陸地棉轉(zhuǎn)錄因子GhWRKY91基因的原核表達(dá)及鑒定

顧麗姣，魏恒玲，喻樹迅*

陸地棉轉(zhuǎn)錄因子基因的原核表達(dá)及鑒定

顧麗姣1,2，魏恒玲1，喻樹迅1*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安陽 455000；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，保定 071000)

為了篩選出高表達(dá)棉花GhWRKY91可溶性蛋白的原核表達(dá)載體。以中棉所10號(hào)葉片的cDNA為模板PCR擴(kuò)增基因，擴(kuò)增產(chǎn)物分別構(gòu)建到4個(gè)不同的原核表達(dá)載體pET-22b(+)、pET-32a(+)、pMAL-c5x和pGEX-4T-1。將重組載體pET-22b(+)-、pET-32a(+)-、pMAL-c5x-和pGEX-4T-1-轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21(DE3)或Arctic-Express?(DE3)RP中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析不同原核表達(dá)載體的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，pET-22b(+)-和pET-32a(+)-在BL21(DE3)中以及pMAL-c5x-在Arctic-Express?(DE3)RP中均未見明顯蛋白表達(dá)，而pGEX-4T-1-在Arctic-Express?(DE3)RP中表達(dá)的蛋白基本存在于上清中，可獲得可溶性蛋白。因此，將基因構(gòu)建到pGEX-4T-1原核表達(dá)載體上可成功獲得可溶性蛋白。

棉花；基因；SDS-PAGE；原核表達(dá)；表達(dá)分析

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族之一[1]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子的典型特征是包含1～2個(gè)由60個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的WRKY結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域的N末端含有保守的WRKYGQK序列，C末端含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域（Cx4–5Cx22–23HxH 或 Cx7Cx23HxC）。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和鋅指結(jié)構(gòu)的特征，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族可以分為3個(gè)亞家族[1-2]。1994年Ishiguro等[3]從甘薯中克隆了第一個(gè)WRKY基因。隨著測序成本的降低，越來越多物種的基因組數(shù)據(jù)被釋放出來，這為鑒定更多的WRKY轉(zhuǎn)錄因子提供了基礎(chǔ)。例如，目前分別在擬南芥中鑒定了74個(gè)[2]、水稻101個(gè)[4]、油菜145個(gè)[5]、陸地棉239個(gè)[6]和雷蒙德式棉120個(gè)[7]WRKY轉(zhuǎn)錄因子，并初步鑒定了它們在進(jìn)化、植物發(fā)育和非生物脅迫中的功能。WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有豐富的生物學(xué)功能，如擬南芥參與雄性不育[8]，棉花參與鹽和干旱脅迫[9]，黃瓜參與病菌抵抗[10]，日本黃連參與次生代謝物苯基異喹啉生物堿的合成[11]，錦雞兒參與調(diào)控葉片衰老[12]等過程。

高華等[13]通過原核表達(dá)蘋果MdWRKY蛋白鑒定了其蛋白大?。粍⒗俚萚14]構(gòu)建了銀杏抗菌肽基因原核表達(dá)載體表達(dá)重組蛋白，鑒定了其抗菌活性；孫威[15]和劉裕峰[16]等分別構(gòu)建了日本蛇根草基因和板栗基因的原核表達(dá)載體，鑒定了其重組蛋白的最佳誘導(dǎo)條件，為制備大量可溶性蛋白并進(jìn)行功能研究奠定了基礎(chǔ)；洪克前等[17]構(gòu)建香蕉原核表達(dá)載體表達(dá)重組蛋白用于免疫新西蘭兔獲得多克隆抗體；程先坤等構(gòu)建了水稻基因的全長和截?cái)嗟脑吮磉_(dá)載體表達(dá)重組蛋白，通過凝膠組織電泳和晶體生長解釋W(xué)-box側(cè)翼序列對WRKY蛋白核酸位點(diǎn)的偏好性的影響[18]。這些研究結(jié)果表明原核蛋白表達(dá)在研究蛋白質(zhì)大小、蛋白純化以及功能分析等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

基因在生物脅迫、非生物脅迫、次生物質(zhì)代謝和生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，對WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行原核表達(dá)有助于進(jìn)一步研究蛋白的功能。棉花是世界上重要的纖維作物，為紡織工業(yè)提供了大量的天然纖維，研究基因在棉花中的功能具有重要的意義。本研究以中棉所10號(hào)為材料克隆基因，構(gòu)建不同的原核表達(dá)載體表達(dá)GhWRKY91重組蛋白來獲得可溶性蛋白，以期進(jìn)一步闡明GhWRKY91蛋白的功能，為棉花育種提供理論基礎(chǔ)和基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

棉花品種中棉所10號(hào)；大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)購自天根生化科技有限公司，Arctic-Express?(DE3)RP感受態(tài)細(xì)胞來自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司；原核表達(dá)載體pET-22b(+)和pET-32a(+)購自北京華越洋生物科技有限公司，pMAL-c5x和pGEX-4T-1來自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1基因的克隆使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根）提取中棉所10號(hào)葉片總RNA，用PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TAKARA）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)Dou等[19]提交到NCBI GeneBank中的(KF669793)序列設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物，分別為：pET-22b(+)-上游引物：5＇GAATTAATTCATG GACAGCGGTGGTAG-3＇，pET-22b(+)-下游引物：5＇-GTGCGGCCGCGCAGATCCC AACCTGTGG-3＇；pET-32a(+)-上游引物：5＇-GGCTGATATCATGGACAGCGGTGG T AG-3＇，pET-32a(+)-下游引物：5＇-GTGCGG CCGCTCAGCAGATCCCAACCT-3＇；pMAL- c5x-上游引物：5＇-GAAGGATTTCAATGGACAGCGGTGGTAG-3＇，pMAL-c5x-下游引物：5＇-CAGG GAATTCTCAGCAG ATCCCAACCT-3＇；pGEX-4T-1-上游引物：5＇-CGCATGGACAGCGGTGGTAG-3＇，pGEX- 4T-1-下游引物：5＇-CCGCTCAGCA GATCCCAACCT-3＇。用高保真酶PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase（TaKaRa）從cDNA中PCR擴(kuò)增基因并進(jìn)行片段純化。PCR的擴(kuò)增條件為：98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)。

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 原核表達(dá)載體pET-22b(+)和pET-32a(+)分別用HⅠ和d Ⅲ進(jìn)行雙酶切，pMAL-c5x用Ⅰ和HⅠ進(jìn)行雙酶切，pGEX-4T-1用HⅠ和Ⅰ進(jìn)行雙酶切，載體酶切后進(jìn)行片段純化。用 ClonExpress? Entry One Step Cloning Kit (C114)試劑盒將1.2.1中純化的目的片段無縫連接到pET-22b(+)、pET-32a(+)和pMAL-c5x載體上，完成pET-22b(+)-、pET-32a(+)-和pMAL-c5x- GhWRKY91載體構(gòu)建。同時(shí)，將用pGEX-4T-1-上游引物和pGEX-4T-1-下游引物PCR擴(kuò)增的片段用HⅠ和Ⅰ雙酶切，用T4連接酶連接到雙酶切后的pGEX-4T-1載體上，完成pGEX-4T-1-載體構(gòu)建[20]。

1.2.3 原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài) 將構(gòu)建好的載體pET-22b(+)-和pET-32a(+)-轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)菌株，pMAL-c5x-和pGEX-4T-1-轉(zhuǎn)化Arctic - Express?(DE3)RP菌株，涂布在含有氨芐抗生素的LB固體平板上，挑取單克隆測序，選取測序正確的單克隆用于原核蛋白表達(dá)。

1.2.4 原核蛋白表達(dá)和檢測 目的菌株接種于30 mL含有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6 ～ 0.8。取出1 mL的培養(yǎng)物12 000 r·min-1室溫離心2 min，棄上清后用100 μL的1×上樣緩沖液重懸菌體。向剩余培養(yǎng)物中加入終濃度為0.5 mmol·L-1的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl- β-D-thiogalactopyranoside, IPTG），20 ℃條件下220 r·min-1震蕩培養(yǎng)4 h（含pMAL-c5x-載體的菌株為37 ℃條件震蕩培養(yǎng)），誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)[20]。取出1 mL的培養(yǎng)物12 000 r·min-1室溫離心2 min，棄上清后用100 μL的1×上樣緩沖液重懸菌體。剩余培養(yǎng)物5 000 r·min-1室溫離心10 min，棄上清，用PBS緩沖液重懸菌體。重懸液超聲波破碎細(xì)胞，分別取上清液與沉淀液加入上樣緩沖液重懸，進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測分析，考馬斯亮藍(lán)染色顯帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET-22b(+)-GhWRKY91融合蛋白在BL21(DE3)中的表達(dá)鑒定

基因的編碼蛋白，預(yù)測的蛋白質(zhì)的分子量為29.82 kDa。pET-22b(+)-融合蛋白在C-端含有His標(biāo)簽，包含標(biāo)簽的蛋白的分子量約為33 kDa。以未加入IPTG誘導(dǎo)劑的重組菌落做對照，在加入IPTG誘導(dǎo)劑20 ℃條件下誘導(dǎo)的重組菌和誘導(dǎo)破碎后的上清中均未檢測到明顯條帶（圖1）。在IPTG誘導(dǎo)破碎后的沉淀中檢測到了條帶，以蛋白包涵體表達(dá)（圖1）。

2.2 pET-32a(+)-GhWRKY91融合蛋白在BL21(DE3)中的表達(dá)鑒定

pET-22b(+)-融合蛋白未見明顯表達(dá)，將構(gòu)建到另一載體含His標(biāo)簽的載體pET-32a(+)上，鑒定融合蛋白表達(dá)情況。在融合蛋白的N-端含有His標(biāo)簽，融合蛋白的分子量約為47 kDa。用IPTG誘導(dǎo)劑20 ℃條件下誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。從SDS-PAGE結(jié)果可以看出，目標(biāo)蛋白在對照，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體，IPTG誘導(dǎo)超聲破碎后的上清和IPTG誘導(dǎo)超聲破碎后的沉淀中均未見明顯表達(dá)（圖2）。

2.3 pMAL-c5x-GhWRKY91融合蛋白在Arctic- Express?(DE3)RP中的表達(dá)鑒定

上述含有His標(biāo)簽的pET-22b(+)和pET-32a(+)均未得到可溶性蛋白，因此將構(gòu)建到了含有麥芽糖結(jié)合標(biāo)簽（MBP-Tag）pMAL-c5x載體上。MBP可以減少目的蛋白的降解，提高目的蛋白的水溶性。融合蛋白的分子量約為74 kDa。結(jié)果顯示，37 ℃條件IPTG誘導(dǎo)后，目標(biāo)蛋白在對照、IPTG誘導(dǎo)的菌體、IPTG誘導(dǎo)超聲破碎后的上清和IPTG誘導(dǎo)超聲破碎后的沉淀中均未見明顯表達(dá)（圖3）。

M,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET- 22b(+)-GhWRKY91；2. IPTG誘導(dǎo)pET-22b(+)- GhWRKY91；3. IPTG誘導(dǎo)pET-22b(+)-GhWRKY91超聲波破碎后的上清；4. IPTG誘導(dǎo)pET-22b(+)-GhWRKY91超聲波破碎后的沉淀。

Figure 1 SDS-PAGE analysis of pET-22b(+)-expression products

M, 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)pET-32a(+)- GhWRKY91；2. IPTG誘導(dǎo)pET-32a(+)-GhWRKY91；3. IPTG誘導(dǎo)pET-32a(+)-GhWRKY91超聲波破碎后的上清；4. IPTG誘導(dǎo)pET-32a(+)-GhWRKY91超聲波破碎后的沉淀。

Figure 2 SDS-PAGE analysis of pET-32a(+)-expression products

2.4 pGEX-4T-1-GhWRKY91融合蛋白在Arctic- Express?(DE3)RP中的表達(dá)鑒定

為了能夠得到可溶性蛋白，我們將構(gòu)建到了含有谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽（GST-Tag）的pGEX-4T-1載體上。GST也可以提高目的蛋白的水溶性。融合蛋白的分子量約為57 kDa。結(jié)果顯示，20 ℃條件IPTG誘導(dǎo)后，融合蛋白在對照，IPTG誘導(dǎo)的菌體和IPTG誘導(dǎo)破碎后的沉淀中有少量表達(dá)，在IPTG誘導(dǎo)破碎后的上清中有相對較多的重組蛋白表達(dá)（圖4），表明用pGEX-4T-1載體表達(dá)可以獲得可溶性蛋白。

M,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pMAL-c5x- GhWRKY91；2. IPTG誘導(dǎo)pMAL-c5x-GhWRKY91；3. IPTG誘導(dǎo)pMAL-c5x-GhWRKY91超聲波破碎后的上清；4. IPTG誘導(dǎo)pMAL-c5x-GhWRKY91超聲波破碎后的沉淀。

Figure 3 SDS-PAGE analysis of pMAL-c5x-expression products

M,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pGEX-4T-1-GhWRKY91；2. IPTG誘導(dǎo)pGEX-4T-1- GhWRKY91；3. IPTG誘導(dǎo)pGEX-4T-1-GhWRKY91超聲波破碎后的上清；4. IPTG誘導(dǎo)pGEX-4T-1-GhWRKY91超聲波破碎后的沉淀。

Figure 4 SDS-PAGE analysis of pGEX-4T-1expression products

3 討論與結(jié)論

前人在研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能過程中，通過構(gòu)建基因的原核表達(dá)載體表達(dá)重組蛋白，利用凝膠阻滯電泳或制備免疫抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀，進(jìn)而鑒定和驗(yàn)證下游調(diào)控靶基因。例如在研究基因調(diào)控葉片衰老機(jī)制過程中，Miao等構(gòu)建pQE30-原核表達(dá)載體表達(dá)重組蛋白，利用凝膠阻滯電泳驗(yàn)證了蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)獲得的下游靶基因[21]。Gu等在研究調(diào)控葉片衰老通路過程中，將基因構(gòu)建到pET-32a(+)原核表達(dá)載體表達(dá)重組蛋白免疫小鼠獲得單克隆抗體，通過染色質(zhì)免疫共沉淀測序技術(shù)獲得了98個(gè)潛在靶基因，通過凝膠阻滯電泳驗(yàn)證到和是GhWRKY27的下游靶基因[22]。本研究的目的是構(gòu)建基因的原核表達(dá)載體并成功表達(dá)可溶性蛋白，為后續(xù)研究的功能奠定基礎(chǔ)。

甘玉迪等將多酚氧化酶基因（）分別構(gòu)建到含His標(biāo)簽的pET-32a(+)和含MBP標(biāo)簽的pMAL-c5x載體上，pET-32a(+)載體表達(dá)的蛋白出現(xiàn)在沉淀中，而pMAL-c5x載體可以在上清中表達(dá)可溶性蛋白[23]。胡威等研究了含有不同標(biāo)簽的原核表達(dá)載體對PR-1融合蛋白表達(dá)的影響，pET-30a和pET-P16P載體為包涵體表達(dá)，而pET-ELP載體為可溶性表達(dá)[24]。李賽賽等構(gòu)建了7個(gè)含有不同標(biāo)簽的原核表達(dá)載體，其中含MBP標(biāo)簽的載體可以表達(dá)出高可溶性的VP2-LS3重組蛋白[25]。這些研究結(jié)果表明，對于一些包涵體表達(dá)或沉淀表達(dá)，可以通過更換具有不同標(biāo)簽的原核表達(dá)載體獲得可溶性蛋白。本研究構(gòu)建了基因的4個(gè)原核表達(dá)載體，包括含有His標(biāo)簽的載體pET-22b(+)和pET-32a(+)、含有MBP標(biāo)簽的pMAL-c5x以及含有GST標(biāo)簽的pGEX-4T-1。結(jié)果顯示pGEX-4T-1載體可以使GhWRKY91蛋白在上清中成功表達(dá)，表明通過更換不同標(biāo)簽載體可以獲得GhWRKY91的可溶性蛋白。MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽）和GST（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽）與His（組氨酸標(biāo)簽）標(biāo)簽相比，均屬于高度可溶的標(biāo)簽蛋白，但是只有GST標(biāo)簽獲得了可溶性蛋白，表明并不是所有的高度可溶標(biāo)簽蛋白都可以使重組蛋白進(jìn)行可溶性表達(dá)[25-26]。

綜上所述，本研究構(gòu)建了基因的不同原核表達(dá)載體，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE檢測，成功表達(dá)了GhWRKY91-GST可溶性融合蛋白，為進(jìn)一步進(jìn)行GhWRKY91的蛋白純化和功能研究提供了基礎(chǔ)。

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Prokaryotic expression and identification analysis of transcription factorgene in cotton ()

GU Lijiao1, 2, WEI Hengling1, YU Shuxun1

(1. State Key Laboratory of Cotton Biology, Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences，Anyang 455000;2. College of Forestry, Hebei Agricultural University, Baoding 071000)

The study was aimed at screening out the prokaryotic expression vector with high expression of cotton GhWRKY91 soluble protein. Thegene was amplified by PCR using cDNA of CCRI10 leaves as template, and the amplified products were constructed into four different prokaryotic expression vectors, pET-22b(+), pET-32a(+), pMAL-c5x and pGEX-4T-1, respectively. The recombinant vectors, pET-22b(+)-, pET-32a(+)-, pMAL-c5x-and pGEX-4T-1-were transformed intostrains BL21(DE3) or Arctic-Express?(DE3)RP. The fusion protein expression was induced by IPTG, and SDS-PAGE electrophoresis was used to analyze the protein expression by different prokaryotic expression vectors. The results showed that no obvious protein expression was observed in pET-22b(+)-and pET-32a(+)-in BL21(DE3) and pMAL-c5x-in Arctic-Express?(DE3)RP. However, the protein expressed by pGEX-4T-1-in Arctic-Express?(DE3)RP was presented in the supernatant, and a soluble protein could be obtained. Therefore, GhWRKY91 soluble protein can be successfully obtained by constructinggene into the prokaryotic expression vector of pGEX-4T-1.

cotton;gene; SDS-PAGE; prokaryotic expression; expression analysis

S562

A

1672-352X (2021)06-0878-05

10.13610/j.cnki.1672-352x.20220106.012

2022-1-7 8:02:25

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20220106.1253.024.html

2019-09-06

國家棉花產(chǎn)業(yè)體系（CARS-15-06）和河北農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才科研專項(xiàng)（YJ2021011）共同資助。

顧麗姣，博士。E-mail：gulijiao1990@126.com

通信作者:喻樹迅, 研究員，博士生導(dǎo)師。E-mail：Ysx195311@163.com