四種柑橘果皮主要活性物質(zhì)測定和抗氧化能力對比研究

蔣變玲，王志花，張東京，袁維風(fēng)，陳 瓊*

（1.宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州234000；2 合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥230009）

柑橘是世界最豐富的農(nóng)作物之一[1]，也是世界上第一大水果，其果實(shí)具有重要的營養(yǎng)、保健和醫(yī)學(xué)價(jià)值[2]。中國作為柑橘類水果的主要原產(chǎn)地之一，有著將近5 000 年的栽種歷史，柑橘資源豐富且優(yōu)良品種眾多[3]。2019 年世界柑橘總產(chǎn)量約為9 400 萬噸[1,4]，而柑橘皮占柑橘的40%～50%，產(chǎn)生千萬噸的果皮被當(dāng)做農(nóng)工業(yè)廢物而浪費(fèi)掉并產(chǎn)生環(huán)境問題[1]，然而柑橘果皮是很有價(jià)值的工業(yè)副產(chǎn)品，可用于食品、醫(yī)藥和化妝品[5]。在食品行業(yè)中，橘皮提取物作為天然抗氧化劑防止油脂的酸敗受到越來越多的關(guān)注[6]。并且傳統(tǒng)中藥中，柑橘皮可入藥，具有促進(jìn)消化[7]、止咳、消炎和抑菌等功效[2]。

柑橘果皮中的多酚類化合物和黃酮類物質(zhì)含量高[1]，作為植物中生物活性物質(zhì)分為酚類和萜類化合物同樣在柑橘果實(shí)豐富[2]。柑橘皮黃酮可增加血清抗脂質(zhì)過氧化和降低衰老氧化應(yīng)激反應(yīng)；也可作為化療藥物的補(bǔ)充劑、糖尿病保健食品和神經(jīng)保護(hù)藥物使用[8]。柑橘果皮多酚，可有效地防治由自由基介導(dǎo)的疾病如癌癥、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、衰老、心血管功能障礙等[6]，還具有廣泛的生物活性包括抗菌、抗病毒、抗過敏、抗血栓、消炎和舒張血管，某些多酚具有神經(jīng)保護(hù)、抗幽門螺旋桿菌的作用[8]。實(shí)驗(yàn)證明，三萜類具有消炎、抗?jié)儭⒖咕?、護(hù)肝、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、降膽固醇、抗動(dòng)脈粥樣硬化、促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)、抗凝血以及抗癌活性[9]，且在治療某些癌癥、炎癥或真菌感染等方面可作為有前景的多靶向試劑[10]；天然富含三萜的資源，特別是源自食用和藥用植物，是許多研究的熱點(diǎn)，其中果皮中的三萜是受到較多關(guān)注[11]。目前關(guān)于柑橘果皮中天然化學(xué)產(chǎn)物的研究多集中在多酚和黃酮[5,8,12]，亦有柑橘果蠟三萜的報(bào)道[9]，然而關(guān)于果皮三萜的文獻(xiàn)較少。

選取常見市售柑橘：砂糖橘、臍橙、蘆柑、蜜桔四種柑橘（成熟度大小均一）為研究對象，對柑橘果皮中總多酚、總黃酮及總?cè)坪窟M(jìn)行分析，通過DPPH·、ABTS·+、羥自由基清除體外抗氧化法，對該四種柑橘果皮的抗氧化活性進(jìn)行評價(jià)，同時(shí)對柑橘的活性成分及抗氧化能力進(jìn)行相關(guān)性分析，為柑橘皮的加工利用和后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

砂糖橘、臍橙、蘆柑、蜜桔購于宿州市家樂福超市；甲醇、乙醇、冰醋酸分析純，無錫市亞太聯(lián)合化工有限公司；氫氧化鈉、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、硫酸亞鐵、水楊酸、Vc 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；高氯酸分析純，天津康科德科技有限公司；過氧化氫分析純，東莞市澤豐化工實(shí)業(yè)有限公司；福林酚，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；蘆?。ā?8%）、熊果酸（≥98%）、沒食子酸（99%）、香草醛（99%），庫爾化學(xué)科技（北京）有限公司；ABTS（2,2-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽，≥98%），合肥巴斯夫生物科技有限公司；DPPH（2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基，≥98%），上海源葉生物科技有限公司。

722N 紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；FA-N 精密電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；KQ5200DE 超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；SUS 304 干燥粉碎機(jī)（常州市益民干燥設(shè)備有限公司）；DHG-9030A 電熱恒溫干燥箱（上海恒一儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

柑橘皮粉末樣品的制備:剝橘皮并于50 ℃烘箱中烘24 h 至干燥，粉碎過60 目篩，稱取1.00 g樣品，按料液比為1∶30 (g/mL) 的80%甲醇[13]在40 ℃下超聲波浸提30 min，抽濾，所得濾渣重復(fù)提取兩次，將3 次所得濾液合并，用80%甲醇溶劑定容到250 mL。

1.2.2 總多酚含量測定

采用Folin-Ciocalteu 比色法[14]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再進(jìn)行測量。

準(zhǔn)確稱取0.100 g 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，75%乙醇溶解并定容至100 mL，取1 mL 用75%的乙醇定容至50 mL，得到質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL 的母液備用。取6 支10 mL 比色管，加入母液，體積分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，再加入蒸餾水補(bǔ)足3 mL，各加入福林酚試劑1 mL 10%Na2CO3溶液6 mL，75%的乙醇定容至10 mL，30 ℃水浴鍋中反應(yīng)1 h，在750 nm 處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制并測得其標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=103.14x+0.008 1，R2=0.998 1。

總多酚含量測定：分別取四種柑橘果皮甲醇提取液0.5 mL 于10 mL 具塞試管中，按以上加液方法定容后測吸光度，按如下公式計(jì)算，結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量表示，即mg GAE/g。

式（1）中：X 為測出的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/g；n 為稀釋倍數(shù)；V1為樣液總體積，mL；V 為測定時(shí)取樣體積，mL；W 為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 總黃酮含量測定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法[15]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再進(jìn)行測量。

準(zhǔn)確稱量0.010 g 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，75%乙醇溶液溶解稀釋并定容至100 mL，取1 mL 用75%乙醇定容至50 mL，得到質(zhì)量濃度為0.002 mg/mL 的母液備用。取6 支10 mL 比色管，加入母液，體積分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，用75%乙醇補(bǔ)充至5 mL，混勻后，各加入0.3 mL 體積分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2，混合均勻后靜置5 min，加入0.3 mL 體積分?jǐn)?shù)為10%的Al(NO3)3，混勻后靜置6 min 后加入4 mL 1 mol/L 的NaOH 溶液，再加入75%的乙醇定容至10 mL，混勻后靜置10 min。在510 nm 處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測得總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

總黃酮含量測定：分別取四種柑橘果皮甲醇提取液5 mL 于10 mL 具塞試管中，按上述方法定容后測吸光度，按公式（1）計(jì)算，結(jié)果以蘆丁當(dāng)量表示，即mg RE/g。

1.2.4 總?cè)坪繙y定

采用香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色法[16]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再進(jìn)行測量。

準(zhǔn)確稱取0.005 0 g 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL 容量瓶中，加75%乙醇溶解并定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL 母液。取6 支5 mL 比色管，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 母液，加熱蒸干后加入0.8 mL 高氯酸、0.2 mL 的5%香草醛冰醋酸溶液，放在60 ℃水浴鍋中反應(yīng)15 min后，冷卻至室溫，再加入冰醋酸定容至5 mL，在548 nm 處測定吸光度。以吸光度為縱坐、熊果酸質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所測得總?cè)茦?biāo)準(zhǔn)曲線為：

三萜含量測定：分別取四種柑橘果皮甲醇提取液5 mL 于10 mL 具塞試管中，按上述方法定容后測吸光度，按公式（1）計(jì)算，結(jié)果以熊果酸當(dāng)量表示，即mg UAE/g。

1.2.5 ABTS 自由基清除能力測定

ABTS 自由基清除能力測定[17]。ABTS 溶液的制備：精確稱取0.038 4 g ABTS 于10 mL 容量瓶中，用蒸餾水溶解稀釋定容至刻度，將ABTS 配置成7 mmol/L 的準(zhǔn)備液，精確稱量0.013 4 g 過硫酸鉀于10 mL 容量瓶中，用蒸餾水溶解稀釋定容至刻度，使過硫酸鉀的濃度為2.5 mmol/L，各取0.2 mL ABTS 溶液與過硫酸鉀溶液混合，之后將該溶液在室溫下置于暗處12 h 備用。用80%甲醇將ABTS 自由基溶液稀釋，使其在734 nm 下測得的的吸光值為0.70±0.02。

ABTS.+清除率測定：

A0測定：準(zhǔn)確取2 mL 80%甲醇+3 mL ABTS供試品混合均勻，在734 nm 處測定吸光度值。

A1測定：準(zhǔn)確取2 mL 樣品（標(biāo)品）+ 3 mL 80%甲醇混合均勻，在734 nm 處測定吸光度值。

A2測定：準(zhǔn)確取2 mL 樣品（標(biāo)品）+ 3 mL ABTS 供試品混合于暗處放置30 min 后，在734 nm 處測定吸光度值。

式中：A0為不加樣品的標(biāo)準(zhǔn)體系吸光度；A1為不含H2O2的標(biāo)準(zhǔn)體系吸光度；A2為加入樣品提取物的標(biāo)準(zhǔn)體系吸光度。

ABTS 自由基清除能力標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及樣品測定：準(zhǔn)確稱取0.100 0 g Vc 標(biāo)準(zhǔn)品，用80%甲醇溶解并定容至100 mL，取1 mL 用80%甲醇定容至25 mL，得到質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL 的母液備用。取6 支10 mL 具塞試管，加入母液，體積分別為1.25、2.50、3.75、5.00、6.25 mL，加蒸餾水定容至刻度，按上述步驟測定吸光值，按清除率公式算出相應(yīng)濃度的清除率。以Vc 質(zhì)量濃度（ug/mL）為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算樣品ABTS 自由基清除能力，結(jié)果以mg Vc eq./g (DW 干重)表示。所測ABTS 自由基清除能力標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2.567 7x+0.307 6，R2=996 3。

1.2.6 清除羥自由基能力測定

清除羥自由基能力測定[18]。羥自由基清除率的測定：標(biāo)準(zhǔn)體系中含有6.0 mmol/L H2O22.0 mL，6.0 mmol/L FeSO42.0 mL，6.0 mmol/L 水楊酸2.0 mL，分別加入樣液2.0 mL。最后加入H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃反應(yīng)0.5 h。以甲醇作參比，在510 nm 下測吸光度A2。

羥自由基清除能力標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品測定：準(zhǔn)確稱取0.100 g Vc 標(biāo)準(zhǔn)品，用80%甲醇溶解并定容至100 m L，取1 mL 用80%甲醇定容至25 mL，得到質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL 的母液備用。取6 支10 mL 具塞試管，加入母液，體積分別為1.25、2.50、3.75、5.00、6.25 mL，加蒸餾水定容至刻度，得一定濃度梯度Vc 標(biāo)品，按清除羥自由基測定的步驟得相應(yīng)濃度下的吸光值，按清除率公式算出相應(yīng)濃度的清除率。以Vc 質(zhì)量濃度（ug/mL）為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算樣品羥自由基清除能力，結(jié)果以mg Vc eq./g 表示。羥自由基清除能力標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.103 8x+2.5695，R2=0.990 7。

1.2.7 DPPH 自由基清除能力測定

DPPH 自由基清除能力測定[15]。DPPH 溶液的制備：精密稱取0.007 80 g DPPH 標(biāo)準(zhǔn)品,用無水乙醇溶解，定容至100 mL，配制成濃度為0.2 mmol/L 儲備液，于4 ℃下保存，備用。

A0 測定：準(zhǔn)確取2 mL80%甲醇+3 mL DPPH供試品混合均勻，在517 nm 處測定吸光度值。

A1 測定：準(zhǔn)確取2 mL 樣品（標(biāo)品）+3 mL80%甲醇混合均勻，在517 nm 處測定吸光度值。

A2 測定：準(zhǔn)確取2 mL 樣品（標(biāo)品）+3 mL DPPH 供試品混合于暗處放置30 min 后，在517 nm 處測定吸光度值。

DPPH 自由基清除能力標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品測定：準(zhǔn)確稱取0.100 0 g Vc 標(biāo)準(zhǔn)品，用80%甲醇溶解并定容至100 mL，取1 mL 用80%甲醇定容至25 mL，得到質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL 的母液備用。取6 支10 mL 具塞試管，加入母液，體積分別為1.25、2.50、3.75、5.00、6.25 mL，加蒸餾水定容至刻度，得濃度梯度的Vc 標(biāo)品，按清除DPPH.-測定的步驟得相應(yīng)濃度下的吸光值，按清除率公式算出相應(yīng)濃度的清除率。以Vc 質(zhì)量濃度（ug/mL）為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制并測得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3.080 6 x+2.333 8，R2=0.994 8。

1.2.8 TOPSIS 綜合評價(jià)柑橘果皮抗氧化能力

逼近于理想值的排序方法(technique for order preference by similarity to ideal solution，TOPSIS)數(shù)學(xué)模型綜合評價(jià)柑橘果皮抗氧化能力[19]。本文采用TOPSIS 法對柑橘果皮的抗氧化能力（清除DPPH·-、ABTS·+、羥基自由基能力）進(jìn)行綜合評定，步驟如下。

（?。┙Q策矩陣

式中：xij是第i 中柑橘果皮的第j 個(gè)抗氧化指標(biāo)；m為柑橘果皮種數(shù)4，n 為抗氧化指標(biāo)種數(shù)3。

（ⅱ） 歸一化決策矩陣

對決策矩陣進(jìn)行歸一化處理以消除不同指標(biāo)量綱的影響。歸一化后的矩陣為

式中：Rj代表逼近度，Rj∈[0,1]。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果表示為Mean±SD，采用SPSS 22.0 進(jìn)行相關(guān)性和差異性分析（P＜0.05，P＜0.01 分別為差異顯著和差異極顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種柑橘果皮中活性物質(zhì)含量

所測柑橘總多酚含量為16.61～40.64 mg GAE/g，其中蘆柑＞蜜桔＞砂糖橘＞臍橙，蘆柑、蜜桔和砂糖橘之間差異顯著，砂糖橘和臍橙無顯著差異。張東峰等人測定7 中柑橘果肉果皮中多酚含量，發(fā)現(xiàn)果皮中含量高于果肉，為24.77～47.48 mg GAE/g，與本文相近[13]。所測柑橘皮總多酚比Agarwal 等[20]所測得檸檬皮中含量高，見表1。

所測柑橘總黃酮含量為145.6～193.5 mg RE/g，其中蘆柑＞蜜桔＞砂糖橘＞臍橙，差異顯著。Wang 等測定了8 種柑橘果皮的總黃酮含量，為32.7～49.2 mg RE/g，比 本 文 所 測 黃 酮 稍 低[21]。Zhang 等[12]測定了國產(chǎn)19 種不同柑橘的果皮、果肉、種子、果汁中的總多酚和總黃酮含量，果皮中這兩種物質(zhì)含量最多，果皮中的總黃酮含量較本文低36%～88%，多酚含量比本文低19%～44%。

所測柑橘總?cè)坪繛?.46～10.83 mg RE/g，其中蘆柑＞蜜桔＞砂糖橘＞臍橙，蘆柑、蜜桔和臍橙之間差異顯著，砂糖橘和蜜桔無顯著差異。目前柑橘中的的三萜類化合物較少受到關(guān)注。Kou等[19]測定的鮮棗果的三萜為7.52～16.57 mg UAE/g與本文較為接近。

蘆柑橘皮中總多酚、總黃酮和總?cè)坪吭谒鶞y柑橘果皮中最高，蜜桔次之。

表1 四種柑橘果皮中總多酚、總黃酮、總?cè)坪?/p>

2.2 四種柑橘果皮抗氧化能力比較

本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過DPPH·、ABTS·+、清除羥自由基的能力這3 種抗氧化測定方法研究了4 種品種柑橘果皮的抗氧化活性。不同柑橘果皮抗氧化能力比較結(jié)果見圖1圖中不同小寫字母代表差異顯著（P＜0.05）。

圖1 四種柑橘果皮抗氧化能力比較

由圖1 可知，不同柑果橘皮中的抗氧化活性具有顯著性差異（P＜0.05）。四種柑橘皮的DPPH·抗氧化活性介于5.025～7.498 mg Vc eq./g，其中抗氧化活性最強(qiáng)的是蘆柑果皮，其次分別為：蜜桔皮、沙糖桔皮、臍橙皮。ABTS·+的抗氧化活性介于6.40～7.98 mg Vc eq./g，其中抗氧化活性最強(qiáng)的是蘆柑皮，其余由高到低依次是：蜜桔皮＞砂糖橘皮＞臍橙皮，與DPPH·抗氧化活性呈相同的趨勢。清除羥自由基的抗氧化活性在6.78～11.32 mg Vc eq./g 之間，抗氧化活性最強(qiáng)的仍然是蘆柑皮，其次依次為臍橙皮、蜜桔皮、砂糖橘皮；4 種柑橘中抗氧化活性最強(qiáng)的為蘆柑皮。

2.3 橘皮抗氧化能力綜合排序

TOPSIS 法綜合評定可知，抗氧化能力強(qiáng)弱順序?yàn)樘J柑皮＞蜜桔皮＞臍橙皮＞砂糖橘皮，見表2。

表2 TOPSIS 法抗氧化能力綜合排序

2.4 相關(guān)性分析

由表3 可知，3 種抗氧化活性能力測定方法中，柑橘皮的抗氧化能力（清除DPPH·、ABTS·+和羥自由基的能力）與多酚含量（r=0.958；r=0.919；r=0.735，P＜0.01）、及黃酮含量顯著相關(guān)（r=0.893；r=0.873；r=0.702，P＜0.01）。不同水果中三萜和抗氧化能力呈現(xiàn)不同的相關(guān)性：Kou[19]等測得棗果中三萜和鐵離子還原能力、DPPH·清除能力不相關(guān)，和ABTS·+清除能力呈負(fù)相關(guān)；發(fā)現(xiàn)三萜含量和DPPH·、ABTS·+清除能力的相關(guān)性最弱（r=0.862；r=0.848；P＜0.01），仍顯著相關(guān)，但與羥基自由基清除能力不相關(guān)（r=0.434，P＜0.01）。由此可得，柑橘皮中的最主要抗氧化活性成分物質(zhì)是黃酮與多酚，抗氧化能力與三萜含量也顯著相關(guān)，但稍弱于多酚和黃酮。三萜和清除羥自由基無顯著相關(guān)性，說明柑橘皮中的三萜可能無清除羥自由基的作用。

表3 抗氧化活性成分與抗氧化活性斯皮爾曼相關(guān)性

3 小結(jié)

不同柑橘果皮中抗氧化活性成分含量有所不同，結(jié)果表明4 種柑橘果皮的多酚含量介于16.05～40.68 mg GAE/g 之間；黃酮含量在145.2～193.2 mg RE/g 之間，三萜含量在5.39～10.88 mg UAE/g，四種柑橘果皮中總多酚、總黃酮及總?cè)坪扛叩鸵来螢椋禾J柑皮、蜜桔皮、砂糖橘皮、臍橙皮。此外，不同品種柑橘皮的抗氧化能力差異顯著，且通過相關(guān)性分析可知，柑橘果皮中多酚和黃酮對抗氧化功能起著主要的作用，三萜對清除羥基自由基作用不顯著。