茶多酚對(duì)精索靜脈曲張大鼠生精細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究

杜漢承,林文東,丁小明

(1.泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校解剖教研室，福建 泉州 362011；2.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，福建 泉州 362011)

精索靜脈曲張(varicocele，Vc)表現(xiàn)為精索絨毛狀叢的異常增大，是男性不育癥的主要原因[1]。目前關(guān)于精索靜脈曲張的機(jī)制尚不清楚，最新研究表明，支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞之間的聯(lián)系降低會(huì)導(dǎo)致生殖細(xì)胞凋亡，而波形蛋白為支持細(xì)胞提供保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)，因此在精索靜脈曲張患者中波形蛋白表達(dá)降低會(huì)使細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供給下降，進(jìn)而引起生殖細(xì)胞凋亡[2]。細(xì)胞色素c(cytochrome c，Cyt-c)是氧化過程中的關(guān)鍵蛋白，Cyt-c的降低會(huì)引起線粒體功能異常，并誘導(dǎo)生精細(xì)胞過度凋亡[3]。茶多酚(tea polyphenol，TP)是一種強(qiáng)效抗氧化劑，可以防止許多細(xì)胞系和動(dòng)物模型中的氧化應(yīng)激及DNA損傷[4]。有研究顯示，茶多酚可以緩解氧化應(yīng)激引起的生殖細(xì)胞損傷[5]。但是茶多酚對(duì)精索靜脈曲張的影響以及作用機(jī)制仍不清楚。本研究主要分析茶多酚對(duì)精索靜脈曲張模型大鼠生精細(xì)胞凋亡及波形蛋白、Cyt-c蛋白表達(dá)的影響，并分析其作用機(jī)制，為臨床治療精索靜脈曲張?zhí)峁┬碌膮⒖挤桨浮?/p>

1 材料與方法

1.1 主要材料

清潔級(jí)SD大鼠(合格證號(hào)：2015000553055)，雄性，6周齡，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，無(wú)菌飼養(yǎng)于泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校的SPF級(jí)屏障系統(tǒng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)[許可證號(hào)：SYXK(閩)2016-0001]，保持溫度23～25 ℃、相對(duì)濕度25%左右。

茶多酚(Selleck公司，中國(guó))，TUNEL染色試劑盒(碧云天公司，中國(guó))，顯微鏡(Olympus公司，日本)，氧化應(yīng)激試劑盒(三工生物技術(shù)有限公司，中國(guó))，組織勻漿機(jī)(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))，TRIzol(Sigma公司，美國(guó))，Prime Script-RT和SYBR Premix Ex Taq試劑盒(Takara公司，日本)，RIPA裂解緩沖液(Beyotime公司，中國(guó))，BCA試劑盒(武漢博斯特生物技術(shù)有限公司，中國(guó))，抗體(Abcam公司，美國(guó))，PVDF膜(Bio-Rad公司，美國(guó))。

1.2 動(dòng)物分組、建模和干預(yù)

將36只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、Vc組和Vc+TP組，每組12只。Vc組和Vc+TP組通過左腎靜脈結(jié)扎構(gòu)建精索靜脈曲張模型[6]，具體方法如下：大鼠腹腔注射5%水合氯醛進(jìn)行麻醉，切開腹直肌暴露左側(cè)腎，部分結(jié)扎左側(cè)腎靜脈，使腎靜脈內(nèi)徑狹窄。對(duì)照組僅切開腹腔暴露左側(cè)腎靜脈但不結(jié)扎。Vc+TP組采用茶多酚灌胃，劑量為40 mg/kg[7]，每日1次，持續(xù)4周；對(duì)照組和Vc組以等量生理鹽水灌胃，持續(xù)4周。

1.3 HE染色觀察睪丸組織損傷

干預(yù)后，所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥，斷頭處死后取出睪丸組織；用4%多聚甲醛固定，再用梯度乙醇脫水；經(jīng)石蠟包埋，制成厚度為4 μm的切片并制作玻片標(biāo)本；加入蘇木精室溫孵育10 min，然后加入0.5%曙紅溶液室溫孵育3 min，顯微鏡下觀察。

1.4 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取按照1.3方法制作的睪丸組織玻片標(biāo)本，根據(jù)TUNEL試劑盒說明書加入TUNEL反應(yīng)液試劑與底物二氨基聯(lián)苯胺進(jìn)行反應(yīng)染色，然后在顯微鏡的高倍鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野，計(jì)算凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

將睪丸組織制作成組織勻漿，以3 000 r/min的速度離心25 min，根據(jù)氧化應(yīng)激試劑盒檢測(cè)丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平。

1.6 RT-qPCR檢測(cè)mRNA表達(dá)

使用TRIzol提取睪丸組織中總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒逆轉(zhuǎn)錄1 μg RNA用于合成cDNA(42 ℃下60 min，70 ℃下5 min，4 ℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix和PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)(95 ℃下10 s，50 ℃下30 s，72 ℃下30 s，40個(gè)循環(huán)，4 ℃保存)。將GAPDH作為內(nèi)參，通過比較循環(huán)閾值大小分析mRNA的表達(dá)水平。

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

將所有的睪丸組織用勻漿機(jī)均勻研磨后萃取總蛋白，通過BCA試劑盒測(cè)量濃度。各組分別取40 μg總蛋白，用10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳(80～120 V，90 min)，在100 mV恒定電壓下與PVDF膜進(jìn)行濕轉(zhuǎn)移，在5%牛血清白蛋白中室溫孵育1 h。將1∶500稀釋的anti-CaSR、anti-PI3K和anti-AKT添加到分離的蛋白中，4 ℃孵育過夜。洗滌后在室溫下添加二抗孵育1 h，然后加入化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影。利用GAPDH作內(nèi)參，用Image J軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 茶多酚對(duì)精索靜脈曲張大鼠睪丸組織的影響

睪丸組織切片HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組生精小管內(nèi)的生精細(xì)胞排列有序，管腔中有精子；Vc組出現(xiàn)廣泛的上皮損傷，液腔，生精細(xì)胞無(wú)序分布，睪丸生精功能明顯受損；Vc+TP組損傷情況明顯輕于Vc組，生精細(xì)胞排列基本有序，管腔中有少量精子(圖1)。

2.2 茶多酚對(duì)精索靜脈曲張大鼠生精細(xì)胞凋亡的影響

3組間凋亡指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組有少量的TUNEL陽(yáng)性生精細(xì)胞，凋亡指數(shù)為(5.21±0.86)%；Vc組可廣泛觀察到TUNEL陽(yáng)性生精細(xì)胞，凋亡指數(shù)為(21.09±1.82)%，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；Vc+TP組TUNEL陽(yáng)性生精細(xì)胞較Vc組少，凋亡指數(shù)為(12.36±1.05)%，顯著低于Vc組(P<0.05)，見圖1。

黑色箭頭：損傷上皮；紅色箭頭：陽(yáng)性生精細(xì)胞，表示細(xì)胞凋亡

2.3 茶多酚對(duì)精索靜脈曲張大鼠氧化應(yīng)激水平的影響

3組間MDA和SOD水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Vc組MDA水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，SOD水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；Vc+TP組MDA水平顯著低于Vc組(P<0.05)，SOD水平顯著高于Vc組(P<0.05),見表1。

表1 茶多酚對(duì)精索靜脈曲張大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

2.4 茶多酚對(duì)精索靜脈曲張大鼠波形蛋白、Cyt-c mRNA的影響

3組間波形蛋白、Cyt-c mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Vc組波形蛋白mRNA顯著低于對(duì)照組及Vc+TP組(P<0.05)，而Cyt-c mRNA顯著高于對(duì)照組及Vc+TP組(P<0.05)，見表2。

表2 茶多酚對(duì)精索靜脈曲張大鼠波形蛋白、Cyt-c mRNA的影響

2.5 茶多酚對(duì)精索靜脈曲張大鼠波形蛋白、Cyt-c蛋白表達(dá)的影響

3組間波形蛋白、Cyt-c蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Vc組波形蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組及Vc+TP組(P<0.05)，而Cyt-c蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組及Vc+TP組(P<0.05)，見圖2、表3。

圖2 大鼠睪丸組織Western blot檢測(cè)結(jié)果

表3 茶多酚對(duì)精索靜脈曲張大鼠波形蛋白、Cyt-c蛋白的影響

3 討論

健康男性人群中精索靜脈曲張的發(fā)生率為15%～20%，且35%～50%的原發(fā)性不育男性和80%的繼發(fā)性不育男性皆患有精索靜脈曲張[8]。靜脈曲張切除術(shù)是治療精索靜脈曲張引起的男性不育的最常用技術(shù)，然而其手術(shù)效果有限。有研究顯示，經(jīng)靜脈切除術(shù)治療的精索靜脈曲張患者精液相關(guān)指標(biāo)僅改善了50%～80%，表明精索靜脈曲張切除術(shù)不能完全恢復(fù)患者生育能力[9]。

精索靜脈曲張主要是由精索靜脈瓣功能異常、靜脈血管損傷等引起的靜脈回流損傷，其通過引起組織灌注異常，導(dǎo)致含氧量降低和氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而引起支持細(xì)胞和生精細(xì)胞損傷，其中氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致精索靜脈曲張和生精細(xì)胞損傷的關(guān)鍵機(jī)制。研究顯示，茶多酚作為一種有效的抗氧化劑，可以緩解心肌缺血引起的心功能受損[10]；在腦缺血大鼠中，氧化應(yīng)激是引起炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的主要原因，而茶多酚可以通過減少氧化應(yīng)激損傷保護(hù)血腦屏障功能，從而緩解神經(jīng)元凋亡[11]。也有研究顯示，茶多酚對(duì)生殖細(xì)胞損傷的修復(fù)有一定作用，其可以減少由鋁引起的睪丸中支持細(xì)胞的損傷和凋亡，從而保護(hù)睪丸的功能[12]，還可以通過緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)提高精液中精子濃度，改善精子活力和形態(tài)，從而提高精子質(zhì)量[13]。但是茶多酚對(duì)精索靜脈曲張的影響尚不明確，本研究通過部分結(jié)扎左側(cè)腎靜脈構(gòu)建大鼠精索靜脈曲張模型，并經(jīng)茶多酚灌胃治療，結(jié)果顯示茶多酚可以明顯緩解氧化應(yīng)激損傷，抑制生精細(xì)胞和支持細(xì)胞的凋亡，從而緩解精索靜脈曲張。

為進(jìn)一步分析茶多酚治療精索靜脈曲張的機(jī)制，本研究檢測(cè)了波形蛋白mRNA和蛋白、Cyt-c mRNA和蛋白的表達(dá)水平。Cyt-c主要存在于線粒體中，而線粒體是有氧呼吸的主要場(chǎng)所，灌注不足、氧氣含量降低和活性氧自由基升高會(huì)直接引起線粒體功能受損、線粒體外膜通透性改變，進(jìn)而引起Cyt-c的外流[14]。線粒體損傷不但會(huì)加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，也會(huì)直接導(dǎo)致線粒體途徑的凋亡，從而誘導(dǎo)生精細(xì)胞和支持細(xì)胞凋亡[15]。有研究顯示，減輕線粒體損傷可以緩解精索靜脈曲張引起的生精細(xì)胞凋亡[16]。波形蛋白是重要的支持蛋白，在維持睪丸中支持細(xì)胞的功能和形態(tài)上發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且波形蛋白也具有連接支持細(xì)胞和生精細(xì)胞的作用[17]。氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)降低波形蛋白的表達(dá)[18]，而波形蛋白表達(dá)的降低會(huì)減少支持細(xì)胞和生精細(xì)胞的連接，抑制支持細(xì)胞的增殖，從而誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡[19]。本研究結(jié)果顯示，精索靜脈曲張大鼠睪丸中Cyt-c水平升高而波形蛋白水平明顯降低，茶多酚干預(yù)后Cyt-c水平降低而波形蛋白水平升高，提示茶多酚可能通過提高波形蛋白的表達(dá)恢復(fù)細(xì)胞正常形態(tài)和功能，并減少細(xì)胞的凋亡。還有研究顯示，茶多酚可以保護(hù)線粒體功能，抑制Cyt-c水平，從而減輕胰腺的氧化應(yīng)激損傷[20]。張玉森等[21]的研究顯示，茶多酚可以通過保護(hù)線粒體功能緩解阿爾茨海默癥大鼠的神經(jīng)損傷。這提示茶多酚可以通過抑制活性氧調(diào)控氧化應(yīng)激水平，從而保護(hù)線粒體功能、抑制Cyt-c的外流及細(xì)胞凋亡；此外，茶多酚也可以促進(jìn)波形蛋白的表達(dá)，從而增加支持細(xì)胞與生精細(xì)胞之間的連接，保護(hù)生精細(xì)胞的功能，促進(jìn)精子生成，緩解精索靜脈曲張。

綜上所述，茶多酚可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)線粒體功能并促進(jìn)波形蛋白表達(dá)，從而抑制生精細(xì)胞的凋亡和睪丸損傷，發(fā)揮緩解精索靜脈曲張的作用。但是關(guān)于茶多酚對(duì)精索靜脈曲張的療效仍需臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，其調(diào)控的分子機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。