多個(gè)GEO芯片聯(lián)合分析阿爾茨海默病內(nèi)嗅皮層的關(guān)鍵基因

邵康梅，張 凡，蔡宏斌，魏海萍，陳圓圓，葛朝明*

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，中國(guó)甘肅蘭州730030；2.甘肅省消化系腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)甘肅蘭州730030)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病機(jī)制可歸因于大腦皮質(zhì)和邊緣區(qū)β淀粉樣蛋白(amyloid β-protien，Aβ)斑塊的胞外聚集和過度磷酸化的tau蛋白構(gòu)成的細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)，其特點(diǎn)是記憶喪失和進(jìn)行性神經(jīng)認(rèn)知功能障礙[1]。AD是老年期最常見的癡呆類型，占老年期癡呆的60%～80%[2]。目前，AD的治療無特效藥物，尋找AD早期的治療靶點(diǎn)對(duì)疾病的治療至關(guān)重要。研究證實(shí)內(nèi)嗅皮層是AD進(jìn)展中最早發(fā)生病變的部位[3～4]。

內(nèi)嗅皮層位于顳葉內(nèi)側(cè)，參與最初的情景編碼，在記憶形成過程中起著不可或缺的作用，而且是海馬體和大腦皮層之間的關(guān)鍵通道[5]。AD中tau蛋白相關(guān)神經(jīng)原纖維纏結(jié)病理遵循一定的順序，首先影響內(nèi)嗅皮層，然后發(fā)展到邊緣系統(tǒng)和聯(lián)合皮層[5]。因此，在AD早期針對(duì)內(nèi)嗅皮層尋找其潛在治療靶點(diǎn)，對(duì)AD的治療具有重要的臨床意義。

本研究收集了GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫中AD的內(nèi)嗅皮層表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE-48350[6]、GSE26972[7]和 GSE118553[8]。通過批次矯正對(duì)多組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，篩選出差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)，并對(duì)其進(jìn)行GO(Gene Ontology)分析、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果提示血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1)基因、CD44、原癌基因FOS和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)基因在AD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。VCAM1屬于黏附分子免疫球蛋白超家族，在衰老中與記憶和認(rèn)知密切相關(guān)[9～10]。CD44是一種跨膜糖蛋白，參與透明質(zhì)酸代謝、激活淋巴細(xì)胞和釋放細(xì)胞因子過程，并且參與海馬記憶編碼、存儲(chǔ)或檢索過程[11～12]。c-Fos蛋白由FOS基因轉(zhuǎn)錄后翻譯產(chǎn)生，其參與了記憶的形成[13]。SPARC是調(diào)節(jié)細(xì)胞與其周圍細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的細(xì)胞分子，其異常表達(dá)與腦組織炎癥的發(fā)生相關(guān)[14]。本研究闡明了AD在內(nèi)嗅皮層部位的發(fā)病機(jī)制并篩選出了AD治療的潛在靶點(diǎn)，為AD的防治提供了新的思路與線索。

1 材料與方法

1.1 資料來源

本文使用的數(shù)據(jù)來自于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)公共數(shù)據(jù)平臺(tái)的GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。檢索關(guān)鍵詞為“entorhinal cortex”，檢索條件為“Homo sapiens”和“expression profiling by array”，共檢索到13個(gè)數(shù)據(jù)集，排除缺乏正常對(duì)照組、晚發(fā)性AD、非AD研究的數(shù)據(jù)集，最終納入 GSE48350、GSE26972、GSE118553 數(shù)據(jù)集進(jìn)行下一步分析。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理和差異基因分析

在GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE48350、GSE26972、GSE118553矩陣數(shù)據(jù)[6～8]。運(yùn)用R軟件處理芯片數(shù)據(jù)，limma包用于數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化以及內(nèi)嗅皮層和正常對(duì)照組的基因差異分析[15]；利用K近鄰法(K-nearest neighbor，KNN)填充缺失值，采用 impute包進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)缺失值的處理[16]。運(yùn)用R軟件中的sva包和limma包進(jìn)行批次矯正[17]，消除數(shù)據(jù)集間存在的異質(zhì)性。以|log2FC|＞1(FC:fold change)和P＜0.05為篩選條件篩選DEGs。

1.3 GO富集與KEGG通路富集分析

為了在功能層面上分析DEGs，利用Cytoscape軟件中的ClueGO插件對(duì)其進(jìn)行GO/KEGG富集分析及數(shù)據(jù)可視化[18]，得到DEGs富集的生物過程及通路，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因分析

本研究通過STRING數(shù)據(jù)庫(http://www.string-db.org/)，以互作評(píng)分 combination score＞0.4為條件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)[19]，使用Cytoscape軟件對(duì)DEGs所編碼蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行可視化展示[20]。其中，cytoHubba插件用于分析生物網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因[21]，它包括最大集團(tuán)中心度(maximal clique centrality，MCC)、最大鄰域組件密度(density of maximum neighborhood component，DMNC)、度(degree)、邊緣滲透組件(edge percolated component，EPC)、中介中心性(betweenness)、離心率(eccentricity)等拓?fù)浞治龇椒╗19]。為了提高預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，運(yùn)用不同的算法探索本研究的關(guān)鍵基因。

1.5 關(guān)鍵基因在腦組織不同部位的表達(dá)分析

結(jié)合GSE48350和GSE118553數(shù)據(jù)集驗(yàn)證關(guān)鍵基因在內(nèi)嗅皮層、海馬、中央后回、額上回、額葉皮層、顳葉皮層和小腦組織的表達(dá)水平是否有差異，并分析GSE118553數(shù)據(jù)集中無癥狀A(yù)D(asymptomatic Alzheimer’s disease，AsymAD)和 AD 患者內(nèi)嗅皮層數(shù)據(jù)。其中，AsymAD患者為認(rèn)知功能正常但有明顯AD神經(jīng)病變的個(gè)體[8]。比較Asym-AD和AD患者的基因表達(dá)差異可能有助于闡明AD早期進(jìn)展的特定生物學(xué)機(jī)制。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)錄入SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析，對(duì)關(guān)鍵基因在腦組織不同部位的表達(dá)分析采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AD內(nèi)嗅皮層DEGs的篩選

從GEO數(shù)據(jù)庫中下載的3個(gè)AD相關(guān)的內(nèi)嗅皮層芯片數(shù)據(jù)集的具體信息見表1。對(duì)3個(gè)數(shù)據(jù)集分別進(jìn)行DEGs篩選，結(jié)果顯示:GSE48350中有43個(gè)DEGs，包括37個(gè)上調(diào)基因和6個(gè)下調(diào)基因；GSE26972中有266個(gè)DEGs，包括127個(gè)上調(diào)基因和139個(gè)下調(diào)基因；GSE118553中有93個(gè)DEGs，包括78個(gè)上調(diào)基因和15個(gè)下調(diào)基因。對(duì)3個(gè)數(shù)據(jù)集的DEGs繪制韋恩圖，結(jié)果提示三者間未見共同DEGs，說明這3個(gè)數(shù)據(jù)集之間存在異質(zhì)性，可能是由于發(fā)表時(shí)間不同、芯片檢測(cè)水平不一致，故需對(duì) GSE48350、GSE26972、GSE-118553數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)進(jìn)行批次矯正。對(duì)合并的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，結(jié)果顯示有17個(gè)DEGs，且均為上調(diào)基因(圖1)。

表1 AD內(nèi)嗅皮層各數(shù)據(jù)集的基本情況Table 1 Basic information of data sets of the entorhinal cortex with AD

圖1 AD內(nèi)嗅皮層DEGs的分布熱圖紅色代表表達(dá)水平高，綠色代表表達(dá)水平低。Fig.1 Heat map of DEGs in the entorhinal cortex with ADRed means higher expression，and green means lower expression.

2.2 DEGs的富集分析

對(duì)17個(gè)DEGs進(jìn)行GO富集和KEGG通路富集在線分析。GO富集分析提示，DEGs主要富集在白細(xì)胞-細(xì)胞間黏附的正調(diào)控、細(xì)胞外基質(zhì)組織、皮質(zhì)類固醇反應(yīng)等11個(gè)生物過程(表2，圖2)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，DEGs在卟啉和葉綠素代謝信號(hào)通路上顯著富集。

表2 DEGs的GO富集分析Table 2 GO analysis of DEGs

圖2 DEGs的GO富集分析圓形代表富集到的條目，連線代表兩個(gè)GO富集條目之間存在相同的DEGs，圖形越大表明富集到的基因數(shù)目越多。Fig.2 GO analysis of DEGsNodes represent GO terms.Lines indicate that overlapping DEGs exist between two GO terms.Larger nodes indicate more enriched DEGs.

2.3 DEGs所編碼蛋白質(zhì)的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

對(duì)分析獲得的DEGs進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果如圖3所示，包含13個(gè)節(jié)點(diǎn)和31條相互作用關(guān)系。進(jìn)一步基于cytoHubba插件中的多種計(jì)算方法，得到互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因?yàn)閂CAM1、CD44、FOS 和 SPARC(表 3)。

表3 基于cytoHubba中各算法篩選的關(guān)鍵基因Table 3 Hub genes screened based on cytoHubba algorithm

圖3 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中顏色由紅到黃到藍(lán)表明相應(yīng)基因得分由高到低。Fig.3 PPI network of DEGsColors ranging from red to yellow to blue indicate gene scores from high to low.

2.4 關(guān)鍵基因在內(nèi)嗅皮層及海馬中顯著高表達(dá)

運(yùn)用GSE48350數(shù)據(jù)集驗(yàn)證VCAM1、CD44、FOS和SPARC基因在內(nèi)嗅皮層、海馬、中央后回和額上回的表達(dá)是否有差異。研究發(fā)現(xiàn)，VCAM1在內(nèi)嗅皮層的表達(dá)水平顯著高于中央后回和額上回(P＜0.01，圖 4A)；CD44和 SPARC 在海馬的表達(dá)水平顯著高于內(nèi)嗅皮層(P＜0.05)，但在內(nèi)嗅皮層的表達(dá)水平顯著高于中央后回和額上回(P＜0.01，圖4B和圖4D)；FOS在海馬中的表達(dá)水平顯著高于中央后回和額上回(P＜0.01)，而海馬中的表達(dá)水平高于內(nèi)嗅皮層，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖4C)。結(jié)合GSE118553數(shù)據(jù)集再次探究關(guān)鍵基因在內(nèi)嗅皮層、額葉皮層、顳葉皮層和小腦組織中的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)VCAM1、CD44、FOS和SPARC基因在內(nèi)嗅皮層的表達(dá)水平顯著高于其他部位(P＜0.01，圖 5)。

圖4 關(guān)鍵基因在內(nèi)嗅皮層、海馬、中央后回和額上回組織中的表達(dá)水平Fig.4 The expression levels of hub genes in the entorhinal cortex，hippocampus，postcentral gyrus and superior frontal gyrus*:P＜0.05；**:P＜0.01.

圖5 關(guān)鍵基因在顳葉皮層、小腦、額葉皮層和內(nèi)嗅皮層組織中的表達(dá)水平Fig.5 The expression levels of hub genes in the temporal cortex，cerebellum，frontal cortex and entorhinal cortex**:P＜0.01.

2.5 關(guān)鍵基因在AD中的表達(dá)顯著高于AsymAD

AsymAD是AD的前驅(qū)階段，我們結(jié)合GSE-118553數(shù)據(jù)集對(duì)AsymAD和AD患者內(nèi)嗅皮層中關(guān)鍵基因的表達(dá)做進(jìn)一步分析。結(jié)果顯示，與Asym-AD患者相比，VCAM1、CD44、FOS和 SPARC 基因在AD患者內(nèi)嗅皮層中顯著高表達(dá)(P＜0.01，圖6)。

圖6 關(guān)鍵基因在AD和AsymAD患者內(nèi)嗅皮層中的表達(dá)水平Fig.6 The expression levels of hub genes in the entorhinal cortex between AD and asymptomatic patients**:P＜0.01.

3 討論

近年來大量研究者為探究AD發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制和篩選治療靶點(diǎn)，構(gòu)建了一系列生物大數(shù)據(jù)集。GSE48350數(shù)據(jù)集包含來自正常人(20～99歲)和AD患者海馬、內(nèi)嗅皮層、額葉上回、中央后回4個(gè)腦區(qū)的微陣列數(shù)據(jù)[6]。通過對(duì)該數(shù)據(jù)的分析，Berchtold等[22]發(fā)現(xiàn)在衰老和AD進(jìn)展中突觸相關(guān)基因的表達(dá)逐漸下調(diào)。此外，通過構(gòu)建正常老年人、AsymAD和AD患者的內(nèi)嗅皮層、額葉皮層、顳葉皮層和小腦組織微陣列表達(dá)譜芯片(GSE118553)，Patel等[8]發(fā)現(xiàn)AsymAD和AD患者的能量代謝與谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)失調(diào)有關(guān)。Berson等[7]通過對(duì)來源于AD患者內(nèi)嗅皮層的芯片數(shù)據(jù)(GSE26972)展開分析發(fā)現(xiàn)，核內(nèi)不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP)A/B 剪接因子在AD患者內(nèi)嗅皮層中選擇性缺失，而且敲除hnRNP A/B可導(dǎo)致初級(jí)神經(jīng)元選擇性剪接損傷和樹突損失。

為探究?jī)?nèi)嗅皮層在AD發(fā)生發(fā)展過程中的機(jī)制，本研究對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫中3個(gè)AD患者內(nèi)嗅皮層數(shù)據(jù)集(GSE48350、GSE26972、GSE118553)進(jìn)行了整合和差異基因篩選，并針對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行了GO/KEGG富集分析和PPI分析，結(jié)果提示 VCAM1、CD44、FOS和 SPARC參與多條信號(hào)通路并在AD中發(fā)揮關(guān)鍵作用。VCAM1是黏附分子免疫球蛋白超家族的成員，于1989年首次被鑒定為位于內(nèi)皮細(xì)胞表面的一種90 kD糖蛋白，其功能主要是介導(dǎo)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附[9，23]。多項(xiàng)研究證實(shí)，VCAM1在AD患者血液、腦脊液標(biāo)本中異常高表達(dá)[24～27]。最新研究發(fā)現(xiàn)，在年老小鼠海馬區(qū)的腦內(nèi)皮細(xì)胞中VCAM1高表達(dá)，通過抑制VCAM1基因或使用抗VCAM1抗體可逆轉(zhuǎn)年老小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活性和認(rèn)知功能障礙等衰老方面的變化[10]。另有研究報(bào)道，VCAM1水平與短期記憶和繪畫得分呈顯著負(fù)相關(guān)，即血漿中VCAM1表達(dá)越高，AD患者記憶力及視空間功能越差[28]。焦谷氨酸-Aβ是AD中Aβ斑塊的主要成分，在谷氨?；h(huán)化酶催化下，截短的Aβ肽發(fā)生吡咯酰化反應(yīng)，產(chǎn)生焦谷氨酸-Aβ，增強(qiáng)其聚集傾向[29]。相關(guān)研究報(bào)道，VCAM1與AD患者谷氨?；h(huán)化酶活性密切相關(guān)，是抑制谷氨?；h(huán)化酶的潛在藥效學(xué)指標(biāo)[30]。目前，探究VCAM1在AD內(nèi)嗅皮層部位的相關(guān)研究很少報(bào)道，僅Pang等[26]研究提示VCAM1在內(nèi)嗅皮層及海馬中高表達(dá)，這與我們的結(jié)果(圖4A)一致。此外，我們首次發(fā)現(xiàn)VCAM1在AD患者內(nèi)嗅皮層中的表達(dá)水平顯著高于AsymAD患者(圖6A)，提示在AD早期VCAM1在內(nèi)嗅皮層部位出現(xiàn)表達(dá)異常。

CD44是一種跨膜糖蛋白，正常組織中CD44在調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸代謝、激活淋巴細(xì)胞和釋放細(xì)胞因子方面起著至關(guān)重要的作用[11]。Uberti等[31]證實(shí)AD患者淋巴細(xì)胞CD44基因的表達(dá)水平較正常人升高。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的天然免疫細(xì)胞，在AD小鼠早期，小膠質(zhì)細(xì)胞CD44的表達(dá)升高[32]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，CD44S和CD44剪接變異體(CD44V6和CD44V10)在AD患者的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和原代神經(jīng)元中被Aβ肽誘導(dǎo)表達(dá)，其中CD44V10特異性干擾小RNA(small interfering RNA，siRNA)和抗CD44V10抗體都能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞使其免受Aβ誘導(dǎo)的毒性[33]。目前，關(guān)于CD44在AD患者內(nèi)嗅皮層部位的相關(guān)研究未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)CD44在AD內(nèi)嗅皮層部位高表達(dá)，且在AD患者內(nèi)嗅皮層中的表達(dá)水平高于AsymAD患者。其與VCAM1共同參與白細(xì)胞-細(xì)胞間黏附的正調(diào)控通路和細(xì)胞外基質(zhì)組織通路。研究報(bào)道，CD44作為糖胺多糖透明質(zhì)酸的受體，參與海馬記憶編碼、存儲(chǔ)或檢索過程[12]。我們發(fā)現(xiàn)，CD44在內(nèi)嗅皮層及海馬顯著富集，且在海馬的表達(dá)水平顯著高于內(nèi)嗅皮層(圖4B)。因此，我們推斷CD44在內(nèi)嗅皮層和海馬記憶形成及儲(chǔ)存中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

FOS基因編碼產(chǎn)生c-Fos蛋白。研究證實(shí)，c-Fos蛋白是神經(jīng)可塑性的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，參與了記憶的形成[13，34]。有研究表明，海馬神經(jīng)元的突觸可塑性變化在老年癡呆的病理過程中占據(jù)重要的地位，可能是AD學(xué)習(xí)和記憶障礙的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)[35]。此外，F(xiàn)OS還可通過調(diào)節(jié)腸道微生物-GLP-1(glucagon-like peptide-1)/GLP-1R(glucagon-like peptide-1 receptor)通路，發(fā)揮良好的抗AD作用[36]。通過對(duì)AD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行測(cè)定，Leandro等[37]不僅發(fā)現(xiàn)炎癥和免疫相關(guān)信號(hào)通路顯著上調(diào)，而且發(fā)現(xiàn)FOS可作為AD患者外周血的潛在生物標(biāo)志物。為進(jìn)一步分析AD中不同細(xì)胞亞型的特異性調(diào)節(jié)機(jī)制和各細(xì)胞亞群的功能差異，Grubman等[38]構(gòu)建了AD內(nèi)嗅皮層的單細(xì)胞圖譜，其研究證實(shí)FOS在AD患者的星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群中顯著高表達(dá)，而且星形膠質(zhì)細(xì)胞也是AD早期的生物標(biāo)志物并參與AD疾病進(jìn)展[39]。本研究發(fā)現(xiàn)FOS在海馬及內(nèi)嗅皮層組織中顯著富集(圖4C)，且FOS在AD患者內(nèi)嗅皮層中的表達(dá)水平顯著高于AsymAD患者(圖6C)。

SPARC是調(diào)節(jié)細(xì)胞與其周圍細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的細(xì)胞分子，同時(shí)參與細(xì)胞外基質(zhì)的組裝、沉積和生長(zhǎng)因子信號(hào)[40]。針對(duì)AD患者腦脊液的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SPARC表達(dá)升高，且可能具有預(yù)測(cè)早期AD發(fā)生的作用[41]。Strunz等[14]通過分析AD患者顳皮質(zhì)發(fā)現(xiàn)，SPARC顯著高表達(dá)，并與Aβ蛋白相結(jié)合，參與腦組織炎癥的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，SPARC在AD患者內(nèi)嗅皮層和海馬組織中顯著高表達(dá)，且其在海馬的表達(dá)水平顯著高于內(nèi)嗅皮層(圖4D)。同樣，SPARC在AD患者內(nèi)嗅皮層中的表達(dá)水平顯著高于AsymAD患者(圖6D)。

綜上所述，本研究運(yùn)用多芯片聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)VCAM1、FOS、CD44和SPARC在AD患者內(nèi)嗅皮層部位發(fā)揮重要作用。此外，本研究結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)再次驗(yàn)證了關(guān)鍵基因在腦組織不同部位及AD患者與AsymAD患者之間的表達(dá)水平具有差異性。研究結(jié)果為闡明AD疾病發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制提供了新的思路，也為篩選AD的治療藥物提供了新的靶點(diǎn)。但該結(jié)論仍需要進(jìn)一步的臨床大樣本驗(yàn)證及機(jī)制探究。