• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于腫瘤數(shù)據(jù)庫分析IGFBP5基因在結(jié)直腸癌中的表達及意義

    2021-03-22 06:40:36曹立宇
    實用癌癥雜志 2021年3期
    關(guān)鍵詞:生存期直腸癌通路

    張 聰 曹立宇

    結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,在我國惡性腫瘤致死率順位排名中居于第三位,多數(shù)結(jié)直腸癌患者在確診時已處于中晚期,5年生存率較低[1-2]。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是結(jié)直腸癌患者的主要致死因素[3]。

    胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白家族(Insulin-like growth factor-binding proteins)包括IGFBP1-7共7個成員,這7個成員在新陳代謝中起著至關(guān)重要的作用,例如,胰島素抑制IGFBP1這是胰島素分泌的一個標(biāo)志[4]。IGFBP5是該家族一員,在細胞生長、分化、凋亡和細胞代謝中發(fā)揮重要作用。有研究證明IGFBP5濃度與肥胖男性脂聯(lián)素濃度相關(guān),提示IGFBP5可能參與代謝綜合征[5]。此外,IGFBP5的缺失導(dǎo)致輕度葡萄糖耐受不良和加重飲食誘導(dǎo)的肥胖[6]。并且IGFBP5參與前列腺癌、胃癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-8]。

    本研究通過分析GEPIA和Linked Omics數(shù)據(jù)庫,研究IGFBP5基因在結(jié)直腸癌中的表達水平與臨床參數(shù)的關(guān)系,分析IGFBP5與結(jié)直腸癌生存和預(yù)后的影響,并進一步探討IGFBP5參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制,以期對結(jié)直腸癌的初步診斷和臨床治療提供理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 病例資料

    GEPIA2(gepia2.cancer-pku.cn)網(wǎng)站是1個分析腫瘤和正常樣本的在線工具,其數(shù)據(jù)來源TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫,它提供了可定制的功能,比如腫瘤/正常的微分表達式分析,可提供腫瘤患者腫瘤患者的臨床參數(shù)分析和生存分析等[9]。LinkedOmics數(shù)據(jù)庫包含來自TCGA數(shù)據(jù)庫的32種癌癥類型的多組學(xué)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù),共有11158名患者。它也是第一個集成了基于質(zhì)譜(MS)的全球蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的多組學(xué)數(shù)據(jù)庫,LinkedOmics主要有3個分析模塊,Link Finder板塊可以靈活地探索感興趣的分子或臨床屬性與所有其他屬性之間的關(guān)聯(lián),并可進行分析和和可視化;Link Compare板塊可輕松比較LinkFinder識別出的關(guān)聯(lián),這在多組學(xué)和全癌分析中特別有用;Link Interpreter板塊通過路徑和網(wǎng)絡(luò)分析將已識別的關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)換為生物學(xué)理解[10]。ONCOMINE包含65個基因表達數(shù)據(jù)集,包括超過4700個微陣列實驗的接近4800萬個基因表達測量值??蓪⒋蠖鄶?shù)主要類型的癌癥與各自的正常組織以及多種癌癥亞型進行比較,基于臨床和病理學(xué)的分析可用于探索,可以查詢所有分析中選定基因或選定分析中多個基因的數(shù)據(jù)并可視化[11]。

    1.2 IGFBP5表達分析

    通過查閱ONCOMINE數(shù)據(jù)庫研究IGFBP5在多種腫瘤中的表達水平,結(jié)果顯示:IGFBP5基因在腦與中樞神經(jīng)腫瘤、白血病、胰腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤中表達水平上調(diào)。

    使用RT-qPCR實驗驗證IGFBP5基因在結(jié)直腸癌中的表達。首先使用NCBI網(wǎng)站設(shè)計IGFBP5引物,上游序列:5'--3' ACCTGAGATGAGACAGGAGTC和下游序列5'--3' GTAGAATCCTTTGCGGTCACAA,設(shè)計內(nèi)參GAPDH引物,上游序列5'--3' GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT和下游序列5'--3' GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG,退火溫度為60 ℃,按照TAKARA公司試劑盒進行實驗。38例結(jié)直腸癌組織及其配對組織來源于2014至2019年間在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽醫(yī)院病理科做冰凍切片的剩余組織,所有病例均經(jīng)病理診斷,并經(jīng)患者及家屬知情同意。

    1.3 臨床參數(shù)分析

    使用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析IGFBP5與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。本研究應(yīng)用LinkFinder模塊分析IGFBP5的基因表達水平與結(jié)直腸癌的臨床病理特征的關(guān)系。操作步驟為:①腫瘤類型:選擇結(jié)直腸癌;②數(shù)據(jù)類型選擇RNAseq;③數(shù)據(jù)屬性:選擇IGFBP5;④靶數(shù)據(jù)類型:選擇Clinical;⑤統(tǒng)計學(xué)方法:選擇非參數(shù)檢驗。

    1.4 生存分析

    使用GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析IGFBP5表達與結(jié)直腸癌患者總生存期和無病生存期之間的關(guān)系。操作步驟為:①輸入基因名IGFBP5;②點擊生存分析頁面,選擇總生存期/無病生存期;③選擇腫瘤類型結(jié)直腸癌(同時選取COAD和READ);④點擊plot可視化分析,GEPIA使用Log-rank檢驗,即Mantel-Cox檢驗,用于假設(shè)檢驗,cox比例危險比和95%置信區(qū)間信息也可以包含在生存圖中。

    1.5 基因集富集分析

    使用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析IGFBP5與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。本研究應(yīng)用Link Interpreter板塊基于IGFBP5基因在結(jié)直腸癌中的表達水平進行GO和KEGG聚類分析。操作步驟為①腫瘤類型:選擇結(jié)直腸癌;②數(shù)據(jù)類型選擇RNAseq;③數(shù)據(jù)屬性:選擇IGFBP5;④靶數(shù)據(jù)類型:選擇RNAseq;⑤統(tǒng)計學(xué)方法:選擇Spearman相關(guān)性分析;⑥導(dǎo)出數(shù)據(jù):導(dǎo)出結(jié)直腸癌中與IGFBP5表達顯著相關(guān)的前1000位基因;⑦分析:使用DAVID網(wǎng)站進行GO和KEGG聚類分析。

    1.6 IGFBP5相關(guān)基因靶點網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

    應(yīng)用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建IGFBP5相關(guān)基因靶點網(wǎng)絡(luò),同時使用STRING數(shù)據(jù)庫檢索IGFBP5共表達蛋白,并構(gòu)建IGFBP5分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),將二者結(jié)果取交集,得出與IGFBP5基因關(guān)聯(lián)最緊密的基因。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

    應(yīng)用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。應(yīng)用配對t檢驗分析IGFBP5在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達水平,使用χ2檢驗分析IGFBP5與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性,使用Log-rank檢驗法分析IGFBP5表達與結(jié)直腸癌患者生存之間的相關(guān)性,基因富集分析結(jié)果中認為P<0.05且FDR(false discovery rates)<0.25的基因集為顯著富集基因集。所有數(shù)據(jù)以P<0.05時認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 IGFBP5在結(jié)直腸癌組織中表達水平升高

    通過查閱ONCOMINE數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)IGFBP5基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、前列腺癌和淋巴瘤中表達水平升高(P<0.05)。采用RT-qPCR實驗檢測IGFBP5在38例結(jié)直腸癌組織及其配對組織中的表達,得到了一致的結(jié)果(P<0.05)(圖1)。

    2.2 IGFBP5在結(jié)直腸癌中的表達水平與其臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

    選擇LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析IGFBP5在結(jié)直腸癌中與其臨床病理參數(shù)的相關(guān)性,結(jié)果顯示:IGFBP5與結(jié)直腸癌N分期(n=373)顯著相關(guān)(P=0.025),而與腫瘤分級(n=358)、T分期(n=375)和M分期(n=306)均無顯著相關(guān)性(P>0.05)(圖2)。

    2.3 IGFBP5表達與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析

    本研究應(yīng)用GEPIA2數(shù)據(jù)庫進行生存分析,結(jié)果顯示在結(jié)直腸癌中,IGFBP5高表達組(n=135)總生存期較IGFBP5低表達組(n=135)明顯降低(P=0.014),其中HR=1.8,P(HR)=0.016;結(jié)直腸癌中IGFBP5高表達組(n=135)無病生存期較IGFBP5低表達組(n=135)明顯降低(P=0.0082),其中HR=1.9,P(HR)=0.0095(圖3)。

    2.4 IGFBP5的功能基因集富集

    在Linkedomics數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出結(jié)直腸癌中與IGFBP5相關(guān)的前1000位相關(guān)基因,采用DAVID網(wǎng)站分析IGFBP5的分子功能和相關(guān)信號通路,GO分析結(jié)果顯示:IGFBP5在結(jié)直腸癌中與細胞黏附、血管生成和血管內(nèi)皮生長因子等多種促癌功能有關(guān),KEGG分析結(jié)果顯示:IGFBP5基因與PI3K-Akt信號通路激活有關(guān)(表1)。

    2.5 IGFBP5共表達基因分析

    為獲得與富集所得生物學(xué)功能和相關(guān)信號通路相關(guān)的潛在上下游分子,我們使用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建IGFBP5相關(guān)基因靶點網(wǎng)絡(luò),同時使用STRING數(shù)據(jù)庫檢索IGFBP5共表達蛋白,并構(gòu)建IGFBP5分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),將二者結(jié)果取交集,結(jié)果顯示在IGFBP5共表達基因中,IGF1、IGF2、SPP1、LTBP1和FAM20C基因與IGFBP5基因關(guān)聯(lián)最緊密。

    圖3 IGFBP5表達與結(jié)直腸癌患者總生存期(左)和無病生存期(右)的相關(guān)性分析

    3 討論

    胰島素樣生長因子5(IGFBP5)位于人類染色體2q35上,編碼含272個氨基酸殘基的多通道跨膜蛋白,分子量30.5 kDa,是體內(nèi)生長激素的1個重要調(diào)節(jié)因子[12]。有關(guān)IGFBP5的生物學(xué)功能研究較少,有研究證明IGFBP5濃度與肥胖男性脂聯(lián)素濃度相關(guān),提示IGFBP5可能參與代謝綜合征[5]。此外,IGFBP5的缺失導(dǎo)致輕度葡萄糖耐受不良和加重飲食誘導(dǎo)的肥胖[6]。并且IGFBP5參與前列腺癌、胃癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-8]。

    近年來IGFBP5在腫瘤中的研究逐漸展開,Neuzillet等[13]研究發(fā)現(xiàn),IGFBP5在膀胱癌中通過抑制IGF1R信號通路促進腫瘤細胞增殖能力和遷移能力,進而促進了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。Sun等[14]研究發(fā)現(xiàn)circPIP5K1A通過靶向miR-661/IGFBP5軸促進卵巢癌進展,支持其作為該疾病治療的候選靶點的實用性。啟動子甲基化可引起該基因的沉默,IGFBP5基因啟動子區(qū)甲基化水平在胃癌中明顯高于癌旁組織,進一步證實IGFBP5可作為胃癌的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記物[15]。然而也有研究者發(fā)現(xiàn),在黑色素瘤中,IGFBP5表現(xiàn)相反,抑制腫瘤細胞的生長和遷移[16]。因此,在不同的腫瘤中,由于腫瘤之間發(fā)生機制的差異性,IGFBP5可能有著不同的作用。本研究結(jié)果顯示相對于正常癌旁組織,IGFBP5在結(jié)直腸癌組織中表達水平顯著性,進一步分析發(fā)現(xiàn)IGFBP5與結(jié)直腸癌N分期呈顯著性正相關(guān),而與T分期、M分期和腫瘤分級并無顯著相關(guān)性,即IGFBP5表達水平越高的結(jié)直腸癌患者腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移水平越高,提示IGFBP5的表達促進結(jié)直腸癌細胞的轉(zhuǎn)移,可能是結(jié)直腸癌的促癌因子。生存分析也證實了IGFBP5是結(jié)直腸癌的不良預(yù)后因素,IGFBP5表達水平與結(jié)直腸癌總生存期和無病生存期具有顯著負相關(guān)性。因此IGFBP5的表達可能促進結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。腫瘤的發(fā)生發(fā)展影響因素及其復(fù)雜,在正常結(jié)直腸癌惡變的過程中,多伴有細胞的黏附水平降低以及血管生成水平的變化[17-18],而PI3K-Akt信號通路抑制腫瘤細胞的凋亡以及促進增殖有關(guān),是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中一個重要的信號通路[19-20]。本研究通過GO分析,發(fā)現(xiàn)IGFBP5的表達可促進細胞黏附、血管生成和血管內(nèi)皮生長因子等多種促癌功能,提示IGFBP5可能對結(jié)直腸癌上皮細胞的惡變具有促進作用,KEGG分析結(jié)果顯示IGFBP5表達與PI3K-Akt信號通路激活有關(guān),參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控。通過分子互作網(wǎng)絡(luò)分析,我們篩選出了IGF1、IGF2、SPP1、LTBP1和FAM20C等IGFBP5共表達基因,其中IGFI、IGF2是IGFBP5的重要調(diào)控因子[21],而SPP1是PI3K-Akt信號通路上游調(diào)控因子[22]。由此可以推測IGFBP5很可能是同坐作用于SPP1,間接激活PI3K-Akt信號通路,從而促進結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。

    表1 基因富集結(jié)果

    本研究的創(chuàng)新之處在于利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中具有完整臨床資料的病例,樣本量大,結(jié)合基礎(chǔ)實驗驗證可信度高,然而不足之處也很明顯,無論是GEPIA2還是LinkedOmics數(shù)據(jù)庫提供的都是IGFBP5基因mRNA水平的表達數(shù)據(jù),無法檢測IGFBP5在結(jié)直腸癌中的蛋白表達水平。本研究為以后IGFBP5在腫瘤中的臨床研究提供了理論基礎(chǔ),明確IGFBP5在結(jié)直腸癌乃至整個腫瘤中所起的作用和具體分子機制尚需要進一步的實驗,展開更深入的研究,從而為腫瘤的早期診斷、臨床治療和預(yù)后知道提供靶向新思路。

    猜你喜歡
    生存期直腸癌通路
    腹腔鏡下直腸癌前側(cè)切除術(shù)治療直腸癌的效果觀察
    鼻咽癌患者長期生存期的危險因素分析
    胃癌術(shù)后患者營養(yǎng)狀況及生存期對生存質(zhì)量的影響
    癌癥進展(2016年11期)2016-03-20 13:16:04
    直腸癌術(shù)前放療的研究進展
    COXⅠ和COX Ⅲ在結(jié)直腸癌組織中的表達及其臨床意義
    Kisspeptin/GPR54信號通路促使性早熟形成的作用觀察
    術(shù)中淋巴結(jié)清掃個數(shù)對胃癌3年總生存期的影響
    proBDNF-p75NTR通路抑制C6細胞增殖
    GRP及GRPR在結(jié)直腸癌中的表達及意義
    通路快建林翰:對重模式應(yīng)有再認識
    精品国内亚洲2022精品成人| 免费av毛片视频| 九色亚洲精品在线播放| 黄色成人免费大全| 亚洲一区二区三区色噜噜 | 天堂俺去俺来也www色官网| 男女午夜视频在线观看| 啦啦啦 在线观看视频| 69av精品久久久久久| 国产亚洲欧美98| 69精品国产乱码久久久| 国产精品永久免费网站| 亚洲 欧美一区二区三区| 搡老熟女国产l中国老女人| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产精品 国内视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 午夜91福利影院| 亚洲 国产 在线| 99精品欧美一区二区三区四区| av超薄肉色丝袜交足视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 757午夜福利合集在线观看| 最好的美女福利视频网| 一个人免费在线观看的高清视频| 视频区图区小说| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲三区欧美一区| 一进一出好大好爽视频| 国产成人精品久久二区二区91| 国产97色在线日韩免费| 超碰成人久久| 欧美黑人精品巨大| 丝袜人妻中文字幕| 黄色a级毛片大全视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 欧美av亚洲av综合av国产av| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 曰老女人黄片| 久久中文看片网| a级毛片在线看网站| 成人亚洲精品av一区二区 | 国产精品久久视频播放| 国产单亲对白刺激| 一二三四在线观看免费中文在| 久久亚洲精品不卡| 亚洲精华国产精华精| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美成人午夜精品| 国产主播在线观看一区二区| 久久久久九九精品影院| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 99久久99久久久精品蜜桃| а√天堂www在线а√下载| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 亚洲欧美激情综合另类| 最近最新免费中文字幕在线| 电影成人av| 亚洲专区国产一区二区| 男女午夜视频在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 老司机亚洲免费影院| 十八禁人妻一区二区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 99re在线观看精品视频| 91成人精品电影| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 色哟哟哟哟哟哟| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久香蕉精品热| 岛国在线观看网站| 91在线观看av| 黄色丝袜av网址大全| 首页视频小说图片口味搜索| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 久9热在线精品视频| 超色免费av| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 亚洲美女黄片视频| 午夜精品国产一区二区电影| 一本综合久久免费| 真人做人爱边吃奶动态| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲九九香蕉| 久久精品人人爽人人爽视色| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 日本 av在线| 国产精品久久久av美女十八| 欧美一区二区精品小视频在线| 超碰97精品在线观看| 热99国产精品久久久久久7| av国产精品久久久久影院| 最新美女视频免费是黄的| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品成人在线| 国产一区在线观看成人免费| 久久精品91蜜桃| 一级a爱视频在线免费观看| 老司机在亚洲福利影院| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 欧美乱色亚洲激情| 色老头精品视频在线观看| 精品福利观看| 黑人操中国人逼视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 在线观看舔阴道视频| 精品久久久精品久久久| 九色亚洲精品在线播放| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美精品啪啪一区二区三区| a级毛片黄视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久草成人影院| 日韩有码中文字幕| 一区在线观看完整版| 母亲3免费完整高清在线观看| 1024视频免费在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 天堂中文最新版在线下载| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲精品粉嫩美女一区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 精品国产一区二区三区四区第35| 日韩欧美国产一区二区入口| 91字幕亚洲| 欧美成人午夜精品| 亚洲专区字幕在线| 一级毛片高清免费大全| 制服人妻中文乱码| 国产单亲对白刺激| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 午夜精品久久久久久毛片777| www.自偷自拍.com| 国产精品久久久久成人av| 久久青草综合色| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲精华国产精华精| 90打野战视频偷拍视频| 嫩草影院精品99| 国产精品国产av在线观看| 国产野战对白在线观看| 亚洲成人久久性| 国产精品1区2区在线观看.| 精品卡一卡二卡四卡免费| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 午夜精品在线福利| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 一进一出好大好爽视频| 在线观看一区二区三区| 黄色 视频免费看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 又黄又粗又硬又大视频| 级片在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 日韩av在线大香蕉| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 色综合婷婷激情| 成人影院久久| √禁漫天堂资源中文www| 久久草成人影院| 女警被强在线播放| а√天堂www在线а√下载| 深夜精品福利| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 日韩中文字幕欧美一区二区| 免费少妇av软件| 90打野战视频偷拍视频| 久久久国产成人免费| 看免费av毛片| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久久久久久精品吃奶| 免费不卡黄色视频| 亚洲在线自拍视频| 一级a爱视频在线免费观看| 不卡一级毛片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产av精品麻豆| 日本wwww免费看| 丝袜美足系列| 亚洲三区欧美一区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一区二区三区国产精品乱码| 超碰97精品在线观看| av视频免费观看在线观看| а√天堂www在线а√下载| 99香蕉大伊视频| 欧美久久黑人一区二区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 村上凉子中文字幕在线| 久久精品人人爽人人爽视色| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| av天堂久久9| 欧美精品亚洲一区二区| 另类亚洲欧美激情| a级毛片在线看网站| 国产97色在线日韩免费| 精品国产国语对白av| 午夜影院日韩av| 极品教师在线免费播放| 久久这里只有精品19| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久亚洲精品不卡| 久久久久九九精品影院| 精品第一国产精品| 黄色 视频免费看| 国产黄a三级三级三级人| 极品人妻少妇av视频| av电影中文网址| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产av精品麻豆| 最新在线观看一区二区三区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 日本欧美视频一区| 一夜夜www| 在线av久久热| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 99re在线观看精品视频| a在线观看视频网站| 丰满迷人的少妇在线观看| 一级黄色大片毛片| 99热只有精品国产| 久久久久久久久久久久大奶| www.精华液| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久中文看片网| 成人手机av| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美+亚洲+日韩+国产| 午夜成年电影在线免费观看| 看免费av毛片| 成人特级黄色片久久久久久久| 午夜福利,免费看| 欧美乱妇无乱码| 丝袜美足系列| 午夜影院日韩av| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 男女下面进入的视频免费午夜 | 国产极品粉嫩免费观看在线| 午夜免费鲁丝| 久久久久久人人人人人| 亚洲av电影在线进入| 操美女的视频在线观看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产麻豆69| 久久久久久久久中文| 亚洲美女黄片视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 久久草成人影院| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 黄片大片在线免费观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久久久久人人人人人| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产精品国产av在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 窝窝影院91人妻| www.自偷自拍.com| 99国产精品一区二区蜜桃av| 最新美女视频免费是黄的| 老汉色∧v一级毛片| 久久久国产精品麻豆| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 中文字幕精品免费在线观看视频| 在线观看免费视频网站a站| 久久性视频一级片| 成人精品一区二区免费| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 18禁美女被吸乳视频| 成人18禁在线播放| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产免费av片在线观看野外av| 国产成人影院久久av| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 乱人伦中国视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲男人的天堂狠狠| 中文亚洲av片在线观看爽| 99国产精品免费福利视频| av福利片在线| 国产亚洲精品一区二区www| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 热re99久久精品国产66热6| 一二三四社区在线视频社区8| 精品一区二区三区四区五区乱码| 日韩国内少妇激情av| av欧美777| 欧美色视频一区免费| 亚洲av成人一区二区三| 波多野结衣av一区二区av| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久久国产欧美日韩av| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久草成人影院| 一区二区三区激情视频| 露出奶头的视频| 国产成人啪精品午夜网站| 在线观看www视频免费| 亚洲av电影在线进入| 精品日产1卡2卡| 成人特级黄色片久久久久久久| 淫秽高清视频在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 美女 人体艺术 gogo| 欧美激情久久久久久爽电影 | 18禁国产床啪视频网站| 99久久国产精品久久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品国产美女av久久久久小说| 久久香蕉激情| 国产免费男女视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 久久久国产精品麻豆| 国产97色在线日韩免费| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 成人av一区二区三区在线看| 日韩视频一区二区在线观看| svipshipincom国产片| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久久久精品国产欧美久久久| 成人国产一区最新在线观看| а√天堂www在线а√下载| 精品第一国产精品| 国产三级在线视频| 高清毛片免费观看视频网站 | 丁香欧美五月| 大香蕉久久成人网| 在线观看舔阴道视频| 久久天堂一区二区三区四区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲第一av免费看| 这个男人来自地球电影免费观看| 精品高清国产在线一区| 黄色女人牲交| 啦啦啦免费观看视频1| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产一区二区激情短视频| 婷婷丁香在线五月| 999精品在线视频| 欧美激情高清一区二区三区| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲伊人色综图| 视频在线观看一区二区三区| 在线观看免费高清a一片| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产激情久久老熟女| 欧美日本亚洲视频在线播放| 夜夜爽天天搞| 国产高清国产精品国产三级| 国产乱人伦免费视频| av有码第一页| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产一区二区三区视频了| 国产精品国产av在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 黄片播放在线免费| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲人成77777在线视频| 国产高清videossex| 日韩精品青青久久久久久| www.www免费av| 午夜91福利影院| av欧美777| 美女 人体艺术 gogo| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 99久久久亚洲精品蜜臀av| 啪啪无遮挡十八禁网站| 日日夜夜操网爽| 丰满的人妻完整版| 成人国语在线视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 日本五十路高清| 1024视频免费在线观看| 一级毛片高清免费大全| 丰满的人妻完整版| 久久久国产成人精品二区 | av超薄肉色丝袜交足视频| 色综合婷婷激情| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 超色免费av| 久久精品国产综合久久久| www.999成人在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲国产欧美日韩在线播放| av超薄肉色丝袜交足视频| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美日本中文国产一区发布| www.精华液| 亚洲成人免费av在线播放| 久久九九热精品免费| 老司机亚洲免费影院| 天堂√8在线中文| 日本三级黄在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产免费男女视频| 美女高潮到喷水免费观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产一区在线观看成人免费| 99久久国产精品久久久| 丰满饥渴人妻一区二区三| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久久久久免费高清国产稀缺| 在线永久观看黄色视频| 精品久久久久久电影网| 亚洲精品在线美女| 免费搜索国产男女视频| 日韩国内少妇激情av| 久久精品人人爽人人爽视色| 91老司机精品| 久热这里只有精品99| 久久草成人影院| 乱人伦中国视频| 久久久国产成人免费| 欧美成人午夜精品| 久久99一区二区三区| 91在线观看av| 国产一区二区激情短视频| 久久人妻av系列| 一区福利在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 日日夜夜操网爽| 黄片小视频在线播放| 成熟少妇高潮喷水视频| 日韩精品青青久久久久久| 后天国语完整版免费观看| 九色亚洲精品在线播放| 日本a在线网址| 精品高清国产在线一区| 十八禁网站免费在线| 伦理电影免费视频| 日本欧美视频一区| 亚洲成国产人片在线观看| 99久久人妻综合| 久9热在线精品视频| 亚洲专区国产一区二区| 免费人成视频x8x8入口观看| 色播在线永久视频| 国产91精品成人一区二区三区| 在线观看日韩欧美| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 十分钟在线观看高清视频www| 免费日韩欧美在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| a级毛片在线看网站| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 动漫黄色视频在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 国产精品一区二区免费欧美| 欧美不卡视频在线免费观看 | 人成视频在线观看免费观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲av成人av| xxx96com| 一进一出好大好爽视频| 多毛熟女@视频| 国产又爽黄色视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 嫩草影视91久久| 视频区图区小说| 国产高清视频在线播放一区| 午夜精品在线福利| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 精品福利永久在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 色播在线永久视频| 久久久久久久午夜电影 | 欧美激情 高清一区二区三区| av天堂久久9| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 欧美黑人精品巨大| 国产精品久久电影中文字幕| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产亚洲欧美98| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 99热国产这里只有精品6| 不卡一级毛片| 国产精华一区二区三区| 又紧又爽又黄一区二区| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美乱色亚洲激情| 色综合站精品国产| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲国产精品sss在线观看 | 成人精品一区二区免费| 长腿黑丝高跟| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品免费一区二区三区在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲成人免费电影在线观看| 中国美女看黄片| 亚洲专区字幕在线| 亚洲第一青青草原| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| av在线播放免费不卡| 国产激情久久老熟女| 婷婷六月久久综合丁香| 国产单亲对白刺激| 一级a爱片免费观看的视频| 中出人妻视频一区二区| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 女性被躁到高潮视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 精品久久久精品久久久| 满18在线观看网站| 国产精品国产高清国产av| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲五月色婷婷综合| 一边摸一边抽搐一进一小说| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 一夜夜www| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产精品 国内视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 操美女的视频在线观看| av天堂在线播放| 国产区一区二久久| 美女午夜性视频免费| 国产单亲对白刺激| 美女午夜性视频免费| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 另类亚洲欧美激情| 国产精品一区二区免费欧美| 91精品三级在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 天堂√8在线中文| 真人做人爱边吃奶动态| 国产精品久久久av美女十八| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产又色又爽无遮挡免费看| 免费av中文字幕在线| 亚洲,欧美精品.| 亚洲在线自拍视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 丁香六月欧美| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 精品福利永久在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 久99久视频精品免费| 国产野战对白在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 另类亚洲欧美激情| 看免费av毛片| 天天添夜夜摸| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久亚洲真实| 亚洲三区欧美一区| 波多野结衣一区麻豆| 婷婷精品国产亚洲av在线| 欧美丝袜亚洲另类 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 91成人精品电影| 国产精品亚洲av一区麻豆| 在线观看一区二区三区| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲熟妇熟女久久| 精品高清国产在线一区| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 午夜精品在线福利| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久久国产成人精品二区 | 成人18禁在线播放| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 一级毛片高清免费大全| 性色av乱码一区二区三区2| 在线观看66精品国产| 99在线视频只有这里精品首页| 男女午夜视频在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 美女福利国产在线|