核桃群體核仁脂肪酸組成分析

王貴芳，相昆，穆清泉，韓玉濤，張美勇，徐穎，許海峰，劉慶忠，陳新

(1.山東省果樹研究所/國家果樹種質(zhì)核桃板栗資源圃，山東 泰安 271000；2.臨沂市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 臨沂 276012；3.臨沂市檢驗檢測中心，山東 臨沂 276000)

核桃 (JuglansregiaL.) 為核桃科核桃屬多年生落葉喬木，是世界著名的四大干果之一，同時也是世界重要的木本油料樹種之一。核桃在中國栽培地域廣泛，歷史悠久，栽培面積大，綜合利用范圍廣。其堅果富含氨基酸、脂肪酸及礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，具有較高的食用價值和醫(yī)療保健價值。前人研究證實核桃的保健價值主要在于核桃仁中富含豐富的不飽和脂肪酸，如亞油酸、α-亞麻酸及油酸等[1,2]。核桃中的不飽和脂肪酸在降低膽固醇、預(yù)防和緩解心腦血管疾病、糖尿病和肥胖癥方面具有重要功效[3-7]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，生活水平不斷提升，人們更關(guān)注是否吃得健康，核桃作為一種天然營養(yǎng)保健食品，備受消費(fèi)者青睞。

國內(nèi)核桃主栽品種良莠不齊，導(dǎo)致在品質(zhì)表現(xiàn)上與發(fā)達(dá)國家如美國、法國等的核桃有一定差距，因此，選育優(yōu)質(zhì)核桃新品種成為科學(xué)家的主要育種目標(biāo)。分析研究核桃脂肪酸構(gòu)成因子及其相關(guān)性，對不同品種進(jìn)行品質(zhì)評價，可以為選育優(yōu)質(zhì)核桃新品種提供理論參考。陳振超等[8]選取7種木本油料樹種，測定了油脂相關(guān)指標(biāo)(脂肪酸組成、角鯊烯、β-谷甾醇和α-生育酚)，結(jié)果表明茶籽油棕櫚酸含量(16.22%)最高，油茶籽油的油酸含量(80.55%)最高，核桃油的亞油酸含量(59.13%)最高。駱翔等[9]以66個不同地理來源的核桃品種為試材，研究了脂肪酸含量、蛋白質(zhì)含量、產(chǎn)量相關(guān)性狀間的關(guān)系，表明脂肪酸含量與蛋白質(zhì)含量在0.01水平上顯著負(fù)相關(guān)，但并未對其脂肪酸組成進(jìn)行研究。蘇彥蘋等[10]采用索氏抽提法和氣相色譜法測定26份不同基因型新疆核桃的脂肪含量及脂肪酸組成，結(jié)果表明新疆核桃脂肪酸主要包括 C16∶0、C18∶0、C20∶0、順C18∶1n9c、C20∶1、順C18∶2n6c及αC18∶3n3，且部分基因型新疆核桃間脂肪含量差異顯著。費(fèi)昭雪和彭少兵[11]通過對陜南11份核桃外觀性狀、營養(yǎng)成分以及核桃油中脂肪酸的組成與含量進(jìn)行測定，并應(yīng)用主成分分析和聚類分析對不同產(chǎn)地的核桃油脂性狀進(jìn)行評價，結(jié)果表明不同產(chǎn)地核桃油脂的脂肪酸組成基本一致，主要含有亞油酸，其次是油酸、亞麻酸和棕櫚酸，硬脂酸含量較低；不飽和脂肪酸含量遠(yuǎn)高于飽和脂肪酸，不同樣品間各脂肪酸含量有顯著差異。

本研究以53份核桃種質(zhì)(48個優(yōu)良單株、無性系及國內(nèi)品種，5個引進(jìn)品種)為試材，通過回歸分析、聚類分析、主成分分析研究了核桃脂肪酸組分群體水平上的表型變異、組分間的相關(guān)性、群體結(jié)構(gòu)效應(yīng)對脂肪酸組分的影響，旨在為選育脂肪含量高、脂肪酸組成及比例合理的核桃品種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試材選取山東省果樹研究所金牛山核桃種質(zhì)資源圃的53份核桃種質(zhì)(表1)，主要為近年來國內(nèi)外育成品種和資源考察過程中收集的農(nóng)家品系。采用隨機(jī)區(qū)組試驗設(shè)計，每份材料3株，株行距 3 m×4 m。 2019年9月果實成熟時，每株隨機(jī)采集發(fā)育正常的果實10個(每份種質(zhì)共30個)，自然曬干，剝殼，取仁，將核仁混合裝，用于脂肪酸檢測。

1.2 脂肪酸含量測定

采用索氏抽取法提取油脂：準(zhǔn)確稱取5.00 g核仁樣品放入濾紙包中，用無水乙醚提取8 h后取出濾紙包于45℃烘箱中烘干，留取油樣用于脂肪酸含量(%)測定。

采用氣相色譜法測定脂肪酸組分及含量：取上述油樣100 μL于10 mL具塞試管中，加入1 mL甲酯化試劑(0.5 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液)和2 mL乙醚，放置2 h；隨后加入5 mL蒸餾水將溶液分層，分離獲得有機(jī)相，備用。取1 mL有機(jī)相，使用氣相色譜，采用內(nèi)標(biāo)法測定脂肪酸組分及相對含量。標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜條件：色譜柱AB-FFAP彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：初始柱溫50℃保持1 min，之后以15 ℃/min升至200℃并保持45 min；氣化溫度為250℃；FID檢測器溫度270℃；載氣為氮?dú)?，壓?37.9 kPa；橫流模式，分流比為20∶1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

核桃脂肪酸含量變異及相關(guān)分析采用SPSS 19.0(IBM Corp.，Armonk，NY，USA)軟件。聚類分析采用R(https://cran.r-project.org/)中的“hclust”命令[12]；聚類分析熱圖的繪制采用R中的“pheatmap”包；主成分分析采用R中的“prcomp”功能[13]；樣本間t測驗采用R中的“ggpubr”包；相關(guān)回歸分析采用R中的“l(fā)m_eqn”包。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃不同品種核仁脂肪酸組分檢測

通過對53份核桃種質(zhì)的核仁脂肪酸組分測定，共檢測到亞油酸、油酸、亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚油酸、花生烯酸7種組分，總含量可達(dá)核仁油脂總量的99%以上(表1)。其中，亞油酸、油酸、亞麻酸和棕櫚酸為核仁脂肪酸的主要構(gòu)成成分(表2)，變異幅度分別為55.93%～69.74%、10.98%～29.32%、5.81%～13.92%和4.80%～7.44%；亞油酸變異系數(shù)最小，其次為棕櫚酸，分別為0.05和0.08；油酸和亞麻酸變異系數(shù)較大，分別為0.25和0.19。棕櫚油酸和花生烯酸平均含量較少，分別僅占0.13%和0.21%，變異系數(shù)分別為0.12和0.13。綜合表2和圖1結(jié)果，群體水平上同一種植區(qū)核桃品種核仁亞油酸和棕櫚酸含量變異相對較穩(wěn)定；油酸及亞麻酸變異幅度較大，具備較大的改良空間。

表1 核桃群體核仁脂肪酸組分統(tǒng)計 (%)

表2 核桃群體核仁脂肪酸組分描述性統(tǒng)計

2.2 核桃不同品種核仁脂肪酸組分相關(guān)性分析

由表3可見，棕櫚油酸與油酸顯著正相關(guān)(P<0.01)，而與亞油酸、亞麻酸、花生烯酸顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；油酸與亞油酸、亞麻酸顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到-0.91和-0.61；花生烯酸與棕櫚酸顯著負(fù)相關(guān)，而與硬脂酸顯著正相關(guān)(P<0.01)；其余脂肪酸組分間無顯著相關(guān)性?？梢?，提高油酸含量有助于增加棕櫚油酸的含量，但抑制亞油酸和亞麻酸含量的提高?；貧w分析(圖2)表明，油酸可以分別解釋亞麻酸和亞油酸表型變異的37.0%和82.5%。綜上，改良亞油酸時應(yīng)兼顧油酸與棕櫚油酸的含量；考慮到花生烯酸、棕櫚油酸及硬脂酸占比較少，在改良核桃油脂性狀時可以優(yōu)先考慮棕櫚酸。

圖1 核桃群體的核仁脂肪酸組分表型變異

表3 核桃群體核仁脂肪酸組分間的相關(guān)性

2.3 群體結(jié)構(gòu)分析

主成分分析的目的之一就是利用原變量間具有較強(qiáng)相關(guān)性的特點(diǎn)進(jìn)行降維，用少量的因素來描述多種指標(biāo)或因素之間的關(guān)系。由圖3可見，棕櫚油酸、花生烯酸、棕櫚酸和硬脂酸聚為一類，與油酸、亞油酸及亞麻酸分開。結(jié)合表型變異信息，證實亞油酸、油酸、亞麻酸和棕櫚酸為影響種群結(jié)構(gòu)的主要因子。

基于亞油酸、油酸、亞麻酸和棕櫚酸進(jìn)行聚類，53份核桃種質(zhì)可以分為兩個亞群——group_1和group_2，group_1包含28個材料，group_2包含25個材料(圖4A)。t測驗結(jié)果(圖4B)表明，亞油酸、油酸和亞麻酸含量在兩個亞群間存在顯著差異(P< 0.01)，棕櫚酸兩個亞群間無顯著差異。group_1的亞油酸和亞麻酸含量顯著高于group_2，但油酸含量顯著低于group_2。可見，要培育高亞油酸和亞麻酸含量的核桃新品種時可以從group_1中選取材料進(jìn)行雜交，而要選育高油酸含量的核桃新品種時可基于group_2中的材料進(jìn)行雜交。

圖2 核桃群體核仁脂肪酸組分間相關(guān)回歸分析結(jié)果

圖3 核桃群體核仁脂肪酸組分主成分分析

3 討論

本研究對53份核桃種質(zhì)的脂肪酸組分進(jìn)行測定，共檢測到亞油酸、油酸、亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚油酸及花生烯酸7種成分，總含量可達(dá)核仁油脂總量的99%以上，其中，亞油酸、油酸、亞麻酸和棕櫚酸為核桃脂肪酸組成的主要決定因子，這與費(fèi)昭雪等[11]的研究結(jié)果一致。核桃脂肪含量、脂肪酸組成及質(zhì)量分?jǐn)?shù)受產(chǎn)地等自然環(huán)境因素影響較大[14-16]，本研究結(jié)果也顯示，不同來源種質(zhì)的脂肪酸組分含量存在差異，尤其油酸和亞麻酸變異幅度較大，具備較大的改良空間，因此，在評估脂肪酸組分分子遺傳效應(yīng)，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種時應(yīng)考慮環(huán)境因子的影響。核桃種質(zhì)核仁的亞油酸含量變異較穩(wěn)定，王曉燕等[17]對西藏核桃核仁的研究也得到類似結(jié)果?？梢姡煌N質(zhì)核桃核仁在功能性物質(zhì)合成上具有一定差異，種質(zhì)間存在著明顯的分層結(jié)構(gòu)，從而影響核仁脂肪酸組分含量的表型變異，精確解析其群體結(jié)構(gòu)特征，可為選育優(yōu)質(zhì)核桃新品種提供理論參考。

4 結(jié)論

從核桃核仁中可以檢測出亞油酸、油酸、亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚油酸及花生烯酸7種脂肪酸，其中亞油酸、油酸、亞麻酸和棕櫚酸是其脂肪酸構(gòu)成的主要決定因子；群體水平上亞油酸含量變異相對穩(wěn)定，而油酸和亞麻酸變異較大，改良潛力較大。試驗的53份核桃種質(zhì)可聚為兩個亞群，第一亞群的亞油酸和亞麻酸含量顯著高于第二亞群，而第二亞群的油酸含量顯著高于第一亞群，且相關(guān)分析表明油酸與亞油酸、亞麻酸顯著負(fù)相關(guān)，因此，今后在選育核桃新品種時可以根據(jù)不同需求側(cè)重不同的目標(biāo)性狀。本研究結(jié)果可為選育脂肪含量高、脂肪酸組成及比例合理的核桃新品種提供一定的理論參考。

圖4 核桃群體聚類分析(A)及不同亞群間脂肪酸組分差異性分析(B)