受體與病原的相關(guān)分子模式相結(jié)合[21]。吳彪的研究發(fā)現(xiàn)蝦夷扇貝的DUF1943能結(jié)合大腸桿菌和金黃色葡萄球菌及其表面的LTA和LPS，但是不能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，同樣證明DUF1943作為模式識(shí)別受體發(fā)揮免疫學(xué)功能[22]。本研究先對(duì)紅螯螯蝦的進(jìn)行了生信分析，重點(diǎn)評(píng)估了其編碼肽段的抗原性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列區(qū)段具有較強(qiáng)的表面可及性以及較多的親水性位點(diǎn)，表明DUF1943結(jié)構(gòu)域可以作為一種高效的免疫原。而紅螯螯蝦DUF1943是否具有相應(yīng)的免疫學(xué)作用，還需進(jìn)一步的探研。制備DUF1943肽段正是為后續(xù)開展其相關(guān)功能及機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

用原核表達(dá)系統(tǒng)制備DUF1943結(jié)構(gòu)域肽段的第一步，也是最關(guān)鍵的一步是目的基因的合成。重疊區(qū)擴(kuò)增法（PCR-based accurate synthesis, PAS）僅需要2個(gè)步驟就能精準(zhǔn)合成出在大腸桿菌宿主體內(nèi)高效表達(dá)的目的基因，其錯(cuò)配率≤1/1 000 bp，適用于GC含量高，重復(fù)序列和二結(jié)構(gòu)復(fù)雜的基因序列合成[23]。該方法首先通過(guò)對(duì)目的基因序列的理論評(píng)估，再根據(jù)大腸桿菌密碼子的兼并性和偏好性，對(duì)序列中的大腸桿菌使用頻率低的密碼子和稀有密碼子進(jìn)行改造，使基因編碼序列更符合大腸桿菌的密碼子偏好。優(yōu)化G+C的含量，添加或刪除限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，改變RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出優(yōu)化的目的基因序列，對(duì)序列進(jìn)行拆分，最終利用重疊區(qū)PCR擴(kuò)增得到目的基因。高見等根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子，利用Synthetic Gene Designer軟件對(duì)L2E7全基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,誘導(dǎo)其在大腸桿菌pET9a體內(nèi)高效表達(dá)，目的蛋白占全菌的60%左右[24]。夏曉玲等根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好，利用GenScript rare codon analysis軟件對(duì)十二指腸基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，通過(guò)全基因合成方法合成的目的基因在大腸桿菌體內(nèi)獲得了較高的表達(dá)，且以可溶形式存在[25]。本研究先對(duì)紅螯螯蝦序列進(jìn)行理論評(píng)估，根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好，對(duì)紅螯螯蝦野生型序列進(jìn)行的改造和優(yōu)化，探索了誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)DUF1943多肽的最優(yōu)條件，最終獲得了高效的DUF1943多肽以包涵體形式存在。包涵體經(jīng)2 mol·L-1的鹽酸胍溶解，Ni-NTA層析柱純化及復(fù)性，最后透析去除變性劑，促進(jìn)多肽折疊，恢復(fù)其活性。這是首次采用全基因合成方法對(duì)紅螯螯蝦Vg的DUF1943結(jié)構(gòu)域進(jìn)行高效的異源表達(dá)。

本研究利用全基因合成的方法合成了DUF1943結(jié)構(gòu)域的片段序列，成功構(gòu)建了Pet28a（+）-融合表達(dá)載體，探明了誘導(dǎo)大腸桿菌高效表達(dá)DUF1943多肽的最佳條件為：當(dāng)單克隆菌液OD600達(dá)0.6時(shí)，添加0.6 mmol·L-1的誘導(dǎo)劑IPTG，置于37 ℃條件下培養(yǎng)4 h，蛋白的表達(dá)量最高。表達(dá)獲得的DUF1943多肽以包涵體形式為主，經(jīng)純化和復(fù)性最終得到高純度活性DUF1943多肽，為后續(xù)開展其具體生物學(xué)功能及實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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Prokaryotic expression and purification of the domain of unknown function of vitellogenin (DUF1943) in

WANG Rui1, WEI Zina1, LYU Min1, YANG Yanhao1, HUANG Liming1,WEI Xiuying2, LU Tianhe1, HUANG Guanghua1, YANG Huizan1

(1. Guangxi Academy of Fishery Sciences, Nanning 530021; 2. College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005)

The aim of this study was to obtain the domain of unknown function of vitellogenin () fromby exogenous expression and then purification, so as to provide the material basis for further research on its related function and mechanism. According to thegene sequence (Accession No. AF306784.1) ofpublished in GenBank database, thegene ofwas found. The protein sequence of DUF1943 domain (617 - 918aa) was analyzed. The physico-chemical properties and basic structure of DUF1943 were evaluated theoretically. The codon ofwas modified and optimized according to the evaluation results, combined with the codon preference of. The optimized gene fragment ofdomain was obtained by whole gene synthesis method, and then it was connected into Pet28a (+) to construct the fusion expression vector of Pet28a(+)-. The optimal expression parameters of the fusion vector insystem were explored. The protein inclusion bodies were renatured by dissolution and upper column chromatography. The results of electrophoresis and sequencing analysis showed that the optimized target gene ofwas 921 bp, and the fusion expression vector ofwas constructed successfully. The optimal induction conditions for the high expression of the fusion vector inBL21 were as follows: when the OD600of monoclone reached 0.6, 0.5 mmol·L-1IPTG was added and cultured at 37 ℃ for 4 h; the expression of DUF1943 protein was mainly in the form of inclusion bodies, which showed a specific band near 35 kDa on SDS-PAGE. The inclusion bodies were broken and collected. After dissolution with 2 mol·L-1guanidine hydrochloride and Ni-NTA chromatography, the final concentration of active protein was 0.6 mg·mL-1. The prokaryotic expression vector Pet28a(+)-was successfully constructed, the expression system and renaturation scheme were optimized, and the target protein of DUF1943 was obtained, which would lay a foundation for the further study of the biological function and application of DUF1943 domain of Vg.

;; prokaryotic expression; purification; renaturation

S966.12; Q78

A

1672-352X (2021)06-0940-07

10.13610/j.cnki.1672-352x.20220106.021

2022-1-7 7:30:57

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20220106.1254.042.html

2021-02-01

廣西科技重大專項(xiàng)課題(桂科AA17204095-5)，廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2019GXNSFAA185036)，廣西重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(桂科AB18221068)和廣西科技重大專項(xiàng)(桂科AA17204094-7)共同資助。

王 瑞，博士，副研究員。E-mail：raywongxx@163.com

通信作者:楊慧贊，博士，高級(jí)工程師。E-mail：yhzyang@163.com