鮮益母草膠囊促進藥物流產(chǎn)不全大鼠子宮復(fù)舊的實驗研究

欒會玲，業(yè) 康，金祖漢，金 捷，黃晶晶，楊明華

(浙江省中藥研究所有限公司·浙江 杭州 310023)

鮮益母草膠囊是浙江省中藥研究所有限公司領(lǐng)銜研發(fā)的中藥新藥，現(xiàn)為浙江義烏大德藥業(yè)集團有限公司拳頭產(chǎn)品。為采用益母草鮮草為原料精制而成，具有活血調(diào)經(jīng)功效，用于血瘀所致的月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后惡露不絕，癥見經(jīng)水量少、淋漓不凈、產(chǎn)后出血時間過長[1]。臨床報道其用于產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全療效顯著[2-3]，為驗證該療效，本文觀察鮮益母草膠囊對藥物不完全流產(chǎn)大鼠模型的影響，以期為該藥的臨床應(yīng)用與進一步開發(fā)提供指導(dǎo)。

1 實驗材料

1.1 動物 SD 大鼠，鼠齡7～8周，SPF 級，♀♂兼用，體質(zhì)量(200±20)g，購自浙江省實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(浙)2014-0001。大鼠分籠飼養(yǎng)于清潔級動物房內(nèi)，溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，光照明暗交替各12 h，通風(fēng)≥15 次/h；動物使用設(shè)施條件合格證號：SCYK(浙)2018-0011。

1.2 藥品及試劑 鮮益母草膠囊：浙江大德制藥集團有限公司，批號：180408；益母草膠囊：沈陽永大制藥有限公司，批號：20171120。米非司酮片：浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：180108；米索前列醇片：浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：190102。

1.3 儀器 Infinate200 PRO酶標(biāo)儀：Tecan Austria Gmbh； DM4000 B透射顯微鏡 (明場) +熒光顯微鏡：德國萊卡儀器公司。

2 方法

2.1 模型制備 取SD大鼠120只，雌雄按2:1比例合籠(16：00)，第二天上午9：00觀察陰道栓，進行陰道涂片檢查，以發(fā)現(xiàn)有精子為妊娠第1天(d1)。預(yù)留8只孕鼠作為正常對照組，其它孕鼠于妊娠d11分別按體質(zhì)量灌胃米非司酮8.3 mg/kg和米索前列醇100 μg/kg，待陰道內(nèi)有血流出，造模完成。正常妊娠組灌胃等容積的生理鹽水。

2.2 動物分組與給藥 將成模大鼠隨機分為模型組(9只)、益母草膠囊組(8只)、鮮益母草膠囊低劑量組(9只)、鮮益母草膠囊中劑量組(9只)、鮮益母草膠囊高劑量組(9只)；正常妊娠組(8 只)。正常組和模型組，每日灌胃10 mL/kg生理鹽水，益母草膠囊組組每日灌胃0.946 g/kg益母草膠囊，鮮益母草膠囊低、中、高劑量組每日灌胃0.18、0.36、0.72 g/kg鮮益母草膠囊。從妊娠d13開始給藥，每日灌胃1次，連續(xù)給藥7 d。

2.3 觀察指標(biāo)及測定

2.3.1 子宮出血時間及出血量測定 成模大鼠于陰道內(nèi)置入定量棉球1個(棉球重75～80 mg)，次日分別于上午和下午將棉球取出，放入塑料袋中密閉冷藏保存，同時置換一個新棉球于陰道內(nèi), 以棉球可見血為標(biāo)準(zhǔn)記錄出血時間，連續(xù)至d19, 將收集的每鼠陰道棉球進行出血量測定[4]。取大鼠一只，從尾靜脈處取血200 μL，立即加入50 g/L的NaOH水溶液中，混勻后定容至2 mL，得100 ml/L血溶液，等量稀釋為50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 ml/L 10個濃度，用酶標(biāo)儀在波長為546 nm處測定各濃度的吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，血濃度為縱坐標(biāo)，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的血濃度(y)—吸光度(x)回歸方程。每鼠子宮出血棉球分別置于燒杯內(nèi)，根據(jù)出血量情況加適量50 g/L的NaOH溶液浸泡，擠壓搓洗棉球血漬，浸洗后的溶液倒入另一燒杯內(nèi)保存。再加適量50 g/L的NaOH溶液浸泡棉球，擠壓搓洗血漬，倒入保存容器。根據(jù)棉球血漬洗脫情況決定是否再浸洗一次。將先后所有浸提液混勻，記錄所用50 g/L的NaOH溶液總量，取2 mL浸提液3 000 r/min離心10 min，取上清液用酶標(biāo)儀在波長為546 nm處測定吸光度[4]。依據(jù)血濃度(y)—吸光度(x)回歸方程，計算出每個陰道棉球的含血量。每鼠所有出血棉球的含血量總和即為該鼠的出血量(mL)。

2.3.2 子宮和卵巢指數(shù)的測定 各組大鼠末次給藥1 h后烏拉糖麻醉處死，切開腹部，取出子宮和卵巢稱重。按以下公式計算子宮和卵巢指數(shù)。子宮指數(shù) =子宮濕重/大鼠體重 ×100%；卵巢指數(shù)=卵巢濕重/大鼠體重 ×100%。

2.3.3 子宮病理變化 分離子宮后，觀察子宮形態(tài)變化。將子宮放入10 %甲醛溶液中固定，進行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察子宮的病理變化。參考子宮病理分級標(biāo)準(zhǔn)評定[4-5]。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS 11.0 統(tǒng)計分析軟件處理實驗數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用單因素方差分析，方差檢驗齊者用LSD法，方差不齊者用用DunnettT3檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠子宮出血時間和出血量的比較 見表1。

表1 各組大鼠子宮出血時間和出血量的測定結(jié)果

3.2 各組大鼠子宮和卵巢指數(shù)的比較 見表2。

表2 各組大鼠子宮和卵巢指數(shù)比較

3.3 各組大鼠子宮病理變化的觀察結(jié)果

肉眼觀察：正常妊娠組大鼠子宮胚胎發(fā)育完整，胚胎數(shù)8～16個。模型組子宮膨大的結(jié)節(jié)明顯，但胚胎之間界限不明顯，有明顯的殘留和瘀血，顏色暗紅，為不完全流產(chǎn)。各用藥組大鼠子宮，除了有些子宮周圍充血外均無結(jié)節(jié)狀膨大和明顯瘀血點。說明鮮益母草和益母草對模型大鼠的子宮復(fù)舊不全均有較好的促進作用。

光學(xué)顯微鏡觀察：正常妊娠大鼠子宮組織，有明顯的滋養(yǎng)細胞存在。模型組大鼠子宮組織，雖然無明顯的滋養(yǎng)細胞，但均有明顯的蛻膜細胞與淤血。其余各組除低劑量組個別大鼠子宮有明顯的蛻膜細胞與淤血，各組大鼠子宮組織均無明顯的滋養(yǎng)細胞和蛻膜細胞。見圖 1。各組大鼠子宮內(nèi)膜病理學(xué)分級及評分見表3。

圖1 各組大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)變化(×100)

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜病理形態(tài)分級及評分比較

4 討論

益母草其味辛苦，性微寒，歸心、肝、膀胱經(jīng)，功擅活血調(diào)經(jīng)、清熱解毒、利尿消腫，為“婦產(chǎn)科要藥”。《本草綱目》言其具有“活血、調(diào)經(jīng)、解毒……治崩中漏下”。鮮益母草膠囊以鮮益母草為原料，利用勻漿、噴霧干燥工藝制備而成[6]，臨床報道，鮮益母草膠囊活血祛瘀，促進子宮收縮效果明顯,對治療產(chǎn)后子宮復(fù)原不全、惡露不絕的總有效率達96.67%[7]。

現(xiàn)代藥理研究顯示，益母草對子宮有明顯興奮作用，能增強子宮平滑肌收縮，促進子宮內(nèi)殘留物排出，抑制藥流后大鼠子宮出血[8]；益母草對藥物流產(chǎn)后大鼠具有明顯的止血作用，能減少宮內(nèi)滯留物、增強子宮收縮活動[9]。項目組早期的研究表明，與益母草膠囊比較，鮮益母草膠囊具有更好的收縮子宮和活血化瘀作用[10]。

本研究結(jié)果顯示：鮮益母草能減少藥物流產(chǎn)不全大鼠子宮出血量(P<0.01)， 縮短子宮出血時間(P<0.01)；出血時間明顯短于益母草膠囊組(P<0.05)；與模型組比較，鮮益母草和益母草均能減少藥流后大鼠子宮指數(shù)(P<0.05)。病理學(xué)觀察結(jié)果顯示鮮益母草和益母草均能促進子宮腔內(nèi)的絨毛、蛻膜組織物排出。

綜上所述，鮮益母草膠囊能明顯抑制藥物不完全流產(chǎn)后大鼠子宮出血，促進子宮復(fù)原。其作用機制有待進一步深入研究。