IDO表達(dá)對(duì)CD20+彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤RCHOP方案治療的預(yù)后的影響

高紅秀 鐘亞平 王 萍 王 萌 任曉艷

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(Diffuse Large B-cell Lymphoma,DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphma,NHL)中的常見(jiàn)類(lèi)型[1]，據(jù)統(tǒng)計(jì)[2]DLBCL占NHL成人患者的30%～40%。目前，DLBCL發(fā)病原因與發(fā)病機(jī)制尚不十分清晰，大多為原發(fā)性質(zhì)，也可由其他惰性淋巴瘤發(fā)展而來(lái)。DLBCL診斷后應(yīng)及早給予干預(yù)治療，若不及時(shí)采取有效措施，患者的中位生存期將少于1年。近年來(lái)研究顯示，腫瘤表達(dá)多種抗原，引起患者體內(nèi)免疫應(yīng)答，同時(shí)以腫瘤免疫耐受和免疫抑制等多種形式促進(jìn)腫瘤發(fā)展[3]。CD20作為一種非糖基化疏水磷酸跨膜蛋白，廣泛表達(dá)于B細(xì)胞成熟的多個(gè)發(fā)育階段，有95%～98%的DLBCL患者表現(xiàn)為CD20陽(yáng)性表達(dá)[4]。吲哚胺2,3-雙加氧酶(Indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)作為1種催化色氨酸代謝的限速酶，在T細(xì)胞免疫耐受誘導(dǎo)和腫瘤免疫逃逸啟動(dòng)中具有關(guān)鍵性作用，是免疫耐受重點(diǎn)環(huán)節(jié)[5]。本研究分析IDO表達(dá)對(duì)CD20+DLBCL患者RCHOP方案治療的預(yù)后的影響，旨在為DLBCL免疫治療靶點(diǎn)提供參考，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取2015年9月至2017年2月本院經(jīng)組織活檢診斷為DLBCL的60例患者臨床資料，所有患者均通過(guò)免疫組化與流式細(xì)胞免疫表型分析檢測(cè)CD20蛋白陽(yáng)性表達(dá)，其中男性36例，女性24例；年齡22～82歲，平均(61.73±17.63)歲；Hans分型：GCB型22例，非GCB型38例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期39例；B癥狀：有27例，無(wú)33例。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理診斷為CD20陽(yáng)性的DLBCL患者；②于本院至少完成3個(gè)周期的RCHOP 免疫化療者；③均為初治患者，診斷前未行任何相關(guān)治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①化療周期數(shù)少于3個(gè)周期者；②RCHOP方案間斷使用者；③復(fù)發(fā)或難治患者；④經(jīng)病理診斷有第二腫瘤者；⑤臨床資料不全者。

1.3 免疫組化檢測(cè)

1.3.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 一抗：IDO兔抗人單克隆抗體、CD20鼠抗人單克隆抗體分別購(gòu)自Abcam 公司、北京中杉金橋公司，工作濃度均為1∶100。二抗：辣根過(guò)氧化物酶(HRP)購(gòu)自丹麥Dako公司。

1.3.2 檢測(cè)方法 DLBCL組織標(biāo)本均通過(guò)4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，將石蠟組織塊行4 μm厚連續(xù)切片，于67 ℃條件下烘烤過(guò)夜，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水(100%酒精2次，90%酒精1次，80%酒精1次)；以蒸餾水清洗3次，3 min/次。 將切片浸入PH 6.0檸檬酸鹽緩沖液中，放入盛有蒸餾水的高壓鍋中，2 100 W條件下加熱至沸騰后調(diào)至1 000 W，修復(fù)3～5 min，室溫下自然冷卻，PBS液清洗 3次，3 min/次。于室溫條件下通過(guò)3%過(guò)氧化氫液孵育5～8 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。再次使用PBS液清洗3次，3 min/次。甩去PBS液，蘸去玻片組織塊周?chē)亩嘤嘁后w，使用免疫組化筆在組織塊的周?chē)?huà)圈，每一切片滴加50 μl一抗，搖勻，使一抗基本上覆蓋所有組織，置于濕盒中，4 ℃過(guò)夜。復(fù)溫3～5 min，使用PBS液清洗3次，5 min/次，甩去PBS液。每一切片滴加二抗工作液50 μl，37 ℃條件下孵育50 min，復(fù)溫3 min，PBS緩沖液沖洗3次，5 min/次。 每一切片滴加 DAB液50～100 μl，自來(lái)水充分沖洗，蘇木精復(fù)染處理1 min，以鹽酸乙醇分化10 s，通過(guò)蒸餾水返藍(lán)，封片，鏡下觀察。

1.3.3 結(jié)果判定 每張切片由2名病理科醫(yī)師雙盲法觀察，于高倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，依據(jù)細(xì)胞陽(yáng)性著色程度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)判。 IDO陽(yáng)性表達(dá)主要位于胞質(zhì)，部分位于胞核，棕黃色或棕褐色顆粒；CD20陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)。 免疫組化陽(yáng)性結(jié)果采用半定量積分綜合計(jì)量法判定[6]：著色程度：無(wú)色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比：0～10%計(jì)0分，>10%～25%計(jì)1分，>25%～50%計(jì)2分)，>50%計(jì)3分。染色分級(jí)：以著色程度以及陽(yáng)性細(xì)胞百分比乘積分級(jí)，<3分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。

1.4 治療方法

使用美羅華，劑量 375 mg/m2，靜脈滴注，每一周期第1天、第3天開(kāi)始用CHOP方案，以21天為1個(gè)周期。第1天，美羅華初始劑量100 mg加入5% GS 500 ml中，靜脈滴注，速度：15～20 滴/min，0.5～1 h若無(wú)反應(yīng)，滴速調(diào)整為30滴/min，約2 h滴完。之后將500 mg美羅華加入5% GS 500 ml中靜脈滴注，4～6 h滴完。用藥后的30 min，給予口服新癀片，2片/次；肌肉注射注苯海拉明，劑量為20 mg。用藥當(dāng)天注意監(jiān)測(cè)血壓、心率水平，1 次/h，共10次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件處理與分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和率(%)表示，組間比較使用χ2檢驗(yàn)；通過(guò)Logistic回歸分析影響CD20+DLBCL患者RCHOP方案治療預(yù)后的因素，P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IDO表達(dá)與DLBCL患者臨床病理特征的關(guān)系

非GCB型、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有B癥狀、化療效果為PD+SD的CD20+DLBCL患者IDO表達(dá)陽(yáng)性率高于GCB型、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)B癥狀、化療效果為PR+CR患者(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 IDO表達(dá)與DLBCL患者臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

2.2 不同 IDO表達(dá)患者無(wú)進(jìn)展生存與總生存分析

隨訪3年，根據(jù)研究對(duì)象的隨訪情況，繪制3年無(wú)進(jìn)展生存曲線和總生存曲線，如圖1、圖2。IDO陽(yáng)性患者1年、3年無(wú)進(jìn)展生存率分別為72.22%、36.11%，低于IDO陰性患者的91.67%、70.83%(P<0.05)；ID0陽(yáng)性患者1年、3年總生存率分別為83.33%、50.00%，低于IDO陰性患者的95.83%、79.17%(P<0.05)。

2.3 影響CD20+DLBCL患者RCHOP方案治療預(yù)后的單因素分析

非GCB型、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有B癥狀、IPI評(píng)分為3～5分、IDO陽(yáng)性的CD20+DLBCL患者隨訪3年死亡率高于GCB型、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)B癥狀、IPI評(píng)分為0～2分、IDO陰性患者(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 影響CD20+ DLBCL患者RCHOP方案治療預(yù)后的多因素分析

將上述因素差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義項(xiàng)納入多因素Logistic回歸模型，以隨訪3年生存結(jié)果作為因變量，以上述差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義項(xiàng)作為自變量，并進(jìn)行賦值：Hans分型(GCB型=0，非GCB型=1)、分期(Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1)、B癥狀(無(wú)=0，有=1)、IPI評(píng)分(0～2分=0，3～5分=1)、IDO(陰性=0，陽(yáng)性=1)，Logisitic回歸分析顯示非GCB型、Ⅲ～Ⅳ期、有B癥狀、IPI評(píng)分為3～5分、IDO陽(yáng)性是導(dǎo)致CD20+ DLBCL患者RCHOP方案治療不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表3。

圖1 3年無(wú)進(jìn)展生存分析

圖2 3年總生存分析

3 討論

DLBCL為常見(jiàn)淋巴系統(tǒng)惡性增殖性疾病，隨著免疫化療時(shí)代到來(lái)，美羅華聯(lián)合化療的RCHOP方案應(yīng)運(yùn)而生，有效改善了DLBCL患者預(yù)后，臨床價(jià)值較高[7]。隨著DLBCL發(fā)病機(jī)制研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到DLBCL患者生物學(xué)行為、臨床行為，可能與腫瘤及腫瘤微環(huán)境間的相互作用以及腫瘤細(xì)胞相關(guān)因子等有關(guān)[8]。近年來(lái)，較多學(xué)者針對(duì)DLBCL患者預(yù)后進(jìn)行研究，并提出預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)，如 Hans分型等，但臨床意義仍有一定的爭(zhēng)議。因此，尋找DLBCL預(yù)后指標(biāo)并對(duì)這一腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步分型仍是臨床面臨的重要問(wèn)題。

IDO廣泛分布于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，是一種含亞鐵血紅素的單體酶，正常組織中表達(dá)較弱，在器官移植、妊娠、炎癥、腫瘤等生理或病理狀態(tài)下，IDO表達(dá)明顯增強(qiáng)[9]。IDO及其代謝產(chǎn)物，主要在淋巴器官T 細(xì)胞區(qū)和胸腺髓質(zhì)中表達(dá)，部分分布在免疫赦免或耐受區(qū)，特異性表達(dá)于巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞上。腫瘤免疫耐受方面，IDO主要經(jīng)免疫應(yīng)答兩個(gè)環(huán)節(jié)來(lái)調(diào)控，一方面，IDO可通過(guò)降解色氨酸，耗竭局部色氨酸，呈現(xiàn)色氨酸饑餓狀態(tài)，抑制T 細(xì)胞增殖，使其停止于G1 期；另一方面，色氨酸代謝產(chǎn)物犬尿素可誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，喹啉酸可抑制 T細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖[10]。Liu DQ等[11]通過(guò)免疫組化研究證實(shí)IDO 在DLBCL患者中高表達(dá)，且IDO表達(dá)情況與RCHOP方案治療化療耐受有關(guān)。

表2 影響CD20+DLBCL患者RCHOP方案治療預(yù)后的單因素分析(例，%)

表3 影響CD20+DLBCL患者RCHOP方案治療預(yù)后的多因素分析

本研究中，以應(yīng)用RCHOP方案治療的CD20+ DLBCL患者作為研究對(duì)象，通過(guò)免疫組化技術(shù)測(cè)定IDO 在DLBCL中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)約61.67%的DLBCL患者存在IDO陽(yáng)性表達(dá)，略高于Pham KN等[12]研究結(jié)果。本研究結(jié)果顯示IDO陽(yáng)性表達(dá)在DLBCL患者中非GCB型、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有B癥狀中更為多見(jiàn)，且化療效果為PD+SD患者 IDO陽(yáng)性表達(dá)率更高，IDO高表達(dá)的患者生存時(shí)間較短，提示在治療過(guò)程中，通過(guò)聯(lián)合IDO抑制劑可能可以改善RCHOP方案治療IDO高表達(dá)的DLBCL的治療效果。多因素分析結(jié)果表明，GCB型、臨床分期、有無(wú)B癥狀、IPI評(píng)分、IDO表達(dá)均是影響DLBCL患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，IDO陽(yáng)性提示患者預(yù)后較差，可以根據(jù)IDO的高表達(dá)來(lái)預(yù)測(cè)RCHO方案治療DLBCL的療效。

綜上所述，IDO高表達(dá)更常見(jiàn)于已經(jīng)出現(xiàn)全身癥狀(B癥狀) 、臨床分期較高、非GCB型DLBCL患者中，IDO高表達(dá)患者的近期療效較差，3年無(wú)進(jìn)展生存率與總生存率均較低。IDO表達(dá)水平可以作為 DLBCL患者獨(dú)立預(yù)后因素。