基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討橘皮竹茹湯治療胃食管反流病的作用機制

王小雙，魏文峰，霍金海，王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學院中藥研究所·黑龍江 哈爾濱 150036)

橘皮竹茹湯出自于東漢末年張仲景《金匱要略·嘔吐下利病脈證治》，由陳皮、竹茹、生姜、大棗、人參、甘草6味藥組成，是現(xiàn)在臨床治療胃虛有熱之嘔逆的代表方劑。大量臨床研究證實，橘皮竹茹湯治療胃食管反流病具有良好的療效[1-3]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學的系統(tǒng)性、整體性的研究理念與中藥復方多組分、多靶點、協(xié)同作用等特點不謀而合，國內(nèi)外眾多學者采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法對中藥單味藥、藥對、復方治療抑郁癥、癌癥、骨關(guān)節(jié)炎等多種疾病進行研究[4-6]。本文以橘皮竹茹湯治療胃食管反流病為研究對象，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法通過構(gòu)建中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，預測作用靶點，為深入探討橘皮竹茹湯治療胃食管反流病的作用機制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 橘皮竹茹湯化學成分的整理與篩選 本課題組通過采用超高效液相色譜儀聯(lián)用四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)對橘皮竹茹湯的化學物質(zhì)成分進行鑒別，共鑒別出化學物質(zhì)成分141種。參照實驗室前期體外化學成分的分析數(shù)據(jù)，整理每個化學成分的CAS號、Chamical name、InChIKey，建立橘皮竹茹湯化學成分數(shù)據(jù)庫。利用TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)平臺，得出每一化合物的ADME性質(zhì)，選擇同時滿足 OB≥30%、DL≥0.18 的化學成分作為候選的活性成分。

1.2 成分作用靶點的獲取 經(jīng)過篩選的活性成分通過ChemDraw Ultra 12.0 軟件繪制結(jié)構(gòu)圖，并以SDF 格式保存。分別上傳至PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)服務(wù)器，獲得虛擬篩選結(jié)果(前300個靶點)。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(http: / /www.Uniprot.org /)進行標準化，得到化合物對應(yīng)關(guān)鍵靶點的基因號。

1.3 疾病相關(guān)靶點的篩選 通過Drugbank(https://www.drugbank.ca/)數(shù)據(jù)庫，以gastroesophageal reflux disease(GERD)、reflux esophagitis為檢索詞，獲取FDA 批準的小分子治療胃食管反流病相關(guān)藥物靶點。上述檢索詞通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)分別檢索 2 大數(shù)據(jù)庫中與胃食管反流病相關(guān)的靶基因。最后使用Bioinformatics平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)將橘皮竹茹湯有效成分的靶點與疾病相關(guān)靶點進行擬合篩選，繪制venn圖獲得橘皮竹茹湯具有治療胃食管反流病的作用靶點。

1.4 橘皮竹茹湯成分-胃食管反流靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將橘皮竹茹湯成分與胃食管反流交集靶點提交至 STRING11.0 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)模型(PPI)，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”(>0.9)，其余設(shè)置均為默認設(shè)置，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，并通過CytoScape3.6.1中MCODE插件識別PPI網(wǎng)絡(luò)內(nèi)在module，得到潛在蛋白質(zhì)功能模塊。

1.5 生物功能和通路分析 將篩選得到的作用靶點導入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫， 對橘皮竹茹湯作用靶點進行 GO(gene ontology)富集分析以及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代謝通路富集分析。設(shè)定閾值P<0.05并按照涉及的靶點數(shù)目進行排序，篩選排名靠前的生物過程和通路，并對數(shù)據(jù)結(jié)果進行可視化。

1.6 橘皮竹茹湯處方組成-活性成分-胃食管反流靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 運用 CytoScape3.6.1 構(gòu)建橘皮竹茹湯中藥-活性成分-胃食管反流靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，利用 CytoScape3.6.1 內(nèi)置工具分析有效成分及靶點的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，包括連接度(Degree)、介度(BetweennessCentrality)及緊密度(ClosenessCentrality)等，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學參數(shù)判斷核心靶點及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

2 結(jié)果

2.1 橘皮竹茹湯活性成分 前期本課題組利用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)鑒別體外成分141個，通過TCSMP數(shù)據(jù)庫查找每個成分的OB和DL值，根據(jù)藥代動力學的方法設(shè)置 OB≥30% 和 DL≥0.18，通過OB與DL的篩選得到橘皮竹茹湯的活性成分24個，見表1。其中陳皮成分3個，甘草成分17個，竹茹成分1個，人參成分2個，生姜成分2個，大棗成分3個，竹茹和人參共有成分1個(beta-sitosterol)，甘草和生姜共有成分1個(sitosterol)，甘草和大棗共有成分2個(Mairin、quercetin)。

表1 橘皮竹茹湯中篩選的24個成分信息

2.2 橘皮竹茹湯中治療胃食管反流病活性成分潛在靶蛋白信息 將上述24個橘皮竹茹湯活性成分通過 Pharm-Mapper分析平臺進行反向分子對接實驗，預測出24個化學成分的作用靶點。將所有靶點名稱校正為該靶點的基因名稱，共得到421個基因靶點。將DrugBank，GeneCards 和 DisGeNET 3個數(shù)據(jù)庫檢索得到的靶點取交集即確定為胃食管反流病相關(guān)靶點，共得到251個胃食管反流病靶點。通過韋恩圖找出橘皮竹茹湯和胃食管反流病共同靶基因，共24個，見圖 1。

圖1 疾病靶點與活性成分靶點的匹配

2.3 橘皮竹茹湯成分-胃食管反流靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將橘皮竹茹湯和胃食管反流病交集靶點提交至STRING11.0平臺，得到橘皮竹茹湯靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2(A)。得到PPI網(wǎng)絡(luò)后，運Cytoscape3.6.1中的MCODE插件對蛋白相互作用關(guān)系進行分析，得到module，見圖2(B)。

圖2 橘皮竹茹湯-胃食管反流靶點PPI網(wǎng)絡(luò)與module

2.4 靶點功能與通路的富集分析 為系統(tǒng)地闡明橘皮竹茹湯治療胃食管反流病的多種作用機制，從生物學過程，分子功能和細胞成分3 個方面對作用靶點進行了GO富集分析，同時進行KEGG分析得到43條通路，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，與橘皮竹茹湯靶點密切相關(guān)的生物學過程：信號轉(zhuǎn)導、基因表達負調(diào)控、ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)節(jié)、細胞增殖正調(diào)控和MAPK梯級等；分子功能：鈣離子結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性和內(nèi)肽酶活性等；細胞組分：質(zhì)膜、胞漿、和胞外區(qū)等。這表明橘皮竹茹湯可能通過參與上述生物過程、分子功能和細胞成分而起作用。KEGG分析結(jié)果顯示，主要涉及MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、FOXo信號通路和Rap1信號通路等。將KEGG通路中去除廣泛信號通路，然后將富集基因數(shù)目較多的信號通路合并，見表2。

表2 橘皮竹茹湯作用靶點KEGG信號通路

圖3 橘皮竹茹湯作用靶點富集分析結(jié)果

2.5 中藥-活性成分-作用靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運用 Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建橘皮竹茹湯中藥-活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，如圖 4 所示。通過 CytoScape3.6.1 內(nèi)置的Network Analyzer分析橘皮竹茹湯治療胃食管反流網(wǎng)絡(luò)拓撲學參數(shù)，可得到主要活性成分及核心靶點。

結(jié)果表明，白樺脂酸連接度(degree)為20，介度(Betweenness Centrality)為，0.0238，緊密度 (Closeness Centrality)為0.5431，預測白樺脂酸為橘皮竹茹湯治療胃食管反流主要成分，其次植物甾醇(連接度：20介度：0.0011緊密度：0.5431)、β-谷甾醇(連接度：19介度：0.0619緊密度：0.5338)、黃柏酮(連接度：19介度：0.0297緊密度：0.5338)，見表3。

表3 橘皮竹茹湯主要活性成分網(wǎng)絡(luò)拓撲學參數(shù)

EGFR連接度為29，介度為0.0345，緊密度為0.6176，認為EGFR是橘皮竹茹湯治療胃食管反流最主要的靶點，同時MAP2K1、HRAS、BRAF、ACE、ESR1、HDAC8、IGF1R是相對重要靶點。

■處方組成 ；●活性成分；◆作用靶點；富集通路圖4 橘皮竹茹湯中藥-活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

本研究通過前期的體外成分分析及TCSMP中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺按OD≥0.18，OB≥30%條件篩選出橘皮竹茹湯24個潛在活性成分，構(gòu)建了中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，分析橘皮竹茹湯活性成分、靶點及疾病的相互作用關(guān)系。橘皮竹茹湯治療胃食管反流病作用靶點24個。其中，細胞色素P450單加氧酶(CYP2C8、CYP2C9)是一類可以參與各種內(nèi)源性底物代謝的蛋白，包括脂肪酸、類固醇激素和維生素等[7]，而同樣是細胞色素P450家族的CYP2C19已有研究表明[8]，其基因的多態(tài)性對質(zhì)子泵抑制劑代謝有直接影響，從而影響GERD的治療效果，這提示我們橘皮竹茹湯可能作用于CYP2C8、CYP2C9靶點同樣可以影響質(zhì)子泵抑制劑代謝，從而達到治療GERD的效果。表皮生長因子受體(EGFR)是一種蛋白質(zhì)編碼基因，與EGFR相關(guān)的疾病包括炎癥性皮膚和腸道疾病等。同時研究發(fā)現(xiàn)[9]，病變胃黏膜組織中EGFR的蛋白表達量高于非病變胃黏膜組織，猜測橘皮竹茹湯可能是通過抑制EGFR表達達到治療目的。橘皮竹茹湯活性成分通過上述靶點相互作用，來達到“降逆止嘔，益氣清熱”的作用。

KEGG分析結(jié)果顯示，主要涉及MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、FOXo信號通路和Rap1信號通路等。Rap1是一種小分子G蛋白，表現(xiàn)為有活性和無活性結(jié)合形式兩種構(gòu)象，它通過不同效應(yīng)子抑制或激活ERK通路[10]。ERK也稱絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)，是一種小分子G蛋白酶，在細胞對各種應(yīng)激反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，參與調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡[11]。其信號通路主要由3個亞族組成，分別是：ERK亞族、JNK亞族、P38亞族[12]。Souza RF等發(fā)現(xiàn)GERD患者與正常人在食管鱗狀細胞的ERK1/2-MAPK表達存在顯著差異[13]。胃酸反流可能激活正常食管鱗狀細胞的ERK1/2，從而增加其增殖并阻止向腸型細胞分化。同時有研究表明，GERD患者胃黏膜內(nèi)IL-8表達量遠高于正常人[14-16]，而正常人食管上皮細胞受到胰蛋白酶刺激的同時加入MAPK抑制劑和ERK抑制劑可以降低IL-8炎癥趨化因子的mRNA及蛋白表達[17]，進而恢復胃黏膜功能。橘皮竹茹湯可能通過該通路抑制IL-8因子表達和阻止食管鱗狀細胞增殖與分化，從而治療胃食管反流病。

FoxO是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞增殖、分化和凋亡等細胞過程[18]。FoxO家族主要受PI3K-Akt通路調(diào)控[19-20]，通過磷酸化/去磷酸化改變FoxO4的亞細胞定位[21]，而FoxO4轉(zhuǎn)錄因子在人類胃腸道的粘膜層腺體細胞胞漿進行表達[22]。同時，F(xiàn)oxO可以抑制NF-KB轉(zhuǎn)錄因子的活化[23-24]，NF-KB是一種參與許多炎癥因子表達調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子[25]。有研究表明，胃食管反流通過NFKB介導的炎癥破壞食管粘膜屏障功能[26]，而FoxO4通過作用于NF-KB轉(zhuǎn)錄因子對炎癥因子有抑制作用，從而對組織的炎癥有保護作用[27]。橘皮竹茹湯可能通過該通路抑制炎癥因子的表達，在胃食管反流病的炎癥免疫和發(fā)生過程方面起重要作用。

PI3K/AKT 是細胞生存中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，與細胞的增殖、轉(zhuǎn)化、凋亡和腫瘤發(fā)生有重要作用[28]。金立鵬[29]利用HCl構(gòu)建食道鱗狀細胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)通過上調(diào)ERK和AKT/PI3K 信號通路的活性能夠減輕HCl 誘導帶來的細胞損傷。同時在食管相關(guān)疾病中也發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路表達異常[30]。表明PI3K/AKT信號通路與食管相關(guān)疾病密切相關(guān)。

綜上所述，橘皮竹茹湯治療胃食管反流病具有多成分、多靶點、多通路特點，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學分析平臺對橘皮竹茹湯中六味中藥成分靶點及胃食管反流病疾病靶點進行預測，對后續(xù)橘皮竹茹湯治療胃食管反流病作用機制的研究提供參考。