樂伐替尼靶向調(diào)節(jié)VEGFR/PI3K/AKT治療晚期甲狀腺癌的作用機制

王 寧 劉金彪

甲狀腺癌是發(fā)病率呈逐年上升的內(nèi)分泌系統(tǒng)的惡性腫瘤[1]，其發(fā)病機制尚未明確，主要包括碘的攝入不足和過量、接觸大量放射性碘或頸部放射線照射等引發(fā)的甲狀腺細(xì)胞的異常分裂及癌變，惡變?yōu)榧谞钕侔2-3]。甲狀腺癌主要包括分化型甲狀腺癌(DTC)、Hürthle細(xì)胞癌、甲狀腺髓樣癌(MTC)及未分化甲狀腺癌(ATC)，其中分化型甲狀腺癌又包括濾泡狀甲狀腺癌(FTC)及乳頭狀甲狀腺癌(PTC)，占甲狀腺癌比例的90%～95%[4-5]。研究表明，甲狀腺癌組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)明顯升高，在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和新生血管的形成過程中發(fā)揮重要作用[6]。本文主要通過給予晚期分化型甲狀腺癌患者新型多靶點酪氨酸激酶抑制劑(TKI)樂伐替尼治療，旨在探討樂伐替尼對晚期分化型甲狀腺癌的治療作用，及其誘導(dǎo)VEGFR靶向途徑聯(lián)合PI3K/AKT治療晚期甲狀腺癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2015年5月至2017年5月本院收治的100例晚期分化型甲狀腺癌患者，均經(jīng)病理學(xué)確診。患者平均發(fā)病年齡(43.27±3.56)歲?；颊呖诜贩ヌ婺?，劑量為24 mg/d，直到出現(xiàn)無法耐受的副作用和疾病惡化。入選標(biāo)準(zhǔn)：①靶病灶完失去攝碘能力；②1年內(nèi)患者接受單次≥3.7 GBq放射碘治療，或一年內(nèi)每兩次放射碘治療≥3.7 GBq，靶病灶持續(xù)擴展。排除標(biāo)準(zhǔn)：①半年內(nèi)使用過VEGFR-TKI小分子藥物；②具有吞咽困難、惡心嘔吐、慢性腹瀉、消化潰瘍、胃腸道出血和腸梗阻等腸道疾病者；③INR>1.5×ULN、APTT>1.5×ULN凝血功能異?；虺鲅獌A向者；④懷孕或哺乳期婦女。

1.2 方法

1.2.1 患者血清標(biāo)志物Tg檢測 采用Roche Elecsys 2010電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析儀檢測2組患者治療前后血清中甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)濃度。每份測3次取平均值，Tg同比下降率=(Tg-Tg基線)/Tg基線。

1.2.2 VEGFR2蛋白表達(dá)水平 取甲狀腺癌患者癌組織石蠟切片標(biāo)本，在室溫下采用5%血清進(jìn)行封閉40 min，然后加入堿性磷酸酶二抗、單克隆抗體VEGFR2在4 ℃下孵育。然后用PBS進(jìn)行清洗，然后加入SP和DAB在恒溫下顯色封片。用10×、40×物鏡顯微鏡進(jìn)行觀察。棕黃色顆粒在甲狀腺癌患者癌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)為VEGFR2的陽性表達(dá)。計算VEGFR2蛋白的平均光密度。

1.2.3 Real-Time PCR檢測PI3K和AKT表達(dá)含量 對PI3K和AKT mRNA表達(dá)進(jìn)行Real-time PCR法檢測。采用Trizol法提取總RNA，然后轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進(jìn)行實時熒光定量 PCR操作。采用閾值循環(huán)數(shù)(CT) 相對定量比較法確定不同組別之間PI3K和AKT mRNA相對百分比。

1.2.4 蛋白PI3K和AKT含量 收取甲狀腺癌組織蛋白，并且測定其濃度，將其總量調(diào)整為30 μg/μl。將各組甲狀腺癌蛋白樣品進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，BSA封閉后加入PI3K和AKT一抗和堿性磷酸酶二抗。進(jìn)顯色并，然后再灰度掃描分析每條條帶，計算PI3K和AKT蛋白的表達(dá)量。

1.2.5 Caspase-3表達(dá)水平測定 收取甲狀腺癌組織的蛋白上清液并用緩沖液稀釋成50 μl，按試劑盒操作說明書在96孔板中加入5 μl 4 mM LEHD-pNA底物，37 ℃保溫箱恒溫孵育1 h，酶標(biāo)儀在405 nm處測定其蛋白溶液吸光值。Caspase-3活性單位(U)=(各組A值-凋零組A值)/標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.3 觀察指標(biāo)

臨床療效評價標(biāo)準(zhǔn):①完全緩解(complete remission,CR)，治療后持續(xù)1個月腫瘤完全消失；②部分緩解(partial remission,PR)，治療后腫瘤體積縮小達(dá)50%，持續(xù)1個月腫瘤及其他病變無擴展；③穩(wěn)定(stable disease,SD)，治療后腫瘤體積持續(xù)1個月增大不超過25%，縮小不超過50%；④進(jìn)展(progressive disease,PD)，治療后腫瘤病變體積增大超過25%。有效=完全緩解(CR)+部分緩解(PR)，無效=穩(wěn)定(SD)+進(jìn)展(PD)。觀察2組治療前后Tg水平變化。比較甲狀腺癌癌旁組織與癌組織VEGFR2的平均光密度，PIiK和AKT及其蛋白的表達(dá)含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料采用單因素方差分析和t檢驗比較，計數(shù)資料采用卡方檢驗比較。

2 結(jié)果

2.1 療效觀察

治療后完全緩解17例(17.00%)；部分緩解43例(43.00%)；穩(wěn)定20例(20.00%)；進(jìn)展20例(20.00%)。治療有效為60例(60.00%)，無效為40例(40.00%)。

2.2 患者血清Tg變化

治療前晚期分化型甲狀腺癌患者血清TgAb濃度為(87.65±12.31)IU/ml，治療1療程后患者血清TgAb濃度為(73.65±12.42)IU/ml；治療2療程后，患者血清TgAb濃度為(65.94±12.18)IU/ml。與治療前相比，晚期分化型甲狀腺癌應(yīng)用樂伐替尼治療后，患者血清TgAb濃度顯著下降，，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=48.010，P=0.000)?；颊咧委?療程Tg同比下降率為15.97%，治療2療程Tg同比下降率為24.77%。

2.3 免疫組化結(jié)果

如圖1，癌旁組織中VEGFR2蛋白平均光密度為(0.69±0.11)；治療后甲狀腺癌組織內(nèi)VEGFR2蛋白平均光密度為(1.24±0.20)，治療前VEGFR2蛋白平均光密度為(1.57±0.26)。治療后甲狀腺癌組織內(nèi)VEGFR2蛋白平均光密度明顯低于治療前，但仍高于癌旁組織(P<0.05)。

圖1 VEGFR2免疫組化結(jié)果(200×)

2.4 Caspase 3活性檢測結(jié)果

如圖2，甲狀腺癌組織內(nèi)Caspase 3活性比癌旁組織內(nèi)表達(dá)明顯上升(P<0.05)；晚期分化型甲狀腺癌患者應(yīng)用樂伐替尼治療后，Caspase 3活性顯著降低(P<0.05)。

注：*為與癌旁組織相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；#為與治療前相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 WesternBlot檢測蛋白表達(dá)水平

如圖3，與癌旁組織p-PI3K和p-AKT蛋白含量相比，甲狀腺癌組織內(nèi)p-PI3K和p-AKT蛋白含量明顯上升(P<0.05)；晚期分化型甲狀腺癌患者應(yīng)用樂伐替尼治療后，p-PI3K和p-AKT蛋白含量顯著降低(P<0.05)。

2.6 Real-Time PCR檢測mRNA表達(dá)含量

如圖4，甲狀腺癌組織內(nèi)PI3K和AKT mRNA表達(dá)含量比癌旁組織相比明顯上升(P<0.05)；晚期分化型甲狀腺癌患者應(yīng)用樂伐替尼治療后，PI3K和AKT mRNA表達(dá)含量顯著降低(P<0.05)。

3 討論

甲狀腺癌對一般藥物并不敏感，常規(guī)的治療主要是針對快速增長的癌細(xì)胞。樂伐替尼(lenvatinib)是一種多靶點酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，能夠直接針對FGFR1-4、VEGFR1-3、RET、PDGFR和c-KIT等多靶點TKI，抑制腫瘤血管的形成和生長，起到抗腫瘤的作用[7-8]。臨床研究表明，樂伐替尼對BRAF或RAS野生型或突變的患者、放射性碘難治性疾病的患者、曾接受過 TKI 治療的患者及具有骨轉(zhuǎn)移灶的患者均有療效，緩解率高達(dá)50%，并且能夠延長無進(jìn)展生存期(PFS)[9-10]。2015年2月FDA已經(jīng)批準(zhǔn)將樂伐替尼用于治療晚期放射性碘難治性甲狀腺癌，是目前治療晚期分化型甲狀腺癌最新的分子靶向藥物。研究表明，樂伐替尼的靶向突出的療效可能與其特異性地抑制 VFGFR 有關(guān)[11-12]。

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是由骨髓原始細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞分泌而來，VEGF家族包括 3 種酪氨酸蛋白激酶受體(VEGR1-3)及7 種糖蛋白(VEGFA-E 及PlGF1-2)。VEGF可通過受體磷酸化與 RTK 特異性結(jié)合，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和存活及使血管通透性增加，誘導(dǎo)腫瘤血管的生成及增加血流量，加速腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[13-14]。樂伐替尼主要是通過競爭性抑制VEGFR來阻斷其與 VEGF結(jié)合，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，以及新生血管生成等。活化的PI3K/Akt可激活調(diào)控 VEGF、缺氧誘導(dǎo)因子1α及其他血管生成因子的表達(dá)和分泌等[15-16]。VEGF可反饋性地活化PI3K/AKT信號通路從而有助于血管的生成；反之，抑制VEGF及PI3K/AKT信號通路，可有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，增加血管通透性，起到抑制腫瘤生長的作用[17-18]。

研究表明樂伐替尼治療晚期分化型甲狀腺癌的有效率為60.00%，療效顯著。甲狀腺球蛋白(Tg)在外周血液內(nèi)檢出量較少或無法檢測。當(dāng)甲狀腺發(fā)生病變時導(dǎo)致甲狀腺濾泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到損傷，甲狀腺球蛋白被釋放進(jìn)入外周血，從而使甲狀腺激素的合成減少，加速機體甲狀腺功能的減退，因此，Tg的檢測對于評估、治療及分化型甲狀腺癌的預(yù)后具有重要的作用[19-20]。樂伐替尼可以有效調(diào)節(jié)患者血清TgAb濃度，說明其可以有效改善晚期分化型甲狀腺癌的甲狀腺損傷。同時，樂伐替尼可以有效降低和抑制晚期分化型甲狀腺癌患者組織內(nèi)VEGF及PI3K/AKT的信號表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖分化、浸潤遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡信號效應(yīng)性蛋白Caspase 3活化，加速腫瘤細(xì)胞的死亡，有效抑制癌細(xì)胞的增殖分化。

注：*為與癌旁相比，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；#為與治療前相比，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

注：*為與癌旁相比，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；#為與治療前相比，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

綜上所述，樂伐替尼可以有效治療晚期分化型甲狀腺癌，并調(diào)控VEGFR靶向途徑抑制PI3K/AKT信號通路，誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡，起到治療晚期分化型甲狀腺癌的作用。