絲裂霉素抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路對前列腺癌小鼠原位細(xì)胞移植模型的作用與機制研究

常俊鍇 侯俊清 朱朝陽 李曉東 李鐵強 徐衛(wèi)波 趙小磊 趙振華 劉 輝

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)尤其是歐美地區(qū)為高發(fā)區(qū)[1]。目前臨床上對于前列腺癌主要采用內(nèi)分泌治療，但是長期治療中隨著前列腺癌細(xì)胞向著雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，會使得常規(guī)內(nèi)分泌治療失效[2]。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)作為1種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其參與了多條信號通路傳導(dǎo)，mTOR可磷酸化真核細(xì)胞起始因子,進而調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡[3]。PI3K-AKT-mTOR信號通路在前列腺癌細(xì)胞中的異?；罨兄谠黾幽[瘤細(xì)胞的耐藥性，促進腫瘤細(xì)胞的存活[4-5]。臨床前研究結(jié)果顯示，明確靶向PI3K-AKT-mTOR信號通路的抑制劑在多種腫瘤中具有明確的藥理學(xué)效應(yīng)[6]。因此選擇性抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路可作為1種新型的治療前列腺癌的方案。

本研究中我們在小鼠前列腺原位種植前列腺癌細(xì)胞株RM-1,人工制備前列腺癌小鼠原位細(xì)胞移植模型，該模型能夠較好的模擬人轉(zhuǎn)移性前列腺癌，可用于抗癌藥物的篩選。選擇PI3K-AKT-mTOR信號通路及其臨床常用抗生素類化療藥物絲裂霉素作為治療藥物。研究絲裂霉素在治療RM-1原位移植小鼠前列腺癌腫瘤模型中的作用與機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

自ATCC購買小鼠前列腺癌細(xì)胞株RM-1，生長于10%GIBCO胎牛血清RPMI1640完全培養(yǎng)基中，在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，每3天傳代一次。使用0.25%的胰蛋白酶消化傳代細(xì)胞，選取狀態(tài)好且處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化后1 500 rpm離心收集細(xì)胞沉淀，用PBS重懸細(xì)胞，反復(fù)3次，最后一次重懸細(xì)胞后細(xì)胞計數(shù)，稀釋配置成1.0×108個/ml細(xì)胞懸液，使用臺盼藍(lán)染色在顯微鏡下檢測活細(xì)胞比率大于95%。

1.2 動物分組

于揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心購買50只10周齡的C57BL/6雄性小鼠，實驗動物合格證號：SCXK(蘇)2007-0001。體重24～26 g，飼養(yǎng)于SPF級鼠房，小鼠可自由攝取食物和無菌飲用水，待小鼠適應(yīng)環(huán)境之后，隨機分為對照組、假手術(shù)組、模型組和絲裂霉素高低給藥組，每組10只小鼠。

1.3 動物造模

所有小鼠在造模前按3.5 μl/g體重10%水合氯醛麻醉小鼠，將小鼠腹部朝上固定于無菌手術(shù)臺上，切開下腹部顯露出腹腔，在10倍顯微鏡下進行精細(xì)操作，找到小鼠膀胱和生殖腺之后向兩側(cè)推開，暴露前列腺，除對照組和假手術(shù)組外所有小鼠用微量注射器分別向兩側(cè)前列腺側(cè)葉注射RM-1細(xì)胞懸液10 μl，觀察到包膜鼓起并脫離腺體為注射成功標(biāo)志，假手術(shù)組小鼠在前列腺同一位置注入等體積的PBS溶液，對照組小鼠只進行開腹手術(shù)，恢復(fù)所有移動臟器的位置后縫合小鼠腹部切口，待小鼠蘇醒后給予正常飼料和無菌飲水。本研究采用治療給藥方式，原位造模后第二天開始高低給藥組分別按0.2 ml/20 g體重腹腔注射1、2 mg/kg的絲裂霉素PBS溶液，對照組、假手術(shù)組和模型組分別腹腔注射相同體積的PBS，每周給藥兩次。每天定時記錄小鼠體重變化和小鼠狀態(tài)，連續(xù)治療14天。小鼠出現(xiàn)蜷縮，體溫下降等瀕死狀態(tài)時經(jīng)眼眶取血后脫頸處死小鼠，記錄為時間和體重，取小鼠各個臟器及前列腺組織。取前列腺原位癌組織，量取癌組織體積，取各臟器檢測前列腺癌轉(zhuǎn)移情況。

1.4 檢測指標(biāo)

記錄所有組別小鼠在前列腺癌細(xì)胞原位移植造模前和造模治療期間體重變化趨勢，制作體重變化率曲線。同時記錄每組每只小鼠活動狀態(tài)，根據(jù)小鼠疾病活動指數(shù)標(biāo)準(zhǔn)評價每組小鼠活動狀態(tài)。

記錄所有小鼠死亡時間，制作所有組小鼠死亡率曲線。

測定每組中所有小鼠原位前列腺癌組織大小，繪制瘤體積散點圖。

使用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中前列腺癌特異性抗原。鑒定原位移植模型中前列腺癌轉(zhuǎn)移狀態(tài)，及藥物干預(yù)對前列腺癌的轉(zhuǎn)移率的影響作用。

提取小鼠前列腺組織RNA，使用q-PCR法檢測PI3K-AKT-mTOR信號通路關(guān)鍵蛋白基因表達(dá)水平，檢測不同組別小鼠前列腺組織及其前列腺癌組織中基因差異性表達(dá)。

使用western blot法檢測PI3K-AKT-mTOR信號通路中關(guān)鍵調(diào)控蛋白的表達(dá)水平，研究PI3K-AKT-mTOR信號通路在前列腺癌細(xì)胞小鼠原位移植模型中的作用及其給藥干預(yù)后PI3K-AKT-mTOR信號通路在治療中的角色。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多個樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重變化率

除對照組小鼠之外，所有小鼠經(jīng)歷了麻醉后開腹腔和前列腺原位注射手術(shù)，在術(shù)后兩天內(nèi)小鼠體重均有所下降，從第三天開始假手術(shù)組小鼠體重開始顯著回升，兩個給藥組小鼠體重下降率略低于模型組小鼠，在造模后期模型組體重下降最多，其次是低劑量和高劑量給藥組，假手術(shù)組小鼠體重接近于對照組小鼠。

2.2 絲裂霉素治療對前列腺癌小鼠疾病活動指數(shù)(DAI)評分的影響

從結(jié)果來看：模型組小鼠DAI評分高達(dá)(5.4±0.72)，顯著高于對照組(0.15±0.13)和假手術(shù)組(0.3±0.21)(P<0.05),絲裂霉素干預(yù)治療組小鼠DAI指數(shù)顯著下降，與模型組相比差異顯著(P<0.05)。這說明絲裂霉素能夠改善荷瘤小鼠生存狀態(tài)和活動狀態(tài)，見表1。

表1 絲裂霉素治療對前列腺癌小鼠DAI評分的影響

2.3 小鼠死亡率比較

在小鼠原位前列腺癌細(xì)胞移植模型中，在無菌操作臺及SPF飼養(yǎng)條件下小鼠沒有出現(xiàn)感染死亡案例，在手術(shù)操作及小鼠麻醉過程中低劑量組出現(xiàn)了1例死亡，統(tǒng)計所有小鼠在原位注射麻醉蘇醒后小鼠自然死亡案例，其中對照組和假手術(shù)組沒有小鼠死亡，原位注射的模型組在不同時間段出現(xiàn)了5只死亡，實驗結(jié)束時死亡率為50%，低劑量組出現(xiàn)了4只死亡，死亡率為40%，高劑量出現(xiàn)了3只死亡，死亡率為30%，同時絲裂霉素治療組小鼠死亡多發(fā)生在造模中后期，且死亡率較模型組具有較大的差異。具體結(jié)果如下圖1所示。

圖1 每組小鼠死亡率結(jié)果曲線

2.4 小鼠前列腺腫瘤體積散點圖

此次小鼠前列腺原位腫瘤移植模型中，模型組小鼠腫瘤體積顯著增加，絲裂霉素治療組小鼠原位腫瘤體積顯著小于模型組(P<0.05)，說明絲裂霉素能夠有效的抑制小鼠原位腫瘤生長，減輕小鼠的腫瘤負(fù)荷。具體結(jié)果見圖2所示。

圖2 小鼠前列腺腫瘤體積散點圖

2.5 小鼠血清前列腺癌特異性抗原檢測

檢測結(jié)果顯示：模型組小鼠血清中前列腺癌特異性抗原濃度遠(yuǎn)大于對照組，具有顯著性差異(P<0.05)，兩個絲裂霉素給藥組小鼠血清前列腺癌特異性抗原含量較模型組顯著下降(P<0.05)，但仍高于對照組小鼠。具體見下表2。

表2 每組小鼠前列腺癌特異性抗原濃度

2.6 PI3K-AKT-mTOR信號通路相關(guān)蛋白基因表達(dá)情況(表3)

與對照組相比，模型組小鼠前列腺原位腫瘤中PI3K、AKT和mTOR基因的mRNA水平顯著上調(diào)(P<0.05)，給藥治療基因表達(dá)水平較模型組顯著下調(diào)(P<0.05)，但仍沒有達(dá)到對照組水平。

表3 PI3K-AKT-mTOR信號通路相關(guān)蛋白基因表達(dá)水平

2.7 小鼠前列腺原位移植瘤中PI3K-AKT-mTOR信號通路相關(guān)蛋白檢測

western bloting檢測結(jié)果見圖3，結(jié)果顯示，模型組中AKT和mTOR總蛋白水平較對照組顯著下降(P<0.05)，同時模型組中p-AKT和p-mTOR水平顯著上升(P<0.05)，說明在小鼠原位前列腺癌模型中PI3K-AKT-mTOR信號通路處于激活狀態(tài)，給藥治療后AKT和mTOR總蛋白水平較模型組顯著上升(P<0.05)，同時給藥組中p-AKT和p-mTOR水平顯著降低(P<0.05)，說明絲裂霉素治療后能夠有效的抑制原位前列腺癌移植模型中PI3K-AKT-mTOR信號通路的過度激活。量化western blotting結(jié)果見圖4。

圖3 小鼠前列腺原位移植瘤中PI3K-AKT-mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3 討論

前列腺癌在歐美國家的發(fā)病率和死亡率均處于常見惡性腫瘤前列，在我國隨著生活方式的改變，前列腺癌在近些年逐漸成為泌尿系統(tǒng)最主要的疾病。在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中雄性激素具有重要的作用，前列腺癌前期治療中阻斷雄性激素作用明顯，但是在治療后期極易復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌约に胤且蕾囆郧傲邢侔?，增加治療的難度[7]。同時前列腺癌在明確診斷時患者往往已經(jīng)發(fā)生了全身性轉(zhuǎn)移，前列腺腫瘤的原位診斷和轉(zhuǎn)移腫瘤的異質(zhì)性均在很大程度上增加了患者的死亡率[8]。

P13K-Akt-mTOR信號通路參與細(xì)胞周期進程、通過AKT可調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，從而抑制細(xì)胞凋亡，在前列腺癌中抑癌基因PTEN的失活能夠促進血管生成相關(guān)基因的過度表達(dá)，增加腫瘤組織的血管形成.由此可見過度激活的P13K-Akt-mTOR信號通路在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[9-11]。絲裂霉素作為一種細(xì)胞周期非特異性藥物，其能夠有效的抑制DNA復(fù)制，進而阻滯細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖[12]。絲裂霉素目前主要在臨床上用于治療消化道腫瘤或者和化療藥物聯(lián)合治療轉(zhuǎn)移性肺癌和胃癌。本研究中采用前列腺原位注射小鼠前列腺癌細(xì)胞株RM-1，構(gòu)建小鼠前列腺移植腫瘤模型，選擇臨床化療藥物絲裂霉素作為研究藥物，原位注射模型小鼠隨著腫瘤細(xì)胞種植時間的推移，出現(xiàn)明顯體重下降，至造模結(jié)束，小鼠體重僅為初始體重的68%，同時化療治療組小鼠體重后期呈現(xiàn)下降減緩趨勢，說明絲裂霉素能夠有效的抑制前列腺癌細(xì)胞株原位注射造成的小鼠荷瘤負(fù)擔(dān)。這與Thomas[13]的研究具有相似的結(jié)果。前列腺癌作為一種高發(fā)病率和致死率的男性常見惡性腫瘤，存活時間和存活率是評價治療有效性的重要指標(biāo)，正如我們研究結(jié)果所示：小鼠經(jīng)原位注射前列腺癌細(xì)胞株后，在兩周時間內(nèi)模型組出現(xiàn)了50%的死亡率，這符合前列腺癌高致死的基本特征，而絲裂霉素干預(yù)治療組小鼠死亡率明顯下降，同時小鼠的疾病活動指數(shù)也顯著下降，這提示我們絲裂霉素能夠顯著改善荷瘤小鼠的生存狀況，有助于降低小鼠死亡率。絲裂霉素作為一種臨床常用化療藥物，其抑制細(xì)胞周期的作用已被廣泛證明。本研究中絲裂霉素干預(yù)治療能夠有效的抑制腫瘤體積，減輕小鼠荷瘤負(fù)擔(dān)。前列腺癌是一種難確診易轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，很多死亡患者均伴有不同程度的腫瘤轉(zhuǎn)移，本研究中我們檢測了前列腺癌血清轉(zhuǎn)移指標(biāo)前列腺癌特異性抗原，我們發(fā)現(xiàn)在模型組中小鼠血清中含有高濃度的前列腺癌特異性抗原，這提示在原位注射模型中小鼠體內(nèi)前列腺癌發(fā)生了明顯的轉(zhuǎn)移，而干預(yù)治療組前列腺癌特異性抗原濃度顯著下降，說明絲裂霉素能夠有效的抑制原位前列腺癌的全身性轉(zhuǎn)移。綜上結(jié)果可知，絲裂霉素能夠改善小鼠的荷瘤生存狀況，這很有可能是基于絲裂霉素能夠抑制原位前列腺癌細(xì)胞的增殖，顯著的阻滯前列腺癌的全身性轉(zhuǎn)移。基于此，我們研究了與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和腫瘤血管生成相關(guān)的P13K-Akt-mTOR信號通路，已有研究表明P13K-Akt-mTOR信號通路在前列腺癌中是出于顯著激活狀態(tài)，能夠促進腫瘤增殖和腫瘤組織血管生成。我們檢測了小鼠前列腺及其前列腺癌組織P13K、Akt和mTOR蛋白的基因表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)其基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，這與Mathews的[14]研究結(jié)果相似，我們也檢測了相應(yīng)的蛋白表達(dá)水平，同時量化分析了磷酸化蛋白的表達(dá)變化，其結(jié)果與基因表達(dá)相似，在原位前列腺癌模型中P13K-Akt-mTOR信號通路處于顯著激活狀態(tài)，絲裂霉素干預(yù)治療能夠有效的抑制P13K-Akt-mTOR信號通路的激活[15-17]，鑒于此我們認(rèn)為絲裂霉素可能是通過調(diào)節(jié)P13K-Akt-mTOR信號通路進而影響前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展。

圖4 小鼠前列腺原位移植瘤中PI3K-AKT-mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平定量分析

綜上所述：本研究發(fā)現(xiàn)絲裂霉素能夠通過抑制腫瘤細(xì)胞周期進而阻滯腫瘤體積變大，同時絲裂霉素化療治療能夠延長荷瘤小鼠有效生存期，絲裂霉素能夠通過抑制P13K-Akt-mTOR信號通路的激活調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖。