多指標(biāo)綜合評價關(guān)防風(fēng)適宜干燥加工方法的研究

孫國東，王思淼，任曉蕾，霍金海，王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036)

防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)(Schischk)未開花植物的干根，是我國常用的大宗藥材之一?！侗静菥V目》有載：“防者防御也，因其功療風(fēng)最要，故名防風(fēng)”，被歷版《中國藥典》收載，具有祛風(fēng)解表、勝濕鎮(zhèn)痛、止痙之功效[1]。關(guān)防風(fēng)主產(chǎn)于黑龍江地區(qū)，內(nèi)蒙古地區(qū)也有分布，屬于防風(fēng)中的上品；其中以黑龍江省杜爾伯特草原地區(qū)出產(chǎn)的小蒿子防風(fēng)質(zhì)量最優(yōu)[2-3]。2015年本課題組制訂的關(guān)防風(fēng)道地藥材標(biāo)準(zhǔn)ZGZYXH/T 31-2015被中國中藥協(xié)會收載[4]。

藥材道地性涉及種質(zhì)資源、栽培技術(shù)、采收加工、包裝貯藏等多個環(huán)節(jié)因素，其中采收加工方法在保證中藥材質(zhì)量有效性和安全性方面起到了至關(guān)重要的作用。干燥是十分常見的炮制手段，具有增強(qiáng)藥性，降低毒性等重要作用。孫思邈《千金翼方》：“夫藥采取，不依陰干、曝干，雖有藥名，終無藥實(shí)。”意思是應(yīng)當(dāng)根據(jù)藥材性質(zhì)來選擇適合的干燥方法，這一點(diǎn)十分重要[5]。目前已有學(xué)者對防風(fēng)干燥加工方法開展了研究工作[6-8]，但多集中于一個或幾個成分的含量測定，而中藥往往是通過有效組分群發(fā)揮協(xié)同作用。因此，本文采取從整體到局部，從宏觀到微觀的研究策略。將UV、HPLC、UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)有機(jī)結(jié)合[9-12]，對其主要活性物質(zhì)色原酮的總含量、主成分含量以及不同加工方法成分差異性進(jìn)行全面分析，多指標(biāo)綜合評價結(jié)合確定關(guān)防風(fēng)的適宜干燥加工方法。

1 材料

1.1 藥物 3年生關(guān)防風(fēng)采自黑龍江省綏化市慶安縣大羅鎮(zhèn)東明村(東經(jīng)127°41′10.11″，北緯46°39′22.32″)，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院王偉明研究員鑒定為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata(Turcz) Schisck的干燥根。亥茅酚苷對照品(批號：H-027-150915)、升麻苷(批號：S-004-150421)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號：J-002-150420)、升麻素(批號：S-007-150421)、歐前胡素(批號：O-001-170118)：均由成都彼斯特生物科技有限公司提供。

1.2 試劑 甲醇、乙腈：德國默克化工技術(shù)有限公司；甲酸：德國賽默飛世爾科技有限公司；超純水：廣州屈臣氏食品有限公司。

1.3 儀器 UV/VIS Lambda365型紫外-可見分光光度計：美國珀金埃爾默股份有限公司；e2695型高效液相色譜儀：Waters；Kromasil 100-5 C18(5μm，250 mm×4.6 mm)色譜柱，超高效液相色譜儀：美國沃特世公司；5600+型高分辨飛行質(zhì)譜儀：美國愛博才思公司；數(shù)據(jù)采集及解析工作站(Peakview、Markerview、Natural products HR-MS/MS Spectral Library)：美國愛博才思公司； UPLC BEH C18色譜柱(1.7μm，2.1 mm×10 cm)、BEH C18VanGuard Pre-Column (1.7μm，2.1 mm×5 cm)：美國愛博才思公司；KQ-300DB型超聲清洗機(jī)：中國昆山市超聲儀器有限公司；BSA224S型分析天平：德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；S210-K型pH計：德國梅特勒-托利多儀器有限公司。

2 方法

2.1 干燥方法 ①陰干：連續(xù)在陰涼處干燥8 d，早晚各稱重1 次，至含水量達(dá)到藥典要求。②曬干：連續(xù)在陽光下曬干5 d，早晚各稱重1次，至含水量達(dá)到藥典要求。③凍干：低溫凍干48 h，至含水量達(dá)到藥典要求。④40 ℃烘干：40 ℃烘箱干燥約14 h，每隔2 h稱重，至含水量達(dá)到藥典要求。⑤60 ℃烘干：60 ℃烘箱干燥約9 h，每隔1 h稱重，至含水量達(dá)到藥典要求。⑥80 ℃烘干：80 ℃烘箱干燥約7 h，每隔1 h稱重，至含水量達(dá)到藥典要求。

2.2 總色原酮含量測定方法

2.2.1 試液的制備

2.2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取亥茅酚苷對照品4 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制備成濃度為0.08 g/L的對照品溶液，備用。

2.2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取0.2 g樣品粉末， 加70%乙醇溶液25 mL，超聲波震蕩半小時，放至室溫，稱重后以相同溶劑補(bǔ)足損失的重量，搖勻，以微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 總色原酮含量的測定 精密吸取0.5 mL上述兩種溶液，分別加水稀釋至25 mL，再吸取1.0 mL加入緩沖液2.0 mL，放置30 min，加入0.7 mL顯色劑，靜置室溫，加入2.0 mL5%NaCO3溶液，搖勻放至室溫后以70℃水浴加熱15 min，放冷10 min，使用紫外分光光度計在波長305 nm處掃描測定，結(jié)果見表1。

2.3 HPLC含量測定方法

2.3.1 溶液的制備

2.3.1.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取3-O-乙酰亥茅酚、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品0.6 mg，加入10 mL甲醇，分別配制成濃度為0.06 g/L的溶液，即得。

2.3.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取0.5 g樣品粉末，加入25 mL甲醇，超聲波提取1 h，放冷稱重，以甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液備用。

2.3.2 色譜條件 采用 Kromasil 100-5C18色譜柱(250 mm×4.6 mm)，流動相A為水，流動相B為甲醇，梯度洗脫(0→15 min, 35% B；15→25min, 35%→55% B；25→35min, 55%B； 35→40min, 55%→100% B； 40→45min, 100%→35% B)，檢測波長254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。在此條件下關(guān)防風(fēng)中對照品與其他組分均能達(dá)到基線分離，結(jié)果見圖1。

圖1 關(guān)防風(fēng)HPLC色譜圖

2.4 UPLC-Q-TOF/MS分析

2.4.1 溶液的制備

2.4.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取3-O-乙酰亥茅酚、歐前胡素等對照品1 mg，加甲醇分別制成濃度為100 mg/L的溶液，即得。

2.4.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取1.0 g樣品粉末，加甲醇25 mL，超聲波提取1 h，放至室溫，加甲醇補(bǔ)足損失的重量，濾過，即得。

2.4.2 色譜條件 UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×10 cm, 1.7μm)， 柱溫30 ℃，流動相A為1‰甲酸-水，B為1‰甲酸-乙腈，梯度洗脫(0→10 min，95%→50%A；10→13 min，50%→30%A；13→15 min，30%→30%A；15→20 min，30%→0%A；20→20.1 min，0%→95%A；20.1→25 min，95%→95%A)，流速0.3 mL/min，每針進(jìn)3μL樣品。

2.4.3 質(zhì)譜條件 離子源選擇電噴霧質(zhì)譜ESI，離子化模式包括正、負(fù)兩種離子模式，正離子模式下的參數(shù)為：碰撞電壓為5 500 V，離子源溫度550 ℃，裂解電壓為 80 V，碰撞能區(qū)間選擇 20～50 eV，霧化氣體及輔助氣均為N2，輔助氣(Gas1及Gas2)為55 PSI，氣簾氣(Cur Gas)為 35 PSI。負(fù)離子模式參數(shù)離子源電壓為-4 500 V，其余參數(shù)與正離子模式一致。TOF MS掃描范圍為80～1 500，中性離子丟失范圍選擇 50～1 500，并設(shè)置扣除背景。總離子流圖中可見各質(zhì)譜峰均能得到相對的分離，結(jié)果見圖2。

圖2 關(guān)防風(fēng)樣品TIC圖

2.4.4 數(shù)據(jù)分析 (1)目標(biāo)性篩查：使用質(zhì)譜色譜峰處理工作站及masterview插件(美國愛博才思)加載已采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，使用自制質(zhì)譜篩查用數(shù)據(jù)庫(文獻(xiàn)查詢等方式收集127種防風(fēng)藥材中已知的成分所建立的化合物數(shù)據(jù)，包含分子式、分子量、名稱、結(jié)構(gòu)歸屬、植物來源及有效部位等信息)，工作站自帶比對數(shù)據(jù)庫模塊的參數(shù)設(shè)置為：質(zhì)量誤差<5 ppm；分子式得分>70%；篩查方式模塊選擇目標(biāo)篩查。 通過不同采集期內(nèi)的總離子流的變化從而達(dá)到半定量的分析結(jié)論。色原酮及香豆素類成分為防風(fēng)中主要成分，其特征離子碎片理論上均分布在相對固定的保留時間范圍內(nèi)，根據(jù)這個特點(diǎn)對特征離子進(jìn)行掃描及篩查，可分析不同類成分相對含量的變化趨勢。(2)非目標(biāo)性篩查：使用質(zhì)譜色譜峰處理工作站及peak finding options模塊(美國愛博才思)加載已采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過將數(shù)據(jù)中所有色譜峰按照設(shè)置參數(shù)母離子強(qiáng)度>1000counts，信噪比>10，分子式元素篩選范圍參數(shù)為C50H200O50，利用Alignment & Filtering功能降低質(zhì)譜碎片與保留時間的誤差，篩選出來的成分使用Marker View工作站進(jìn)行降維處理，建立主成分分析模型，得到代表不同干燥方法下關(guān)防風(fēng)成分離子碎片的載荷圖以及代表反映各個變量對樣品分型的影響的得分圖。通過對比得得分圖中各點(diǎn)與原點(diǎn)的距離遠(yuǎn)近表示各采集樣品間的差異大小，而載荷圖中各點(diǎn)距離原點(diǎn)的距離大小則表示此點(diǎn)所代表的成分與其他樣品中與之相同的成分之間的差異大小，即與原點(diǎn)距離遠(yuǎn)的離子對分型貢獻(xiàn)較大，這類化合物將作為分析的重點(diǎn)目標(biāo)。

2.4.5 結(jié)構(gòu)鑒定 通過正、負(fù)離子模式采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)能夠分別得到[M+H]+及[M-H]-碎片離子，也可得到[M+Na]+、[M+COOH]+等碎片離子，高分辨質(zhì)譜能精準(zhǔn)的獲取離子碎片的精確質(zhì)量數(shù)，將誤差縮小在5 ppm內(nèi)，此時得到的離子質(zhì)量數(shù)較為精確，再計算出相應(yīng)離子的同位素豐度比，進(jìn)一步得到精確的分子式，通過分子式及裂解方式的推斷可推測離子碎片的結(jié)構(gòu)式。結(jié)構(gòu)式可通過以下三種方式鑒定或推斷：(1)可獲得對照品，借助保留時間和二級質(zhì)譜碎片比對鎖定結(jié)構(gòu)。(2)使用 LibraryView工作站 (美國愛博才思) 進(jìn)行篩查，該數(shù)據(jù)包含了1 000余種中草藥對照品的二級質(zhì)譜圖信息與通過解析軟件篩查出的目標(biāo)化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行自動匹配。(3)沒有對照品且工作站中沒有數(shù)據(jù)的成分首先根據(jù)工作站計算其分子式，將分子式輸入至chemspider的預(yù)測框中，網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫會給出其可能的結(jié)構(gòu)式，同時計算每個二級質(zhì)譜碎片的精確質(zhì)量，與可能的結(jié)構(gòu)式進(jìn)行對比，參考同類成分文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫的裂解規(guī)律進(jìn)行推斷，將合理的推斷結(jié)構(gòu)進(jìn)行整理組合，從而推斷化合物最終的結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 總色原酮含量測定結(jié)果 見表1。

表1 不同干燥方法總色原酮含量測定結(jié)果

3.2 HPLC含量測定結(jié)果 見表2。

表2 不同干燥方法HPLC含量測定結(jié)果

3.3 UPLC-Q-TOF/MS分析結(jié)果

3.3.1 模式識別分析結(jié)果 通過選用正負(fù)兩種離子模式，借助PCA 分析法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，結(jié)果見圖3、圖4。由得分圖可知，不同干燥加工方法下關(guān)防風(fēng)組分具有較大的差異，說明關(guān)防風(fēng)的成分會對不同干燥加工方法產(chǎn)生十分明顯的響應(yīng)。

圖3 不同干燥方法關(guān)防風(fēng)藥材正離子PCA圖

圖4 不同干燥方法關(guān)防風(fēng)藥材負(fù)離子PCA圖

3.3.2 差異性成分分析結(jié)果 共鑒定10個差異顯著化合物，包括化合物名稱、保留時間、分子量、掃描模式、測定誤差、二級碎片等信息， 分析結(jié)果見表3。10個化合物主要為色原酮類及香豆素類化合物，以3-O-乙酰亥茅酚、歐前胡素為例介紹其典型質(zhì)譜裂解規(guī)律。

表3 防風(fēng)藥材成分分析結(jié)果

10個化合物在不同加工方法含量發(fā)生了顯著變化，其中1～3號化合物以曬干含量最高，4～6號化合物以凍干及80 ℃烘干含量較高，7號化合物以凍干含量最高，僅8號化合物以40 ℃烘干含量最高，9～10號化合物以80 ℃烘干含量最高。

香豆素類是干燥過程中變化較多的化合物，以歐前胡素為代表介紹其質(zhì)譜裂解規(guī)律：

6號化合物在正離子模式下采集的離子碎片質(zhì)荷比為為271.0970，與理論值比對誤差僅為-1.9，經(jīng)peakview工作站軟件計算得到分子式為C16H14O4。由質(zhì)荷比碎片離子及質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫二級鏡像對比圖相印證后推斷其裂解途徑如下：準(zhǔn)分子離子豐度比極低，高壓碰撞下極易產(chǎn)生離子碎片203[M+H-C5H8]+，此碎片豐度比極高，為基峰碎片，其結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)固，而此碎片連續(xù)脫去兩分子CO分別產(chǎn)生兩個質(zhì)譜碎片175[M+H-C5H8-CO]+和147[M+H-C5H8-2CO]+；203碎片離子也能先脫一分子H2O后繼續(xù)脫去一分子CO產(chǎn)生兩個碎片離子185[M+H-C5H8-H2O]+及157[M+H-C5H8-H2O-CO]+。其二級質(zhì)譜見圖5，裂解途徑見圖5，圖6。根據(jù)對照品質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫及元素組成分析并參考相關(guān)文獻(xiàn)的報道[15]，推測該化合物為歐前胡素。

圖5 歐前胡素二級質(zhì)譜圖(A.樣品；B.對照品)

圖6 歐前胡素可能的裂解途徑圖

3.4 適宜干燥加工方法的確定

3.4.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 測定不同干燥方法各樣品平所含有效成分的總量，作為適宜干燥方法確定的主要依據(jù)，結(jié)果見表4，圖7。

表4 不同干燥方法關(guān)防風(fēng)有效成分含量匯總表(mg/g)

圖7 不同干燥方法關(guān)防風(fēng)有效成分含量變化趨勢圖

3.4.2 適宜干燥加工方法的確定 從表4及圖9可知，不同干燥方法對關(guān)防風(fēng)色原酮含量影響較大，其中以曬干、凍干、60 ℃烘干、80 ℃烘干有效成分含量高，而陰干、40 ℃烘干會導(dǎo)致有效成分大量損失，對關(guān)防風(fēng)質(zhì)量影響較大。凍干成本過高，因此，建議關(guān)防風(fēng)干燥方法為曬干或80 ℃烘干，產(chǎn)地初加工可選擇曬干，規(guī)?；s化生產(chǎn)則選擇80 ℃烘干。

4 討論

關(guān)防風(fēng)產(chǎn)地初加工傳統(tǒng)方法為曬至半干時去掉須毛，扎成小把，曬至全干[13]?，F(xiàn)代研究報道不一致，最近研究表明，20～50 ℃中高溫處理防風(fēng)鮮根可顯著提高藥材中色原酮含量[8]

本文通過紫外分光光度法、高效液相色譜含量測定以及高分辨質(zhì)譜的全面分析，可見不同干燥方法對關(guān)防風(fēng)色原酮及其他成分含量影響較大，陰干及40 ℃長時間烘干會導(dǎo)致有效成分大量損失，可能是因?yàn)橹参飪?nèi)源性酶在陰干及40 ℃時發(fā)揮作用，導(dǎo)致活性成分分解。而曬干、80 ℃烘干可有效破壞酶的活性，凍干可抑制酶的活性。因此，建議關(guān)防風(fēng)干燥方法為曬干或80 ℃烘干，產(chǎn)地初加工可選擇曬干，與傳統(tǒng)方法一致。規(guī)?；s化生產(chǎn)則選擇80 ℃烘干，既提高生產(chǎn)效率，有提高藥材指標(biāo)性有效成分含量。

近年來，國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者將液相色譜法的分離管理能力和質(zhì)譜的高靈敏度相結(jié)合，尤其是與高分辨質(zhì)譜和多級質(zhì)譜聯(lián)合企業(yè)使用的技術(shù)教學(xué)手段，已廣泛可以應(yīng)用于中草藥有效成分的全面發(fā)展分析，也為研究具有天然產(chǎn)物動態(tài)數(shù)據(jù)積累社會規(guī)律開辟了全新的途徑。不同干燥加工方法對關(guān)防風(fēng)化學(xué)成分具有明顯的影響，鑒定或推斷了10個對干燥方法差異貢獻(xiàn)較大的化學(xué)成分，為全面認(rèn)識加工方法對中藥材化學(xué)成分的影響提供了新的研究視角，有助于全面理解中藥材加工方法的重要性。