ASTL 抗體中和ASTL 對人宮頸癌ME-180細胞放射敏感性的影響

趙舒雅 李航 樊賽軍

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院放射醫(yī)學研究所，天津市放射醫(yī)學與分子核醫(yī)學重點實驗室 300192

宮頸癌是世界上最常見的女性惡性腫瘤之一，居全球女性癌癥患者病死原因的第二位[1]，在發(fā)展中國家尤為常見。近年來，我國宮頸癌患者也逐漸增多，每年病死于宮頸癌的患者約有5 萬例[2]，且患者年齡呈年輕化趨勢。從病因角度分析，約有95%的患者因人乳頭瘤狀病毒（HPV）感染罹患宮頸癌，部分感染者體內的人乳頭瘤狀病毒（HPV）隨時間延長而被清除，還有部分患者因持續(xù)感染導致宮頸癌變[3]。放療是治療宮頸癌的常用方法，但約有30%的晚期宮頸癌患者經(jīng)放療后出現(xiàn)腫瘤復發(fā)和轉移，導致預后不佳，嚴重影響患者的生存質量[4]。因此，如何有效增強宮頸癌細胞的放射敏感性，減少放療對正常組織的放射損傷及放療后的不良反應，提高放療的療效，成為亟待解決的問題。

龍蝦肽酶樣金屬內肽酶（astacin-like metalloendopeptidase，ASTL）是一類與卵母細胞表面相關的鋅基質金屬蛋白酶。ASTL 基因編碼含有431 個氨基酸、相對分子質量為46 000 的蛋白產(chǎn)物。生物信息學結構預測結果表明，ASTL 蛋白由N 端信號肽、含有催化位點模序的蛋白酶功能區(qū)和C 末端多肽組成[5]。ASTL 的基因序列在不同物種間相對保守（如人與小鼠的同源率高達75.2%），但基因的組織表達特異性顯著，同時ASTL 蛋白可以在精卵相互作用時發(fā)揮功能，并在受精過程中阻止多精入卵[6]。有研究結果表明，ASTL 在腫瘤和正常細胞中存在表達差異，其表達水平與子宮癌、卵巢癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展相關，并可作為診斷子宮癌的生物標志物；同時由于膜蛋白易與抗體結合，加入蛋白抗體可促進ASTL 在溶酶體中的降解，進而影響子宮癌細胞的生長，因此ASTL還可以作為子宮癌免疫治療的一種新型藥物靶點[7-8]。本研究探討ASTL 蛋白在人宮頸癌ME-180細胞抵抗輻射中的作用，旨在為宮頸癌及ASTL 與放療增敏的相關臨床與基礎研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DMEM 液體培養(yǎng)基、胎牛血清均購自以色列Biological 生物科技公司；青鏈霉素雙抗購自美國Hyclone 公司；Hoechst 33342 反應液、二甲基亞砜、谷氨酰胺、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]溶液、RIPA 裂解液、蛋白加樣緩沖液、Triton X-100、牛血清白蛋白、抗熒光衰減封片劑均購自北京索萊寶科技有限公司；Lipofectamine 3000、Trizol試劑均購自美國Invitrogen 生命技術有限公司；ECL超敏發(fā)光液購自白鯊生物科技公司；短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）ASTL（sh-ASTL）質粒購自蘇州金唯智生物科技有限公司；cDNA 合成試劑盒購自日本 TaKaRa 公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒、聚偏氟乙烯（PVDF）膜均購自美國賽默飛世爾科技公司；兔抗人ASTL 抗體購自上海滬震生物科技公司；磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，pAKT）抗體、 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體均購自美國Proteintech 公司；AKT 抗體、細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G 及熒光素異硫氰酸酯（FITC）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G 均購自英國Abcam 公司；5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU）試劑盒購自南京恩晶科技生物有限公司；細胞膜蛋白和細胞質蛋白提取試劑盒均購自上海貝博生物科技有限公司。Gammacell?40 Exactor137Cs γ 射線照射源，劑量率為1 Gy/min，購自加拿大Best Theratronics 公司；RT-6500 酶標分析儀購自深圳雷杜生命科學股份有限公司；D3024R 離心機購自大龍興創(chuàng)實驗儀器北京股份公司；TCS SP5 激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國徠卡公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組和照射

人宮頸癌HeLa 細胞、ME-180 細胞均購自美國模式菌種收集中心。用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)ME-180 細胞；用含10%胎牛血清、3%谷氨酰胺、1%青鏈霉素雙抗的DMEM 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa 細胞。培養(yǎng)條件為5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)，細胞鋪滿培養(yǎng)瓶約80%時進行傳代亞培養(yǎng)。

根據(jù)細胞處理方法的不同，按以下方式進行分組。（1）將ME-180 細胞分為4 組：對照組、照射組（4 Gy）、ASTL 抗體組和ASTL 抗體+照射組（4 Gy），采用EdU 染色、MTT 實驗檢測細胞的存活情況和增殖能力，并于照射后0、24、48、72 h采用免疫熒光、Western blot 實驗檢測ASTL 在細胞中的定位情況。（2）將ME-180 細胞分為2 組：照射組、ASTL 抗體+照射組，分別進行0、2、4、8 Gy 照射，并采用克隆形成實驗檢測每組細胞的增殖能力。（3）將HeLa 細胞分為2 組：對照組、ASTL 抗體組，分別進行0、2、4、8 Gy 照射，采用MTT 實驗檢測細胞的存活情況。（4）將ME-180 細胞分為2 組：短發(fā)夾RNA 對照組（sh-對照組）、短發(fā)夾RNA ASTL 轉染組（sh-ASTL 組），采用qRT-PCR、Western blot 實驗檢測AKT 等靶基因的表達；同時，分別用0、5、10 nmoL/L 的抗體處理ME-180 細胞，采用Western blot 實驗檢測抗體中和對靶基因表達情況的影響。（5）將ME-180細胞分為2 組：對照組、照射組（4 Gy），采用Western blot 實驗檢測ASTL、AKT 等靶基因的表達情況。

以上除第（4）組實驗提到的抗體濃度，其他實驗所用抗體濃度均為5 nmoL/L。所有照射均使用137Cs γ 射線照射源，劑量率為1 Gy/min。

1.3 EdU 染色實驗

將接受不同處理后且處于對數(shù)生長期的ME-180細胞，按1×103個/孔接種于96 孔板中，4 Gy 照射后24 h 進行EdU 染色實驗。制備適量50 μmol/L的EdU 培養(yǎng)基，每孔100 μL，37℃孵育2 h；PBS洗2 次，每次5 min；加入50 μL 4%多聚甲醛室溫固定30 min，固定完成后棄去細胞固定液；加入3%牛血清白蛋白洗2 次；加入100 μL 0.5%Triton X-100 的PBS，室溫孵育10 min；加入100 μL PBS，脫色搖床洗5 min；加入100 μL 1×X Apollo?染色反應液，室溫、避光條件下，脫色搖床孵育30 min；棄除染色反應液后，加入滲透劑（0.5%Triton X-100 的PBS），每孔100 μL，室溫反應10 min，除去滲透劑；加入100 μL 的甲醇洗2 次，每次5 min；加入100 μL PBS 洗滌，5 min；加入100 μL 1×Hoechst 33342 反應液，搖床孵育30 min，注意避光，棄去反應液；加入100 μL PBS 清洗2 次。染色完成后，立即觀察并獲取圖像。

1.4 MTT 實驗

ME-180 細胞、HeLa 細胞接受不同劑量（0、2、4、8 Gy）的射線照射后，按3×104個/孔接種于96 孔板中，培養(yǎng)20 h 后，每孔加入20 μL 的 MTT溶液，于37℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，加入100 μL 二甲基亞砜，搖床低速振搖10 min。使用酶標儀檢測各組細胞在490 nm 處的吸光度。

1.5 克隆形成實驗

ME-180 細胞接受不同劑量（0、2、4、8 Gy）的射線照射后，立即將約2000 個不同處理組的細胞接種至60 mm 的培養(yǎng)皿中。細胞連續(xù)培養(yǎng)3 周至出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，棄掉培養(yǎng)基用甲醇固定30 min，加姬姆薩應用液染色30 min，流水洗凈，計數(shù)細胞數(shù)≥50 個作為1 個克隆，計算克隆數(shù)。細胞克隆形成率=照射細胞克隆數(shù)/未照射同種細胞克隆數(shù)×100%。

1.6 免疫熒光實驗

將1×105個ME-180 細胞接種到放置有蓋玻片的6 孔板中，24 h 后進行4 Gy 照射4 min。（1）分別在照射后0、24、48、72 h 去掉培養(yǎng)基，PBS 清洗2 次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，室溫下固定15 min。（2）0.3% Triton X-100 室溫下處理細胞15 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h。（3）加入兔抗人ASTL 抗體（1∶400 稀釋）30 μL，4℃孵育過夜，PBS 清洗 3 次，加入異硫氰酸熒光素（FITC）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（1∶1000 稀釋） ，室溫孵育1 h，PBS 清洗。（4）PBS 中搖晃清洗3 次，滴加50 μL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液于蓋玻片，室溫孵育30 min。（5）PBS 中搖晃清洗3 次，用30 μL抗熒光衰減封片劑進行封片，干燥后于熒光顯微鏡下觀察。使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察照射后不同時間點（0、24、48、72 h）ASTL 在細胞中的定位情況。

1.7 Western blot 實驗

PBS 清洗處理后的ME-180 細胞，將150 μL/孔RIPA 裂解液加入6 孔板，并置于冰上裂解細胞2 h，10 000×g離心10 min，取上清液。加入等體積的2 倍濃度的蛋白加樣緩沖液，沸水煮沸5 min，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；電泳結束后轉膜，將聚偏氟乙烯（PVDF）膜切成凝膠大小，在100%甲醇中預浸一下后浸泡在緩沖液中，保持膜和凝膠濕潤；轉膜結束后，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；依次加入兔抗人ASTL 抗體（1∶400稀釋）、AKT 抗體、pAKT 抗體、ERK1 抗體（均為1∶1000 稀釋），4℃孵育過夜；用TBST（ tris buffered saline with tween）緩沖液洗3 次，每次15 min；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（1∶2000 稀釋）室溫孵育1 h，TBST 洗3 次，每次15 min；用ECL（enhanced chemiluminescent）發(fā)光法檢測蛋白的表達。

1.8 細胞轉染和抗體處理

轉染前1 d，將密度為1×105個/mL 的ME-180細胞接種于6 孔板中，使轉染時的細胞密度保持在70%左右。用125 μL 無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基分別與3.75 μL、7.5 μL 的Lipofectamine 3000混合，混勻后室溫下孵育5 min，為A 液；用125 μL無血清無抗生素的DMEM 培養(yǎng)基稀釋sh-ASTL，1 μg/孔sh-ASTL，混勻后孵育5 min，為B 液；將A、B 溶液混勻即為轉染液，孵育30 min。轉染時去掉6 孔板中的培養(yǎng)基，PBS 洗2～3 次，每孔加入約2 mL 無血清無抗生素的DMEM 培養(yǎng)基，將孵育后的轉染液加入6 孔板中，輕輕搖晃混合；于37℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h 后換為含血清、青鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)[9]。24 h后收集細胞，檢測ME-180 細胞中AKT、ASTL等mRNA 與靶基因的表達情況。同時，分別用0、5、10 nmoL/L 的抗體處理ME-180 細胞，檢測抗體中和對靶基因表達情況的影響。

1.9 qRT-PCR 檢測AKT 表達

將700 μL/孔 Trizol 試劑加入6 孔板裂解細胞，提取細胞總RNA，將提取的RNA 按照cDNA合成試劑盒說明書反轉錄生成cDNA，將甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）mRNA 的表達量作為內參。進行qRT-PCR，分析其擴增曲線和融解曲線。擴增條件： 95℃預變性 30 s；95℃變性3 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40 次，數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCt法進行分析。 實驗所需引物來源于GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）以及miRBase（https://www.mirbase.org）數(shù)據(jù)庫，通過Primer Premier 5 軟件（購自美國PREMIER Biosoft公司）進行引物設計，具體序列見表1。

表1 mRNA 實時熒光定量PCR 引物序列Table 1 The primers for quantitative real-time PCR analysis of the mRNA

1.10 細胞膜和細胞質蛋白的提取

取5×106～10×106個經(jīng)5 nmoL/L 兔抗人ASTL 抗體處理的ME-180 細胞，在4℃、500×g條件下離心3 min，小心去除培養(yǎng)基，收集細胞。用冷PBS 洗滌細胞2 次。按照細胞膜蛋白和細胞質蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白。細胞樣品中加入200 μL 冷的試劑A、 2 μL 蛋白酶抑制劑混合物、2 μL蛋白穩(wěn)定劑，高速渦旋振蕩15 s，置冰上10 min。再次高速渦旋振蕩5 s，然后在4℃、13 000×g條件下離心5 min?？焖賹⑸锨遛D移至另一預冷的干凈離心管，37℃水浴5～10 min，37℃下2 000×g離心5 min，此時溶液分為兩層（對著光線看），下層相約為20 μL，收集上層相，即為細胞質蛋白。用150～200 μL 冷的試劑B 稀釋下層相，混勻后冰浴2 min，37℃水浴10 min，37℃下22 000×g離心5 min，此時溶液分為兩層（對著光線看），下層相約為20 μL，用100 μL冰冷的試劑C 稀釋下層相，即得細胞膜蛋白。

1.11 統(tǒng)計學分析

應用 IBM SPSS Statistics 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布、方差齊性檢驗后，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ASTL 對宮頸癌細胞放射敏感性的影響

EdU 染色實驗結果顯示，ASTL 抗體組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=2.45，P＞0.05），照射組（4 Gy）和ASTL 抗體組與ASTL 抗體+照射組（4 Gy）比較，細胞增殖的差異均有統(tǒng)計學意義（t=9.25、11.16，均P＜0.05）（圖1A）。MTT 實驗結果顯示，與對照組相比，照射后24、48、72 h 時照射組（4 Gy）和ASTL 抗體組ME-180 細胞增殖速度的差異均無統(tǒng)計學意義（t=2.16、2.33、2.57，均P＞0.05；t=2.11、2.43、2.77，均P＞0.05）；而與照射組相比，ASTL 抗體+照射組（4 Gy）ME-180 細胞的生長速度明顯降低，且差異均有統(tǒng)計學意義（t=5.17、10.32、14.27，均P＜0.05）（圖1B）。在HeLa細胞的MTT 實驗中也得到同樣的結果，與照射組相比，ASTL 抗體+照射組2、4、8 Gy 受照射細胞的生長受到顯著抑制，差異均有統(tǒng)計學意義（t=4.27、9.66、15.71，均P＜0.05）（圖1C）。ME-180細胞的克隆形成實驗結果顯示，與照射組相比，ASTL 抗體+照射組能夠顯著抑制8 Gy 照射后ME-180 細胞的增殖，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.63，P＜0.05）（圖1D）。以上實驗結果表明，ASTL 抗體能夠通過中和ASTL 抑制照射后ME-180 細胞的生長和增殖，初步揭示ASTL 在受到照射后的ME-180細胞的生長和增殖過程中發(fā)揮了重要的調控作用。

圖1 ASTL 抗體對人宮頸癌ME-180 和HeLa 細胞放射敏感性的影響 A 為EdU 染色實驗檢測ME-180 細胞在接受不同條件處理后細胞的增殖情況，左圖中從左到右依次為EdU 染色、Hoechst 活細胞染色及二者合并圖，右圖為陽性細胞計數(shù)結果，a 表示與ASTL 抗體+照射組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（t=9.25、11.16，P＜0.05）；B 為MTT 實驗檢測ME-180 細胞在接受不同條件處理后的細胞存活情況，a 表示與照射組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（t=5.17、10.32、14.27，均P＜0.05）；C 為MTT 實驗檢測HeLa 細胞在接受不同條件處理后的細胞存活情況，a 表示與照射組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（t=4.27、9.66、15.71，均P＜0.05）；D 為克隆形成實驗檢測ASTL 抗體對不同劑量照射后ME-180 細胞增殖能力的影響，a 表示與照射組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.63，P＜0.05）。ASTL 為龍蝦肽酶樣金屬內肽酶；EdU 為5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷；Hoechst 為赫斯特活細胞染色；MTT 為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽Figure 1 Effect of astacin-like metalloendopeptidase antibody on radiosensitivity of human cervical cancer ME-180 and HeLa cells

2.2 ASTL 在照射后的ME-180 細胞中的表達水平及定位

免疫熒光、Western blot 實驗結果顯示，ME-180細胞經(jīng)4 Gy 照射后，ASTL 蛋白在ME-180 細胞中的定位發(fā)生轉移。照射后0 h 時，標記ASTL 蛋白的綠色熒光位于細胞膜；24 h 后，細胞膜綠色熒光強度降低，細胞質綠色熒光強度升高；照射后48～72 h，ASTL 重新定位在細胞膜上（圖2A、B）。Western blot 實驗結果顯示，ASTL 抗體加入后，細胞總蛋白量下降，ASTL 蛋白在細胞質與細胞膜的定位數(shù)減少，照射后24 h，ASTL 蛋白在細胞質中的定位數(shù)增加，但低于照射組（圖2C）。以上實驗結果表明，照射后的ME-180 細胞中ASTL 蛋白水平上調，定位由細胞膜轉移至細胞質，且發(fā)揮功能后又重新定位至細胞膜。重新定位后，ASTL 蛋白量與轉移前無明顯差異。

圖2 4 Gy γ 射線照射對ASTL 蛋白在人宮頸癌ME-180 細胞中定位的影響 A 為免疫熒光實驗檢測ASTL 蛋白在照射后不同時間點的表達水平以及在細胞中的定位情況； B 為Western blot 實驗檢測照射后不同時間點ASTL 蛋白在細胞膜及細胞質中的表達水平；C 為加入抗體后Western blot 實驗檢測不同時間點ASTL 蛋白在細胞膜及細胞質中的表達水平。ASTL 為龍蝦肽酶樣金屬內肽酶；DAPI 為4′,6-二脒基-2-苯基吲哚；MERGE 為合并后圖像；GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶；ATP1B2 為鈉鉀三磷酸腺苷酶通道蛋白2Figure 2 Effect of 4 Gy γ-rays on the localization of astacin-like metalloendopeptidase protein in human cervical epidermal cancer ME-180 cells

2.3 ASTL 轉移至細胞質后對AKT 等靶基因表達水平及其信號通路的影響

采用qRT-PCR 實驗檢測ASTL 干擾后細胞中與輻射抵抗相關的部分癌基因的表達水平變化情況，結果顯示，ASTL 干擾片段轉入后，ME-180細胞中與腫瘤發(fā)生相關的基因表達水平下降最明顯的為AKT，差異有統(tǒng)計學意義（t=13.94，P＜0.05）（圖3A）。通過Western blot 實驗進一步檢測了ASTL 對AKT 信號通路中相關靶基因的調控作用，結果顯示，ASTL 干擾或加入ASTL 抗體對輻射后ME-180 細胞的AKT等靶基因的表達水平下調作用顯著（圖3B）。ME-180 細胞接受4 Gy 照射后，結果顯示，與對照組相比，照射組（4 Gy）ASTL、AKT 等靶基因的表達水平顯著升高（圖3C）。綜上，ASTL 抗體或sh-ASTL 可通過中和ASTL 抑制AKT 信號通路，從而增強ME-180 細胞的放射敏感性。

圖3 Sh-ASTL 或ASTL 抗體對人宮頸癌ME-180 細胞中AKT 等靶基因表達的影響 A 為qRT- PCR 實驗檢測ME-180 細胞中干擾ASTL 后相關基因的表達水平變化，a 表示與sh-對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（t=13.94、6.37、9.16， 均P＜0.05）；B 為ME-180細胞接受4 Gy γ 射線照射后24 h 時，Western blot 實驗檢測ASTL 干擾或抗體中和對AKT 信號通路中相關基因表達水平的影響；C 為4 Gy γ 射線照射對ASTL、AKT 等基因表達水平的影響。AKT 為蛋白激酶B；ATM 為共濟失調毛細血管擴張突變基因；PDK 為3-磷酸肌醇依賴蛋白激酶；ERK 為細胞外信號調節(jié)激酶；CHK 為沉默細胞周期檢測點激酶；PTEN 為人第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因；Survivin 為凋亡抑制蛋白存活素；ASTL 為龍蝦肽酶樣金屬內肽酶；sh-ASTL 為用短發(fā)夾 RNA 敲降ASTL；pAKT 為磷酸化蛋白激酶B；GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶Figure 3 Effect of Sh-ASTL or ASTL antibody on the expression of protein kinase B gene and other target genes in human cervical cancer ME-180 cells

3 討論

宮頸癌的基本治療方法為放療和手術治療。放療通過能量的釋放阻止細胞生長并破壞癌細胞的生物學功能，從而達到抑制腫瘤生長，使其減小甚至消失的目的[9-10]。目前放療已成熟應用于多種腫瘤治療中。對于一些無法進行手術的晚期宮頸癌患者來說，放療也能緩解疼痛，延長壽命，并提高患者生存質量[11-12]。目前，放療在宮頸癌的臨床應用中仍存在許多問題。尤其隨著放療過程的進展，宮頸癌患者的癌細胞的放射敏感性逐漸降低，腫瘤瘤體持續(xù)快速生長，發(fā)生浸潤或轉移，再次降低了患者的生存質量[13-14]。

在前期研究中，我們通過人蛋白質圖譜（HPA）、癌癥基因圖譜（TCGA）及腫瘤芯片（Scotto Cervix）數(shù)據(jù)庫獲取了ASTL 基因在多種臨床腫瘤組織中的表達情況，其中，ASTL 基因在宮頸癌中的異常表達最為顯著，因此，我們選擇人宮頸癌ME-180 細胞作為研究對象。通過人為加入ASTL 抗體中和膜蛋白ASTL，證實了ASTL 抗體對ME-180細胞的放射敏感性具有影響，且隨著照射劑量的增大，實驗組與對照組細胞的存活與增殖情況差異愈顯著。隨后轉入ASTL 干擾片段，對ME-180 細胞中與宮頸癌發(fā)生相關的基因表達變化情況進行了研究，結果顯示，AKT 等靶基因的表達水平下調顯著。

磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/AKT 通路是癌癥發(fā)展和治療中最重要的激酶信號網(wǎng)絡之一，AKT 是這一通路的中心介質，其異常激活與許多惡性腫瘤有關，包括肺癌[15]、肝細胞癌[16]、乳腺癌[17]、鼻咽癌[18]和宮頸癌[19]等?；罨腁KT 可參與細胞的生長和增殖[20]，調控細胞凋亡[21]進程，并與腫瘤的侵襲、轉移和血管生成等相關，參與多種生物學進程。目前也有研究結果證實，AKT 與腫瘤化療耐藥[22]和輻射抵抗[20]相關，特別是其參與的信號通路在輻射抵抗中起關鍵作用[23]。本研究結果顯示，γ 射線照射后，ASTL 干擾顯著降低γ 射線照射后ME-180 細胞的存活與增殖能力，ASTL 抗體的增敏作用隨濃度增加而增強，并伴隨AKT 等靶基因的表達水平降低。這一結果提示，ASTL 通過影響AKT 信號通路介導宮頸癌細胞的輻射抵抗。且本研究結果發(fā)現(xiàn)，γ 射線照射后，ASTL 在細胞中的表達水平升高，并由細胞膜向細胞質轉移。在今后的研究中，應進一步對照射后轉移到細胞質的ASTL 蛋白功能開展研究，并且采用更為多樣的實驗方法進行評估，深入探究其機制。

綜上所述，本研究結果證實ME-180 細胞的放射敏感性與ASTL 的表達水平相關，且照射后細胞的ASTL、AKT 表達水平升高，而人為中和ASTL后，ME-180 細胞抵抗輻射的能力降低，放射敏感性顯著提高。因此，隨著ASTL 對宮頸癌放射敏感性調控機制相關研究的深入，其或可作為治療宮頸癌的新靶點，這具有非常重要的基礎研究價值和臨床意義，將為解決宮頸癌放療中細胞輻射抵抗的難題奠定理論基礎。

利益沖突本研究由署名作者按以下貢獻聲明獨立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻聲明趙舒雅、李航負責實驗的實施、論文的撰寫；樊賽軍負責課題設計的指導、論文的審閱與修改。