番茄USP1響應干旱和高溫脅迫的研究

宗 寧，趙煥蘭，劉 奎，盧若兮，范葉珍，苗 敏

番茄1響應干旱和高溫脅迫的研究

宗 寧，趙煥蘭，劉 奎，盧若兮，范葉珍，苗 敏*

(合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，合肥 230601)

DDB1作為CUL4泛素連接酶的核心組件參與細胞內(nèi)許多重要的生命活動。前期研究發(fā)現(xiàn)番茄CUL4-DDB1復合物（CRL4）調(diào)節(jié)植物細胞的非生物脅迫應答。為進一步闡明DDB1在植物抗逆中的調(diào)控機制和生理功能，通過酵母雙雜交篩選，發(fā)現(xiàn)普遍應激蛋白USP1與DDB1存在相互作用，USPs家族蛋白參與提高生物體對逆境脅迫的耐受；進一步研究發(fā)現(xiàn)USP1定位于細胞質(zhì)中，且其基因表達受到多種脅迫條件誘導。此外泛素化實驗揭示USP1可以被泛素化修飾降解，上調(diào)1表達導致植株對干旱和高溫抗性的增強，表明1可能正調(diào)控番茄植株對逆境下脅迫的應答，且它的作用受CUL4-DDB1泛素連接酶的靶向降解調(diào)控。結(jié)果不僅揭示新的植物抗逆機理，而且為植物抗逆分子育種提供新的基因資源和技術途徑。

番茄；1；CUL4-DDB1；泛素化修飾；環(huán)境脅迫

植物在生長發(fā)育的過程中往往會受到外界環(huán)境脅迫的影響，例如紫外線輻射、干旱、鹽堿、重金屬、高溫或者低溫以及病蟲害等。這些逆境脅迫會嚴重阻礙植物的正常生長，甚至導致植物死亡[1-2]。面對環(huán)境脅迫，植物逐漸進化出了許多策略來克服這些外界壓力，這種進化來自于植物在習性、形態(tài)或者生理上的變化，從而以最大化其生存和繁殖機會的方式優(yōu)化其生長和發(fā)育[3-4]。

普遍應激蛋白(universal stress protein, USP)最早在1990年發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌中，此后陸續(xù)在包括細菌、古細菌、植物和多細胞動物在內(nèi)的多種生物中都發(fā)現(xiàn)了該蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白在細胞防御信號和抗應激代謝途徑中有很重要的作用[5-7]。植物中存在著大量的USPs蛋白，目前，從不同來源的植物中一共鑒定到了2 141種不同形式的USPs[8]。所有的蛋白質(zhì)都包含至少一個USP結(jié)構域和其他的催化基序，它們在特定的組織、器官和發(fā)育階段或在不同的應激條件下的表達存在差異[9-10]。USPs在保護植物免受脅迫方面具有不同的功能。擬南芥中的USP蛋白HRU1能夠調(diào)節(jié)缺氧條件下細胞內(nèi)過氧化氫(H2O2)的水平[11]。擬南芥中的另一種USP，，在植物受到熱刺激或者氧化應激時，其存在形式會產(chǎn)生變化，從而影響到酶的活性，提高植物對熱或者氧化應激的抗性[12]。同時，Melencion等發(fā)現(xiàn)在低溫下的mRNA水平顯著提高[13]，說明在保護植物免受低溫的傷害方面也發(fā)揮著生理功能。煙草中的異位表達通過去除細胞內(nèi)活性氧來增強對滲透脅迫的抗性，顯著增強煙草的耐鹽性[14]。除了非生物脅迫，USPs在植物遭受生物脅迫時也能發(fā)揮作用[15-16]。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system, UPS）介導了真核生物80% ～ 85%的蛋白質(zhì)降解[17]，是重要的負調(diào)節(jié)蛋白水平的機制。底物的泛素化是由3種酶的連續(xù)活性完成的，分別是泛素化酶(ubiquitin-activating enzyme, E1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme, E2)和泛素連接酶(ubiquitin ligase, E3)[18]。被泛素化修飾的蛋白大部分通過蛋白酶體系統(tǒng)降解，也有部分修飾后的蛋白會改變細胞定位和活性。有研究發(fā)現(xiàn)，受損DNA結(jié)合蛋白1(DDB1)是CULLIN4(CUL4)-RING E3連接酶復合物的核心組分[19]， CUL4與DDB1和另一種DDB1的相互作用蛋白DDB1-CUL4相關因子( DDB1-CUL4 associated factor, DCAF)組裝，形成基于DDB1-CUL4的泛素連接酶(CRL4)家族[1]。作為CRL4泛素連接酶復合體的重要組成部分，DDB1由3個WD40 β-propeller結(jié)構域 (BPA、BPB和BPC)和一個C-末端螺旋結(jié)構域組成[20]，BPB介導與CUL4的相互作用，而BPA和BPC可以與CRL4泛素連接酶的底物受體DCAF結(jié)合[21]。DCAF與靶向底物結(jié)合，番茄中有100多個DCA F接合蛋白，識別不同底物蛋白而參與各種生命活動[22]。DDB1作為CRL4泛素連接酶的核心組分參與調(diào)控番茄中的多種生理活動，包括葉綠體發(fā)育和次生代謝的調(diào)節(jié)、細胞增殖的表觀遺傳調(diào)控以及生物與非生物的應激反應[18, 23-25]。

前期的研究發(fā)現(xiàn)DDB1與幾個DCAF參與高鹽、紫外和干旱的脅迫應答[1, 25]，但參與這一進程的靶向底物未知。為了進一步探究DDB1在非生物脅迫應答中調(diào)控機制以及哪些蛋白底物參與其中，本課題進行了以番茄DDB1為誘餌蛋白的酵母雙雜交篩選，得到了一個USPs蛋白，稱為USP1(universal stress protein 1)。本研究中，我們驗證了DDB1與USP1的相互作用，并且證明了USP1可以作為CRL4泛素連接酶復合體的底物被泛素化降解。同時發(fā)現(xiàn)過表達USP1的番茄植株能夠顯著增強對于干旱以及高溫脅迫的抗性，證明了USP1可以參與到番茄植株對于上述非生物脅迫的耐受性的調(diào)控之中，且極有可能通過DDB1介導的USP1泛素化降解參與調(diào)控脅迫應答。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的野生型(wild-type, WT)番茄(Mill. cv. Ailsa Craig) 來自美國康奈爾大學THOMPSON植物研究所，煙草 ()來自美國愛德華大學Fangming Xiao 副教授，均由本實驗室繁育保存。大腸桿菌() DH5α，根瘤農(nóng)桿菌() GV2260，EHA105，LBA4404購自上海唯地生物有限責任公司，酵母菌EGY48()由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 USP1的亞細胞定位 根據(jù)1基因的CDS序列(Solyc04g014600.2.1)設計特異性引物USP1FI和USP1RI(引物信息見表1)以擴增去除了終止密碼子的目的片段，將PCR產(chǎn)物連接到PART27-MCS-GFP載體(I和l酶切)上，將構建好的重組質(zhì)粒PART27-USP1-GFP轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，將成功轉(zhuǎn)化的菌株測序驗證，提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV2260中，并通過注射法侵染生長1個月大小的本氏煙草葉片。黑暗放置36 h后用激光共聚焦顯微鏡觀察煙草葉片細胞中綠色熒光蛋白的分布情況。

1.2.2 CO-IP實驗 在生長4周齡的煙草葉片中利用煙草瞬時表達得到總蛋白，再用蛋白提取緩沖液提取。蛋白提取緩沖液含有50 mmol·L-1Tris-HCl(pH7.5)、150 mmol·L-1NaCl、5 mmol·L-1乙二胺四乙酸(EDTA)、2 mmol·L-1二硫蘇糖醇(DTT)、10%甘油(Glycerol)、1%聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、0.1 mol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)和100×植物蛋白酶抑制劑。蛋白提取液與15 μL Anti-HA磁珠于4 ℃孵育2 h，將磁珠清洗3次后加入5×蛋白loading buffer，95 ℃煮樣5 min，再進行蛋白免疫印跡。

1.2.3 RNA提取和定量PCR分析 Trizol法提取番茄1轉(zhuǎn)基因植株以及野生型植株幼嫩葉片的RNA，提取后的RNA用HiScriptⅢ反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行定量PCR的分析。定量引物為USP1qPCRF和USP1qPCRR(引物信息見表1)，同時以番茄3作為內(nèi)參基因。

1.2.4 酵母雙雜交實驗 根據(jù)1基因的CDS序列(Solyc04g014600.2.1)設計特異性引物USP1FR I和USP1Rl，以野生型番茄cDNA為模板擴增得到包含終止密碼子的基因片段，將基因片段連接到PJG4-5載體上獲得重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒測序驗證正確后與誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到EGY48酵母感受態(tài)中，于營養(yǎng)缺陷型三缺培養(yǎng)基(-Ura，-His，-Trp)進行篩選培養(yǎng)。將克隆轉(zhuǎn)至顯色培養(yǎng)基(-Ura，-His，-Trp，X-gal)中驗證相互作用。

表1 本研究所用引物信息

1.2.51過表達載體的構建和轉(zhuǎn)基因植株的獲得 根據(jù)番茄1基因(Solyc04g014600.2.1)的序列設計引物USP1F、USP1R、USP1FI和USP1RI，用巢式PCR擴增得到目的基因片段，使用限制性內(nèi)切酶I和I以及T4 DNA連接酶將基因連接到帶有35S啟動子的PBI121載體上，載體帶有II篩選標記。

將構建好的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，再利用農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化得到PBI121:35S-USP1轉(zhuǎn)基因愈傷組織。愈傷組織在含有卡那霉素的MS篩選培養(yǎng)基上分化生長，待長成苗型后移入營養(yǎng)土中栽培。提取轉(zhuǎn)基因植株的葉片DNA，采用PCR擴增標記基因II(引物信息見表1)和定量PCR進行轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。

1.2.61過表達植株的脅迫處理 選取長勢相同的4周齡的1過表達植株進行脅迫處理，對照組與處理組均保持14 h光照，10 h黑暗。高溫脅迫處理將番茄植株放置于40 ℃人工氣候箱，正常澆水。干旱脅迫處理則將番茄植株置于25 ℃的溫室內(nèi)，并停止?jié)菜φ战M的番茄均生長于25 ℃的溫室內(nèi)，正常澆水。

種子萌發(fā)實驗選取剛露白的種子置于相應的1/2 MS培養(yǎng)基上，在25 ℃的溫室內(nèi)，14 h光照，10 h黑暗條件下生長。

2 結(jié)果與分析

2.1 USP1的基因表達模式分析及亞細胞定位

為了探究1基因的表達模式，根據(jù)1基因的Locus ID(Solyc04g014600.2.1)，在番茄基因表達數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站TomExpress(http://tomexpress. toulouse.inra.fr/)查詢了1基因在番茄不同組織器官及不同生長時期的表達量，發(fā)現(xiàn)1基因在番茄的種子、分生組織、花以及果實中均有表達，其中在種子和果實的表達量較高(圖1)。

通過構建含有GFP標記的USP1融合蛋白載體，對USP1的亞細胞定位進行了探究，同時設置了GFP空載作為對照。USP1-GFP融合蛋白以及GFP蛋白均通過農(nóng)桿菌介導的侵染在煙草葉片中瞬時表達，侵染的煙草葉片在黑暗中放置36 h后于激光共聚焦顯微鏡下觀察。通過觀察可以發(fā)現(xiàn)，USP1蛋白主要在細胞質(zhì)中表達(圖2)。

圖1 番茄USP1基因的表達模式

Figure 1 Expression pattern of1 gene in tomato

2.2 USP1在不同脅迫誘導下的表達量分析

為了探明1基因的表達是否受脅迫條件的影響，我們選用5周齡的野生型番茄(AC+)進行了脅迫誘導實驗。高溫脅迫處理組的番茄植株放置于40 ℃人工氣候箱中，正常澆水，分別于0、2、6和10 h后取樣用于定量分析。NaCl處理組置于25 ℃溫室中，用300 mmol·L-1的NaCl進行澆灌，在處理后0、12、24和48 h取樣分析。模擬干旱處理組置于25 ℃溫室中，用400 mmol·L-1的Mannitol進行澆灌，在處理后0、12、24和48 h取樣分析。所有處理組光照周期均保持14 h光照，10 h黑暗。脅迫處理定量PCR結(jié)果表明，番茄植株在高溫、鹽和模擬干旱脅迫處理后，1基因的表達量均產(chǎn)生了明顯的變化(圖3)，這種變化說明1基因確實參與到了番茄在應對高溫、鹽以及干旱脅迫的調(diào)控之中，為后續(xù)的實驗探明了方向。

GFP, 綠色熒光蛋白；DAPI, 細胞核染料；Bright, 明視野；Merge, 疊加場。

Figure 2 Subcellular localization of USP1

2.3 USP1與DDB1存在相互作用

USP1蛋白與DDB1蛋白之間的相互作用通過酵母雙雜交系統(tǒng)得到了驗證。將PEG202:DDB1與PJG4-5:USP1共同轉(zhuǎn)化到EGY48酵母感受態(tài)中，同時設置PEG202空載和PJG4-5:USP1的組合為負對照?？梢悦黠@觀察到，在三缺顯色培養(yǎng)基Gal/Raff (-Ura, -His, -Trp, X-gal)上，含有PEG202:DDB-1和PJG4-5:USP1質(zhì)粒的EGY48酵母可以顯現(xiàn)出藍色(圖4A)，而負對照沒有任何變色的跡象(圖4C)，同時正對照在三缺顯色平板上可以正常顯色(圖4B)。說明USP1與DDB1在酵母中存在相互作用，但可能因為酵母是異源系統(tǒng)，所以USP1與DDB1的相互作用在酵母中表現(xiàn)得較弱。

（a）熱脅迫；（b）NaCl脅迫；（c）甘露醇脅迫。

Figure 3 Expression of1 under different stress

為了進一步驗證USP1與DDB1的相互作用，我們進行了免疫共沉淀實驗。在免疫共沉淀實驗中，DDB1-HA和USP1-Flag在煙草葉片中共表達，同時以DDB1-HA和GFP-Flag共表達作為對照組。這幾種蛋白在總蛋白(Input)中都可以檢測得到，說明所有的蛋白在煙草瞬時表達系統(tǒng)中均正常表達。而在免疫沉淀部分(IP)，則只能檢測到USP1蛋白的存在，GFP蛋白未被檢測到(圖5)。這表明USP1-Flag蛋白連同Anti-HA 免疫磁珠和DDB1-HA蛋白一同被沉淀了下來，說明USP1蛋白與DDB1蛋白在植物細胞體內(nèi)存在著相互作用，且相互結(jié)合能力較強。

圖4 USP1與DDB1在酵母中有相互作用

Figure 4 USP1 interacts with DDB1 in yeast

圖5 USP1與DDB1的免疫共沉淀分析

Figure 5 Immuno-precipitation analysis of USP1 and DDB1

由酵母雙雜交實驗和免疫共沉淀實驗可以得出USP1與DDB1之間確實存在著相互作用，這也為后面我們探究USP1的泛素化和功能性質(zhì)奠定了基礎。

2.4 USP1可以被泛素化

我們已經(jīng)驗證了USP1與DDB1之間存在著相互作用，而DDB1與CUL4可以形成CRL4泛素連接酶復合體[1]，所以猜測USP1可以作為底物被CRL4泛素化修飾。為了探究USP1是否可以被泛素化修飾，將Ub-HA與USP1-Flag在煙草葉片中共同表達，同時設置Ub-HA與GFP-Flag作為對照組。由免疫共沉淀實驗結(jié)果可知，Ub-HA與USP1-Flag可以被共同沉淀下來，在IP部分被檢測到，同時USP1-Flag在IP部分的條帶呈現(xiàn)出多泛素化修飾的典型彌散的狀態(tài)，而作為對照組的其他兩組合沒有在IP部分中檢測到條帶(圖6)。這說明了USP1可以與泛素分子結(jié)合受到多泛素化修飾。多泛素化修飾的蛋白經(jīng)由26S蛋白酶體降解。

圖6 USP1的泛素化實驗

Figure 6 Ubiquitination of USP1

圖7 USP1-OE植株RNA水平鑒定

Figure 7 RNA level identification of1-OE plants

2.5 過表達USP1可以提高番茄植株對于脅迫的耐受性

1在受不同脅迫環(huán)境中的誘導表達，干旱、高溫、高鹽脅迫條件下，基因表達量均有顯著的提高。為了進一步驗證1基因在對于番茄逆境脅迫中的生物學功能，利用根癌農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化獲得了1的過表達植株(1-OE)，經(jīng)過定量PCR鑒定，結(jié)果顯示5個1-OE株系中1基因的表達上調(diào)，均為陽性株系(圖7)。選取其中的3個株系用于脅迫實驗，同時以野生型番茄(AC+)作為對照，脅迫實驗選取4周齡健康植株。在高溫脅迫處理5 d，干旱脅迫處理3周后，AC+與1-OE的生長狀況出現(xiàn)了明顯的差異，可以看到，相較于野生型番茄(AC+) (圖8A, C) ,1-OE(圖8B, D)的生長狀態(tài)良好，這說明1的過表達可以顯著提高番茄植株對于干旱以及高溫脅迫的耐受性。此外，還選取了OE-2株系在1/2 MS培養(yǎng)基上進行了番茄種子萌發(fā)實驗，在添加450 mmol·L-1的1/2 MS培養(yǎng)基上生長6 d后，OE-2株系的生長狀況明顯好于野生型，表現(xiàn)為OE-2株系根系的長度要明顯比AC+長，同時，在不添加脅迫條件的1/2 MS培養(yǎng)基上，1過表達株系和野生型的生長狀況無明顯差異(圖9)，說明過表達1也可以增強番茄幼苗耐受干旱脅迫的能力。

A、C分別表示高溫和干旱脅迫的野生OE-2植株；B、D分別表示高溫和干旱脅迫的USP1-OE植株。

Figure 8 Overexpression of1 significantly enhanced tomato tolerance to high temperature and drought

圖9 USP1過表達對番茄幼苗生長發(fā)育的影響

Figure 9 Effects of1 overexpression on the growth and development of tomato seedlings

3 討論與結(jié)論

在本研究中，我們分析了1的表達模式，發(fā)現(xiàn)1在番茄植株中表達廣泛，通過亞細胞定位揭示了1主要在細胞質(zhì)中表達。并且發(fā)現(xiàn)，1在環(huán)境脅迫的條件下，其表達量會發(fā)生變化，這種變化在干旱和高溫脅迫中表現(xiàn)的尤為明顯。這說明1在番茄遭受這幾種環(huán)境脅迫時會發(fā)揮作用。為了探究1在番茄體內(nèi)作用的機制，根據(jù)之前的研究發(fā)現(xiàn)，我們驗證了USP1與DDB1之間的相互作用，而DDB1作為CRL4泛素連接酶復合體的關鍵組成部分[1]，這種相互作用說明USP1可以作為底物被CRL4泛素化降解。泛素化實驗印證了這一觀點，USP1可以與泛素分子結(jié)合并且被泛素化修飾，但連接DDB1與USP1的接合蛋白DCAF在本研究中尚未探究。

根據(jù)之前的研究，USPs家族基因在包括擬南芥、煙草、水稻等多種植物中，都具有提高植物對于逆境脅迫耐受性的功能[8]。為了進一步說明1對于番茄植株在面對環(huán)境脅迫的具體作用，我們構建了1的過表達植株(USP1-OE)，選取了干旱和高溫脅迫對1-OE植株進行處理，實驗結(jié)果印證了我們的假設，1-OE植株對于干旱和高溫脅迫的耐受性要明顯強于野生型（對照組）。同時，我們還發(fā)現(xiàn)1-OE植株在形態(tài)上與野生型番茄植株有明顯的不同，過表達植株的葉片更寬，葉子的裂片更小，顏色更綠。這些形態(tài)上的差別極有可能是轉(zhuǎn)基因植株抗逆性強的原因之一。

總而言之，1能夠響應番茄植株遭受的各種環(huán)境脅迫，并且能夠顯著提高番茄植株對于干旱和高溫脅迫的耐受性，但對于高鹽脅迫的耐受性并未改變，500 mmol·L-1NaCl處理后，野生型與轉(zhuǎn)基因植株生長狀態(tài)相似。番茄植株在脅迫環(huán)境下，1的表達量會顯著升高(圖3)，來響應外界脅迫，提升對于脅迫的耐受性，此時USP1蛋白的數(shù)量維持在一個較高的水平，而DDB1會進入細胞核中，啟動其他抗逆基因的表達。當外界脅迫消失時，DDB1會進入細胞質(zhì)中，此時USP1可以通過CUL4-DDB1組成的CRL4泛素連接酶復合體進行泛素化降解，通過泛素化的途徑來維持USP1蛋白的數(shù)量在一個合適的水平，以保證植株的正常生長。下一步的研究方向是構建USP1的敲除轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)合1-OE植株，探究在逆境脅迫中，1對于下游的相關基因的表達和ROS、H2O2、植物激素等與抗逆相關的物質(zhì)含量的影響，以及1轉(zhuǎn)基因植株形態(tài)的差別對于其抗逆性的關系，構建一條完整的1對于番茄植株抗逆作用機制的通路。

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Study on tomato1in response to drought and high temperature stress

ZONG Ning,ZHAO Huanlan,LIU Kui, LU Ruoxi,FAN Yezhen,MIAO Min

(School of Food and Biological Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230601)

As the core component of CUL4 ubiquitin ligase, DDB1 participates in many important biological processes. Our previous study found that tomato CUL4-DDB1 complex regulates abiotic stress response. In order to further clarify the regulatory mechanism and physiological function of DDB1 in plant stress resistance, we found that USP1 interacted with DDB1 through yeast two hybrid screening, and USPs family proteins were involved in improving the tolerance of organisms to stress. Further studies found that USP1 was located in the cytoplasm, and its gene expression was induced by a variety of stress conditions. In addition, ubiquitination experiments revealed that USP1 could be degraded by ubiquitination modification, and upregulation of1 expression led to the enhancement of plant resistance to drought and high temperature, indicating that1 may regulate tomato plant response to stress, and its role is regulated by the targeted degradation of CUL4-DDB1 ubiquitin ligase. The result not only reveal new mechanisms of plant stress resistance, but also provide new gene resources and technical approaches for plant stress resistance molecular breeding.

tomato;1; CUL4-DDB1; ubiquitination; environmental stress

S641.2; Q945.78

A

1672-352X (2021)06-0916-07

10.13610/j.cnki.1672-352x.20220106.006

2022-1-7 8:15:44

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20220106.1230.012.html

2021-02-24

國家自然科學基金（31970345，31701059）資助。

宗 寧，碩士研究生。E-mail：1412489149@qq.com

通信作者:苗 敏，副教授。E-mail：minmiao@hfut.edu.cn