納米銀在嚙齒動(dòng)物生殖細(xì)胞和胚胎發(fā)育中的潛在毒性效應(yīng)

周 萌，雷田田，姜 楠，沈建云，姜雙林*

（1.阜陽(yáng)師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽(yáng)236037；2.胚胎發(fā)育與生殖調(diào)節(jié)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 阜陽(yáng)236037）

關(guān)鍵字：納米銀；大鼠；小鼠；生殖毒性；發(fā)育毒性；納米材料

納米材料（nano-materials，NMs）被認(rèn)為是二十一世紀(jì)最先進(jìn)的材料之一。納米材料是指含有50%或更多的納米顆粒（尺寸或數(shù)量），一個(gè)或多個(gè)外部尺寸在1～100 nm 之間的粒子。目前，納米材料已廣泛應(yīng)用于工業(yè)、工程、化學(xué)、藥理學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、材料科學(xué)等諸多領(lǐng)域，帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。然而，納米材料的廣泛應(yīng)用和職業(yè)環(huán)境的接觸增加了人體暴露的機(jī)會(huì)，從而增加了與其短期和長(zhǎng)期毒性相關(guān)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。事實(shí)上，納米材料的廣泛應(yīng)用引起了人們對(duì)其生物效應(yīng)和健康風(fēng)險(xiǎn)的極大關(guān)注。而納米銀（AgNPs）是醫(yī)療和消費(fèi)品中應(yīng)用最廣泛的商業(yè)化納米材料之一[1]。銀納米粒子是優(yōu)秀的抗菌劑，主要由于它們?cè)谌芤汉统煞种虚L(zhǎng)時(shí)持續(xù)地釋放出廣譜的抗菌銀離子（Ag+）。因此，納米銀粒子被普遍加入到多種產(chǎn)品的材料中，如電子產(chǎn)品、食品包裝、服裝、玩具、婦女衛(wèi)生用品和保健品等[2]。尤其是在消費(fèi)品中濫用和頻繁使用銀納米粒子及其相關(guān)產(chǎn)品，是人們接觸銀納米粒子的一個(gè)重要來(lái)源?；谶@一現(xiàn)實(shí)，迫切需要評(píng)估銀納米粒子和相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)入工作環(huán)境和消費(fèi)品的安全性，以更清楚了解其對(duì)人類(lèi)健康的任何潛在不利影響。

如今，納米毒理學(xué)已經(jīng)成為毒理學(xué)一個(gè)新的分支學(xué)科，涉及納米粒子的毒理學(xué)及其潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。納米粒子可以很容易地進(jìn)入細(xì)胞并且由于其極小的尺寸而能夠穿過(guò)生物膜，導(dǎo)致氧化應(yīng)激、線粒體損傷，DNA 突變甚至細(xì)胞凋亡/死亡。近年來(lái)，已發(fā)現(xiàn)許多金屬納米粒子對(duì)胚胎發(fā)育具有毒性作用，例如納米二氧化硅、金納米、銀納米、二氧化鈦、量子點(diǎn)等金屬納米粒子[3-5]。目前，人體接觸納米銀最常見(jiàn)的途徑包括：皮膚接觸、吸入、攝食和皮膚滲透等，納米粒子一旦進(jìn)入血液能夠轉(zhuǎn)移至身體各個(gè)器官和組織。對(duì)小鼠或大鼠等嚙齒動(dòng)物進(jìn)行毒理學(xué)研究主要采用吸入暴露、口服灌胃、靜脈注射、皮膚接觸、腹腔注射等手段。

研究發(fā)現(xiàn)大鼠/小鼠通過(guò)吸入、攝取或靜脈注射給藥等方式進(jìn)行AgNPs 暴露后，能夠在血液中檢測(cè)到AgNPs，并在肺、肝、腎、腸和腦等多個(gè)器官中引起毒性。例如，Sung 等[6]進(jìn)行了一項(xiàng)亞慢性（90 d）吸入研究結(jié)果顯示，暴露于18 nm AgNPs的大鼠出現(xiàn)輕度劑量依賴(lài)性的肺部炎癥和肺功能改變。而吸入的AgNPs 也可能進(jìn)入全身循環(huán)，分布到肝外和肺外等器官，如在使用15 nmAgNPs且濃度為1×106～3×106cm-3的研究中[7-8]。此外，吸入納米銀90 d 后，在大鼠的肺和肝臟中納米銀的積累更加明顯[6]。在一項(xiàng)吸入研究中，發(fā)現(xiàn)懷孕的雌性小鼠在妊娠的前15 d 中每天接觸新制備的AgNPs 氣溶膠1 h/d 或4 h/d，顯示了AgNPs（18～20 nm，濃度為3.8×107cm-3）可以到達(dá)并穿過(guò)小鼠胎盤(pán)[9]。但與其相反的是，一些研究表明AgNPs吸入暴露沒(méi)有誘發(fā)不良反應(yīng)，在一項(xiàng)對(duì)大鼠進(jìn)行的為期28 天的吸入毒性研究表明，雄性或雌性大鼠在暴露于AgNPs（11～14 nm ，濃度為1.73×104cm-3，1.27×105cm-3和1.32×106）后，血液學(xué)和血液生化方面均無(wú)顯著變化[10]。Hyun 等[11]研究也發(fā)現(xiàn)AgNPs（12～15 nm）吸入暴露后，暴露組的鼻腔和肺組織病理學(xué)均無(wú)明顯變化。猜測(cè)導(dǎo)致這些研究結(jié)果不一致的原因，可能與納米銀的粒徑、暴露方式、劑量和暴露時(shí)間等實(shí)驗(yàn)方案的差別有關(guān)。

大量研究已經(jīng)表明AgNPs 通過(guò)各種途徑進(jìn)入血液循環(huán)，穿過(guò)血腦屏障、血睪屏障和胎盤(pán)屏障等生理屏障而靶向多種器官，觸發(fā)一系列的毒性效應(yīng)。目前，AgNPs 對(duì)動(dòng)物的生殖毒性受到了人們的高度重視，尤其是AgNPs 對(duì)果蠅、斑馬魚(yú)等動(dòng)物的生殖發(fā)育毒性已有大量的報(bào)道，但是Ag-NPs 對(duì)嚙齒動(dòng)物潛在的生殖毒性研究才剛剛起步。因此，在這篇綜述中，我們總結(jié)了目前關(guān)于AgNPs 對(duì)小鼠、大鼠等哺乳動(dòng)物生殖發(fā)育毒性的研究現(xiàn)狀，為進(jìn)一步理解AgNPs 對(duì)哺乳動(dòng)物可能潛在的生殖發(fā)育風(fēng)險(xiǎn)研究提供參考。

1 納米銀誘發(fā)雄性生殖系統(tǒng)的毒性效應(yīng)

1.1 納米銀對(duì)精子的毒性效應(yīng)

精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的生物過(guò)程，對(duì)諸如納米粒子、化學(xué)藥品和物理應(yīng)激源等環(huán)境影響尤其敏感。已經(jīng)證明，接觸特定化學(xué)物質(zhì)會(huì)對(duì)生殖細(xì)胞增殖和分化產(chǎn)生負(fù)面影響，從而降低精子數(shù)量，進(jìn)而影響生育能力。此外，有毒物質(zhì)可能會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生DNA 損傷，從而可能對(duì)后代的發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響。一般認(rèn)為在大鼠中，精原細(xì)胞發(fā)育成精子大約需要48～52 d。因此，在精子發(fā)生時(shí)期暴露于納米銀常常會(huì)導(dǎo)致精子的毒性效應(yīng)。

已經(jīng)被證明雄鼠在注射AgNPs 后，AgNPs 可以跨越小鼠和大鼠的血睪屏障和血腦屏障。并且AgNPs 或Ag+能夠在睪丸中積累，誘發(fā)雄鼠的睪丸/精子毒性，進(jìn)而對(duì)精子功能和生育能力產(chǎn)生影響。Miresmaeili 等[12]研究表明，在生精期對(duì)雄性Wistar 大鼠進(jìn)行AgNPs 暴露顯著減少了生精細(xì)胞的數(shù)量，并且還影響了精細(xì)胞中的頂體反應(yīng)，同樣也有相似研究發(fā)現(xiàn)精子的頂體完整性受到了損害[13]，進(jìn)一步佐證了AgNPs 對(duì)精子頂體反應(yīng)的有害效應(yīng)。此外，許多因素可能會(huì)干擾精子發(fā)生，特別是在青春期前，由于睪丸和附睪的發(fā)育使這一過(guò)程對(duì)內(nèi)分泌干擾物的作用更加敏感[14]。青春期是介于幼年期和成年期之間的過(guò)渡期，其中性成熟開(kāi)始于下丘腦-垂體-性腺軸，最終發(fā)展為第二性征和生殖能力[15]。而陰莖包皮與龜頭的分離，即包皮分離是青春期進(jìn)展的早期標(biāo)志，通常發(fā)生在40～50 d。通常分離包皮確定大鼠的青春期的進(jìn)程。而在青春期前對(duì)Wistar 大鼠進(jìn)行納米銀灌胃處理發(fā)現(xiàn)AgNPs 降低了精子頂體和質(zhì)膜完整性，降低了線粒體活性，增加了精子畸形率。同時(shí)也延緩了青春期的開(kāi)始[16]，并對(duì)青春期后的精子發(fā)育產(chǎn)生不利影響。這種影響反映在成年后精子發(fā)生過(guò)程的障礙和精子數(shù)量的減少。而這些效應(yīng)在暴露結(jié)束后沒(méi)有逆轉(zhuǎn)[14]，表明了傷害的不可逆性。

AgNPs 可引起睪丸和附睪激素失衡和氧化應(yīng)激，從而對(duì)精子發(fā)生產(chǎn)生不利的效應(yīng)。例如，Olugbodi[17]發(fā)現(xiàn)皮下注射AgNPs 改變了大鼠的血液學(xué)指標(biāo)，并導(dǎo)致精子活力、速度、運(yùn)動(dòng)學(xué)參數(shù)、黃體生成素、卵泡刺激素和睪酮濃度呈劑量依賴(lài)性下降。在附睪和睪丸中丙二醛和過(guò)氧化物含量的升高，超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、還原型谷胱甘肽和總巰基含量的降低。表明AgNPs 可引起睪丸和附睪激素失衡和氧化應(yīng)激，從而對(duì)雄性大鼠精子產(chǎn)生負(fù)面影響。

低水平的活性氧（reactive oxygen species，ROS）在正常的精子生理中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括受精能力（頂體反應(yīng)，超活化，獲能和趨化性）和精子運(yùn)動(dòng)；而ROS 升高或降低的抗氧化能力會(huì)導(dǎo)致生命系統(tǒng)氧化還原之間的不平衡，這稱(chēng)為精子氧化應(yīng)激。普遍認(rèn)為精子氧化應(yīng)激是精子DNA 損傷/凋亡，脂質(zhì)過(guò)氧化和運(yùn)動(dòng)能力降低的重要因素，繼而增加了男性不育/ 亞生育力和出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)。針對(duì)這一方面，Ton 等[18]將BDF1 雄性小鼠精子AgNPs 暴露3 h 后與卵母細(xì)胞進(jìn)行體外胚胎培養(yǎng)96 h，發(fā)現(xiàn)AgNPs 能內(nèi)化到精子中，其低劑量時(shí)主要定位于精子質(zhì)膜，較高劑量時(shí)定位于精子頭部和線粒體區(qū)域，顯著增加了精子畸形。此外，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，AgNPs 誘導(dǎo)的活性氧增加可導(dǎo)致精子畸形和精子存活率下降[16,19]。也有研究結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)納米銀顆粒處理的動(dòng)物精子參數(shù)顯著降低，其精子活力的降低可能是由于納米銀顆粒對(duì)線粒體功能的影響。Braydich 等[20]證明納米顆粒對(duì)C18-4 細(xì)胞線粒體功能的影響。他們發(fā)現(xiàn)，銀和鋁納米顆粒能夠穿透細(xì)胞膜，并與精子的線粒體和頂體相連。另外一些研究表明納米顆?？梢杂绊戭?lèi)固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidgenic acute regulatory protein，STAR)的表達(dá)[21]。這種蛋白是一種傳遞蛋白，調(diào)節(jié)膽固醇轉(zhuǎn)移到線粒體膜內(nèi)，并促進(jìn)類(lèi)固醇激素的產(chǎn)生[22]。因此猜測(cè)銀納米粒子可能通過(guò)減少STAR 表達(dá)，阻止膽固醇轉(zhuǎn)移到線粒體膜內(nèi)，最終阻止膽固醇向孕烯醇酮的轉(zhuǎn)化，從而降低睪酮水平，進(jìn)而影響精子活力。

總之，AgNPs 誘導(dǎo)的精子活力降低和精子形態(tài)異常與ROS 的產(chǎn)生增加和線粒體損傷密切相關(guān)，表明維持正常生理水平的ROS 對(duì)精子功能和受精至關(guān)重要。因此，抗氧化劑是維持男性生殖道細(xì)胞氧化還原動(dòng)態(tài)平衡的必需品，在受精中起著關(guān)鍵作用。病理?xiàng)l件下，過(guò)量活性氧引起的男性不育可通過(guò)內(nèi)源性和外源性抗氧化劑改善[23]。

1.2 納米銀對(duì)睪丸/附睪的毒性效應(yīng)

Thomas 等[24]對(duì)小鼠進(jìn)行亞急性靜脈注射Ag-NPs 1 mg/kg，在首次注射后15、60、120 d 對(duì)血液、睪丸、精子進(jìn)行觀察研究發(fā)現(xiàn)睪丸重量和精子濃度未顯著降低，但AgNPs 暴露導(dǎo)致睪丸間質(zhì)細(xì)胞改變和睪丸激素增加。由于睪丸激素可以獨(dú)立于促性腺激素釋放激素抑制精原細(xì)胞分化，故該研究強(qiáng)調(diào)長(zhǎng)期暴露于AgNPs 對(duì)男性生育能力產(chǎn)生負(fù)面影響的可能性。相似的將雄性ICR(institute of cancer research)小鼠每天以0.5 或1 mg/kg 的劑量靜脈注射平均粒徑為20 nm 的AgNPs 4 周。兩種劑量的雄性小鼠均可觀察到明顯的睪丸損傷，包括生精上皮高度降低、曲細(xì)精管萎縮、精母細(xì)胞死亡，導(dǎo)致精細(xì)胞缺失、生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)生物標(biāo)志物基因表達(dá)下調(diào)。這些基因的表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致雄性小鼠精母細(xì)胞發(fā)育障礙，從而對(duì)生殖產(chǎn)生影響[25]。類(lèi)似地，研究人員對(duì)Wistar 大鼠注射單次劑量的AgNPs，發(fā)現(xiàn)AgNPs 注射可增加生殖細(xì)胞DNA 損傷水平，并且與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠附睪精子計(jì)數(shù)呈大小依賴(lài)性(20 和200 nm)、劑量依賴(lài)性(5 和10 mg/kg)和時(shí)間依賴(lài)性(24 h、7 d和28 d)。200 nm AgNPs 處理組(AgNPs 組)在注射AgNPs 28 d 后，睪丸形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，如生精小管直徑、面積和周長(zhǎng)增加。這一觀察結(jié)果表明，200 nm AgNPs 的積累可能導(dǎo)致上皮形態(tài)的變化和小管的“腫脹”。這種現(xiàn)象顯然與NPs 的大小有關(guān)，因?yàn)橹辉?00 nm AgNPs 暴露組中觀察到這種現(xiàn)象，而在20 nm AgNPs 暴露組中沒(méi)有觀察到這種現(xiàn)象。在作者對(duì)NT2 細(xì)胞的體外研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)200 nm 的AgNPs 具有更強(qiáng)的遺傳毒性[19]。然而經(jīng)過(guò)90 d 長(zhǎng)期納米銀灌胃后Thakur等[26]發(fā)現(xiàn)AgNPs 可導(dǎo)致睪丸結(jié)構(gòu)受損，如生精細(xì)胞壞死、生殖細(xì)胞枯竭等，并且AgNPs 對(duì)睪丸的不利影響隨時(shí)間的推移逐漸增加，呈時(shí)間依賴(lài)性。Fathi 等[27]發(fā)表類(lèi)似的結(jié)果，其研究表明腹腔注射AgNPs(125 mg/kg)導(dǎo)致生精小管直徑、面積和周長(zhǎng)顯著減少。然而，Miresmaeili 等[12]發(fā)現(xiàn)，在48 d 后，每天口服劑量為25～200 mg/kg 的AgNPs的動(dòng)物的生精小管直徑?jīng)]有顯著變化。這些差異可能是由于不同的給藥途徑、不同的療程和Ag-NPs 包被等因素有關(guān)。

總之，研究表明納米銀對(duì)精子具有毒性效應(yīng)，并且能夠通過(guò)不同的途徑來(lái)影響精子的正常表達(dá)，例如增加ROS 的產(chǎn)生可以導(dǎo)致精子畸形以及精子存活率下降等現(xiàn)象，從而對(duì)精子產(chǎn)生有害效應(yīng)。因此，在精子成熟這一特殊的時(shí)期，應(yīng)注意避免處于AgNPs 等精子敏感物暴露的環(huán)境中。此外，納米銀暴露能夠?qū)е虏G丸結(jié)構(gòu)受損，從而對(duì)生殖產(chǎn)生影響，并且存在時(shí)間、大小、劑量依賴(lài)性。

2 納米銀誘發(fā)雌鼠生殖發(fā)育的毒性效應(yīng)

2.1 納米銀對(duì)卵細(xì)胞及胎盤(pán)的毒性效應(yīng)

胎兒大多數(shù)器官的發(fā)育依賴(lài)于嚴(yán)格的激素調(diào)節(jié)控制，以維持胎兒出生后的正常的發(fā)育和生理功能。因此，懷孕期間母體激素平衡的破壞可能會(huì)對(duì)胎兒和出生后的發(fā)育產(chǎn)生不利的影響[28]。遺憾的是對(duì)孕期母體暴露于納米材料后，關(guān)于對(duì)母體的激素平衡和干擾的研究很少。另外，研究發(fā)現(xiàn)母體注射AgNPs 會(huì)延遲后代的身體發(fā)育并損害其認(rèn)知行為。經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)在雌鼠妊娠早期給藥后，能夠在卵黃囊中鑒定出AgNPs。在雌鼠妊娠后期注射AgNPs 后，能夠在胎盤(pán)，母乳以及出生前后的子代中檢測(cè)到放射性標(biāo)記的AgNPs。

例如在關(guān)于對(duì)雌性小鼠卵巢和發(fā)育中卵泡的影響的研究中，他們發(fā)現(xiàn)AgNPs 暴露4 w 后小鼠卵巢中的卵泡數(shù)量以時(shí)間依賴(lài)的方式顯著減少，且呈劑量依賴(lài)性。AgNPs 處理引起FOXO3a、Stella 和Figla mRNA 和蛋白表達(dá)的時(shí)間依賴(lài)性降低，這幾種蛋白是原始卵泡發(fā)育的關(guān)鍵因素。此外，對(duì)照組卵巢在包括顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞在內(nèi)的幾個(gè)卵泡中顯示出明顯的Lhx8(LIM homeobox 8)陽(yáng)性信號(hào)，而在AgNPs 處理的卵巢中顯著下調(diào)。此外流式分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，AgNPs 處理組誘導(dǎo)了明顯的細(xì)胞凋亡，表明AgNPs 處理的小鼠卵巢閉鎖可能是由于顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞的損傷所致。但TUNEL 分析結(jié)果表明，AgNPs 處理引起顆粒細(xì)胞凋亡，而對(duì)膜細(xì)胞的影響較小。為了支持這一數(shù)據(jù)，作者檢測(cè)了類(lèi)固醇生成相關(guān)基因如Star、Cyp11a1、CYP17A1 的mRNA 水平發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，卵巢甾體合成所必需的Cyp11a1 和CYP19A1 的表達(dá)明顯下調(diào)。但在對(duì)照組和處理組的卵泡中，Star 的表達(dá)沒(méi)有顯著差異。為支持卵巢細(xì)胞凋亡的數(shù)據(jù)，作者另外檢測(cè)了Fig1a、Nobox、Lhx8 和FOXO3a 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AgNP 處理15 d 后，F(xiàn)igla、Nobox、Lhx8 和FOXO3a 的表達(dá)顯著下調(diào)。這些結(jié)果可為AgNPs 引起的早期卵泡死亡提供證據(jù)。研究表明Nobox 及Lhx8 的下調(diào)和發(fā)育中的卵泡缺失可能是由于類(lèi)固醇生成相關(guān)基因的表達(dá)中斷[25]。

Huang 等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，在卵母細(xì)胞階段暴露于AgNPs 不僅對(duì)卵母細(xì)胞成熟產(chǎn)生負(fù)面影響，還會(huì)對(duì)體外受精和隨后的胚胎發(fā)育產(chǎn)生有害影響。其數(shù)據(jù)表明，AgNPs 在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM）中顯著誘導(dǎo)胚胎細(xì)胞死亡，而在滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞（Trophectoderm，TE）中則誘導(dǎo)程度較小，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)植入胚胎減少和植入后發(fā)育受損。在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，AgNPs 處理后ICM 細(xì)胞數(shù)量減少是抑制胚胎發(fā)育的主要因素，而AgNPs 誘導(dǎo)的TE 細(xì)胞數(shù)量減少是次要因素。因此，AgNPs顯然起損傷誘導(dǎo)劑的作用，對(duì)卵母細(xì)胞的成熟和隨后的受精以及植入前和植入后的發(fā)育產(chǎn)生不利影響。該研究結(jié)果表明，AgNPs 預(yù)處理會(huì)觸發(fā)大量ROS 的產(chǎn)生，導(dǎo)致DNA 損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)p53 和p21 蛋白，促進(jìn)caspase 依賴(lài)的凋亡過(guò)程，并在卵母細(xì)胞發(fā)育的有害影響中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

胎盤(pán)是胎兒和母體血液之間進(jìn)行物質(zhì)交換的重要器官，是胎兒營(yíng)養(yǎng)的主要來(lái)源。而印記基因在胎盤(pán)分化、生長(zhǎng)和功能中起重要作用。從已發(fā)現(xiàn)的印記基因來(lái)看，父方對(duì)胚胎的貢獻(xiàn)通常是加速其發(fā)育，而母方則是限制胚胎發(fā)育速度。

對(duì)于納米銀在胎盤(pán)方面的影響，Zhang 等[30]發(fā)現(xiàn)AgNPs 干擾了胎盤(pán)組織的第一次減數(shù)分裂進(jìn)程和印記基因的表達(dá)。AgNPs 處理組胎盤(pán)中印記基因Zac1 甲基化水平明顯降低，印記基因Igf2r平均甲基化水平略有升高。Zac1 和Igf2r 基因是兩個(gè)重要的印記基因，參與控制胚胎的生長(zhǎng)。胎盤(pán)基因表達(dá)的這些變化可以潛在地解釋為什么在妊娠晚期觀察到的胎兒生長(zhǎng)加速。這主要是由于母系表達(dá)的印記基因上調(diào)誘導(dǎo)原始生殖細(xì)胞提前停止增殖，進(jìn)入減數(shù)分裂前期。

2.2 納米銀對(duì)胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)

大量研究證明AgNPs 和Ag+在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中具有毒性作用，且具有劑量依賴(lài)性效應(yīng)[31]。觀察到的毒性反應(yīng)包括死亡率升高、孵化延遲、身體畸形和心率下降等。已有研究證明表面電荷和離子溶解是影響AgNPs 暴露結(jié)果的關(guān)鍵因素[32]，也有研究發(fā)現(xiàn)納米粒子的大小是影響AgNPs 對(duì)斑馬魚(yú)胚胎毒性作用的重要因素[33]。由于以斑馬魚(yú)作為研究對(duì)象不能很好的模擬人體情況，因此主要關(guān)注以嚙齒動(dòng)物例如小鼠/大鼠作為研究對(duì)象的相關(guān)研究。如Fennell 等[34]對(duì)大鼠進(jìn)行納米銀暴露后發(fā)現(xiàn)在胎盤(pán)和胎兒中均檢測(cè)到銀，銀會(huì)穿過(guò)胎盤(pán)并轉(zhuǎn)移到胎兒體內(nèi)。在20 nmAgNPs 暴露的母體中，納米銀在胎盤(pán)中的銀濃度比在肝臟中高出2～3 倍，而在AgAc（醋酸銀）暴露下，這一比例是肝臟的2～3 倍。相反，在110 nm AgNPs 的實(shí)驗(yàn)組中，胎盤(pán)中的銀濃度是肝臟的一半。這些結(jié)果表明，與其他器官相比，納米顆粒的大小對(duì)納米銀在胎盤(pán)中的滯留起關(guān)鍵作用。

總體而言，AgNPs 不僅能夠在母體中積聚，引起氧化應(yīng)激，還能夠在小鼠/大鼠胚胎發(fā)育期間引起毒性反應(yīng)，抑制胚胎發(fā)育，對(duì)子代產(chǎn)生影響，其主要通過(guò)誘導(dǎo)ROS 的大量產(chǎn)生，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞的凋亡機(jī)制。

3 納米銀生殖發(fā)育毒性的作用機(jī)理

目前，活性氧（ROS）導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，是納米材料毒性的主要致病因子，這些因素可能與生殖和發(fā)育毒性有關(guān)。無(wú)論暴露途徑如何，已證實(shí)在納米銀暴露會(huì)誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥[11]。人們已經(jīng)注意到許多毒物（包括納米材料）會(huì)觸發(fā)睪丸和附睪中的ROS 產(chǎn)生，導(dǎo)致精子活力和運(yùn)動(dòng)性降低，并增加男性因素不育。這些研究結(jié)果表明，納米粒子的生殖和發(fā)育毒性的近端因果因素是ROS 的產(chǎn)生增加。AgNPs 和Ag 離子均增加細(xì)胞內(nèi)ROS 水平并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，這被認(rèn)為是細(xì)胞毒性的重要介質(zhì)[35]。增加的ROS 產(chǎn)生，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥，可能是AgNPs 的生殖和發(fā)育毒性的原因見(jiàn)圖1。

AgNPs 的毒性可能隨AgNPs 溶出的速度和程度而變化，這取決于粒徑，表面修飾、濃度和溫度等。例如，較小尺寸的AgNPs（22 和42 nm）很容易從胃腸道吸收，通過(guò)血睪屏障，導(dǎo)致睪丸中Ag 的高度分布。較小的納米銀可能比較大粒徑的納米銀誘發(fā)更強(qiáng)的生殖和發(fā)育毒性。因此，Ag-NPs 誘發(fā)的嚙齒動(dòng)物生殖發(fā)育毒性的關(guān)鍵問(wèn)題，是明確AgNPs 誘導(dǎo)的毒性和AgNP 釋放的Ag 離子誘導(dǎo)的毒性。最近的研究結(jié)果仍然是不確定的，存在著很大的爭(zhēng)議。一些研究表明，發(fā)現(xiàn)溶液中存在的Ag+的量與納米銀懸浮液的毒性之間存在關(guān)聯(lián)。AgNPs 引起的毒性被認(rèn)為是AgNPs 釋放Ag 離子的結(jié)果[36]。也有研究表明，Ag 可能會(huì)從納米銀粒子中溶解，通過(guò)胎盤(pán)，胃腸道和血睪屏障轉(zhuǎn)移到靶器官，誘發(fā)毒性。AgNPs 的毒性效應(yīng)與單獨(dú)的Ag+不同，并且取決于粒子的尺寸和表面涂層，表明AgNPs 效應(yīng)不僅僅是由于Ag 離子的釋放[37]。AgNPs 被認(rèn)為是離子形式的生物可利用性和粒子本身。然而，一些研究也表明AgNP 誘導(dǎo)的毒性是AgNPs 粒子的內(nèi)在作用，其獨(dú)立于游離Ag+，并且AgNP 作用機(jī)制可能與Ag+不同。

Ag-NPs 可通過(guò)保護(hù)生殖組織的血-睪丸屏障、胎盤(pán)屏障和上皮屏障，在生殖器官中蓄積。Ag-NPs 的積累通過(guò)破壞間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞而損害器官（附睪、睪丸、子宮和卵巢），引起生殖器官功能障礙，從而對(duì)精子的形態(tài)、質(zhì)量、數(shù)量和活動(dòng)力產(chǎn)生不利影響，或減少成熟卵母細(xì)胞的數(shù)量，擾亂初級(jí)和次級(jí)卵泡發(fā)育。銀納米粒子可以擾亂分泌激素的水平，引起性行為的改變。此外，母體注射AgNPs 會(huì)延遲后代的體格發(fā)育和認(rèn)知行為受損。離子形式的銀，也可能是納米銀粒子本身，被認(rèn)為是生物可利用的。然而，目前納米銀誘發(fā)的生殖發(fā)育毒性研究仍然主要集中于毒理學(xué)現(xiàn)象。納米銀對(duì)生殖系統(tǒng)毒性的分子機(jī)制尚不完全清楚，但可能的作用機(jī)制包括氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡和遺傳毒性如圖1。

圖1 納米銀誘發(fā)嚙齒動(dòng)物生殖發(fā)育毒性的可能作用機(jī)理

4 展望

作為廣泛使用的納米材料，納米銀可在不同環(huán)境下通過(guò)不同途徑進(jìn)入人體或生物體，并在體內(nèi)肺、腎、腦等器官蓄積，或穿過(guò)胎盤(pán)屏障、血睪屏障等對(duì)生殖或下一代生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響。其損傷主要通過(guò)ROS 氧化應(yīng)激失衡，通過(guò)caspase 通路引起細(xì)胞凋亡損傷?？偟膩?lái)說(shuō)，現(xiàn)有數(shù)據(jù)提供了有關(guān)Ag-NPs 在哺乳動(dòng)物中潛在的生殖和發(fā)育毒性的初步信息，數(shù)據(jù)仍然非常有限。為了估計(jì)AgNPs 對(duì)生殖和發(fā)育毒性的總體不利劑量和大小，需要進(jìn)一步研究以填補(bǔ)數(shù)據(jù)空白并確認(rèn)研究結(jié)果的可重復(fù)性。在一些研究中，報(bào)告的顯著影響可能是由于使用與環(huán)境暴露無(wú)關(guān)的劑量。在發(fā)育毒性研究中，也誘發(fā)了母體毒性。應(yīng)在子母體毒性劑量下檢查發(fā)育效應(yīng)，以闡明胚胎和胎兒的改變（包括形態(tài)和功能改變，死亡和生長(zhǎng)受限）是胚胎/胎兒的直接影響，或是間接（母體介導(dǎo)）效應(yīng)的結(jié)果，以及還是兩者的結(jié)合。根據(jù)國(guó)際公認(rèn)的經(jīng)濟(jì)合作組織測(cè)試指南和符合良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范原則的納米毒理學(xué)研究規(guī)范，目前被認(rèn)為是最先進(jìn)和最可靠性的方法體系。

5 小結(jié)

在本綜述中，只有三項(xiàng)是根據(jù)經(jīng)濟(jì)合作組織的GLP 指南進(jìn)行的研究，可用于評(píng)價(jià)AgNPs 的生殖和發(fā)育毒性，很少有研究是使用最先進(jìn)的方法來(lái)鑒定納米粒子的生殖發(fā)育毒性。這些篩選試驗(yàn)使用劑量組中相對(duì)少量的動(dòng)物進(jìn)行，并且由于暴露時(shí)間的限制和毒性終點(diǎn)的選擇性，并沒(méi)有提供關(guān)于納米銀生殖和發(fā)育的所有方面的完整信息。對(duì)納米銀誘發(fā)的生殖發(fā)育毒性研究，應(yīng)該涵蓋至少一代的整個(gè)生殖周期的兩代研究，才足以評(píng)估納米材料的生殖和發(fā)育毒性?？傊?，為了進(jìn)一步評(píng)估納米銀的生殖和發(fā)育毒性，應(yīng)根據(jù)人體暴露的特征，設(shè)計(jì)更具體和可靠的生殖發(fā)育毒性研究方案，以及與人類(lèi)暴露相關(guān)的給藥途徑和劑量。以闡明低水平暴露于AgNPs 后對(duì)哺乳動(dòng)物的生殖和發(fā)育毒性作用機(jī)理。