不飽和脂肪酸對(duì)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

李錦靈，林立龍，李治寰

(東莞市恩聯(lián)干細(xì)胞生物科技研究院，中國(guó)廣東東莞523000)

人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是存在于脂肪組織中的一種多潛能干細(xì)胞，在特定條件下可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞[1]。ADSCs免疫原性低，可減少同種異體間移植的排斥，且具有旁分泌功能，可分泌多種生長(zhǎng)因子及炎性因子[2]，在修復(fù)、替換、維持或增強(qiáng)組織和器官功能等研究領(lǐng)域顯示出強(qiáng)大的再生醫(yī)學(xué)功能，因此被廣泛應(yīng)用于臨床研究[3]。據(jù)中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)網(wǎng)站提供的信息(http://www.cmba.org.cn/common/index.aspxnodeid=281&pagesize=1&pagenum=10.htm)，截至2020年11月，在國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)備案的干細(xì)胞臨床研究機(jī)構(gòu)已增至111家，備案項(xiàng)目達(dá)100個(gè)，其中有5個(gè)臨床研究項(xiàng)目使用的細(xì)胞為ADSCs，包括廣東省中醫(yī)院開展的ADSCs治療中重度尋常型銀屑病的試驗(yàn)；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院開展的異體ADSCs治療膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床研究；聊城市人民醫(yī)院開展的ADSCs治療中重度潰瘍性結(jié)腸炎及肺動(dòng)脈高壓的臨床研究等。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)ADSCs相關(guān)動(dòng)物及臨床研究證實(shí)，ADSCs具有應(yīng)用于糖尿病足[4]、心肌缺血[5]、腦損傷[6]等修復(fù)治療的潛力。

脂肪酸是生物體的供能物質(zhì)和生物膜的重要組成部分，是膳食中重要的能量來源物質(zhì)。脂肪酸根據(jù)飽和程度的不同可分為飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)和不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid，UFA)，其中不飽和脂肪酸又分為單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MUFA)及多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)[7]。不飽和脂肪酸及其代謝產(chǎn)物是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分，在干細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控方面具備特定的功能。2014年Kang等[8]在Stem Cells上發(fā)表的綜述中提到，Ω-6和Ω-3族PUFA及其代謝產(chǎn)物與細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能有關(guān)，它們可以通過多種作用機(jī)制，影響不同來源間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的生物學(xué)特性，例如促進(jìn)多種干細(xì)胞的增殖及分化，繼而影響干細(xì)胞的命運(yùn)調(diào)控。目前，關(guān)于PUFA在干細(xì)胞分化中的作用研究主要集中在PUFA來源的代謝產(chǎn)物，包括花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)、前列腺素 E2(prostaglandin E2，PGE2)、白三烯 B4(leukotriene B4，LTB4)、血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)和二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid，DPA)，而研究的細(xì)胞模型多以神經(jīng)干細(xì)胞為主，對(duì)MSCs的研究較少[8～9]。只有少量研究涉及DHA、EPA和AA等對(duì)人臍帶、骨髓來源MSCs增殖或分化方面的影響[10～11]。三系分化能力是鑒定MSCs的標(biāo)準(zhǔn)之一，已有研究表明脂肪酸能影響體外培養(yǎng)的成肌干細(xì)胞的分化[12]，但目前尚未有研究報(bào)道脂肪酸對(duì)ADSCs三系分化能力的影響。本研究旨在體外分離、培養(yǎng)ADSCs，并應(yīng)用不飽和脂肪酸作用于ADSCs，探究MUFA中的油酸和PUFA中的亞麻酸對(duì)ADSCs形態(tài)、增殖、免疫表型及分化潛能的影響，為ADSCs提供更優(yōu)化的培養(yǎng)體系，為脂肪酸應(yīng)用于MSCs提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

脂肪組織取自東莞市第五人民醫(yī)院的志愿者，使用含2%青鏈霉素混合液的生理鹽水保存。

杜氏磷酸緩沖鹽溶液(Dulbecco′s phosphatebuffered saline，DPBS)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、α-MEM(MEM alpha basic)培養(yǎng)基、0.125%胰酶(Gibco公司，美國(guó))；人血小板裂解液(Helios公司，美國(guó))；Ⅷ型膠原酶(Sigma公司，美國(guó))；油酸(＞85.0%，SG)、亞麻酸(＞70.0%，SG)(梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；MSC成脂誘導(dǎo)分化試劑盒、MSC成骨誘導(dǎo)分化試劑盒、MSC軟骨誘導(dǎo)分化試劑盒、阿利新藍(lán)、油紅O、茜素紅(賽業(yè)生物科技有限公司)；青鏈霉素混合液、4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)；流式單抗PE mouse IgG1 κ isotype control(PE-ISO，同型對(duì)照)、PE mouse anti-human CD13、PE mouse anti-human CD29、PE mouse anti-human CD44、PE mouse anti-human CD73、PE mouse anti-human CD90、PE mouse antihuman CD105、PE mouse anti-human CD31、PE mouse anti-human CD45(BD 公司，美國(guó))；TriQuick Reagent(北京索萊寶科技有限公司)；QIAzol Lysis Reagent(QIAGEN公司，德國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(TaKaRa公司，日本)；ultrapure distilled water(Invitrogen 公司，美國(guó))；BIOG血清血漿游離RNA提取試劑盒(常州百代生物科技股份有限公司)。

1.2 ADSCs的分離、培養(yǎng)與傳代

取志愿者皮下脂肪組織，使用含2%青鏈霉素混合液的生理鹽水與脂肪組織充分混勻，400g離心7 min后倒出脂肪組織，重復(fù)數(shù)次上述洗滌步驟，直至無明顯血液殘留。按照1︰1體積比加入0.15%Ⅷ型膠原酶溶液，充分混勻后置于37℃水浴鍋中消化30 min，期間每隔5 min混勻一次。消化完成后400g離心7 min，棄上層脂肪，細(xì)胞沉淀重懸于含1%青鏈霉素混合液和5%人血小板裂解液的α-MEM培養(yǎng)基中。將細(xì)胞懸液用100 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾后接種于T-175培養(yǎng)瓶，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)72 h后更換不含青鏈霉素混合液的培養(yǎng)基并除去未貼壁細(xì)胞，之后每隔3 d換液，細(xì)胞融合度達(dá)80%后用0.125%胰酶消化2～3 min，加入3倍體積的生理鹽水稀釋消化，以1︰3比例傳代，取第3～5代的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)增殖。

1.3 油酸或亞麻酸誘導(dǎo)ADSCs增殖的最佳濃度篩選

油酸、亞麻酸分別使用含5%人血小板裂解液的 α-MEM 培養(yǎng)基稀釋成 20 μmol/L、40 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L 的濃度梯度。將P5代ADSCs以每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板，細(xì)胞過夜貼壁后將培養(yǎng)基換成2 mL含不同濃度脂肪酸的培養(yǎng)基，以不加脂肪酸的培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，吸棄舊培養(yǎng)液并用生理鹽水清洗，隨后用0.125%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后，制備單細(xì)胞懸液。使用Counstar IM 1200自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活率。

為優(yōu)選最佳的使用濃度，首先設(shè)置大范圍的濃度梯度，得出合適的濃度范圍，再設(shè)置小范圍的濃度梯度來測(cè)定具體的數(shù)值。因此，將油酸、亞麻酸使用含5%人血小板裂解液的α-MEM培養(yǎng)基繼續(xù)稀釋成 10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L 的濃度梯度。將 P4 代 ADSCs以每孔2×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板，細(xì)胞過夜貼壁后將培養(yǎng)基換成2 mL含不同濃度脂肪酸的培養(yǎng)基，以不加脂肪酸的培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，吸棄舊培養(yǎng)液并用生理鹽水清洗，隨后用0.125%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后制備單細(xì)胞懸液并進(jìn)行計(jì)數(shù)，比較各組的細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活率。

1.4 油酸或亞麻酸對(duì)ADSCs形態(tài)的影響及生長(zhǎng)曲線繪制

取5×104個(gè)ADSCs(P3代)接種于10 cm的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞過夜貼壁后將培養(yǎng)基換成10 mL含20 μmol/L油酸或亞麻酸的完全培養(yǎng)基(含5%人血小板裂解液的α-MEM培養(yǎng)基)，以不加脂肪酸為空白對(duì)照組，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24 h在各組中隨機(jī)選擇3個(gè)培養(yǎng)皿，吸棄舊培養(yǎng)液并用生理鹽水清洗1次，吸棄生理鹽水后再加1 mL的0.125%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后，制備單細(xì)胞懸液，吹打混勻，取20 μL細(xì)胞懸液與20 μL 0.2%臺(tái)盼藍(lán)溶液混勻后加樣到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活率(每孔取3個(gè)視野計(jì)數(shù)后取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析)，以時(shí)間為橫軸，總細(xì)胞個(gè)數(shù)為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，在顯微鏡下觀察并記錄其形態(tài)是否有差異。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞免疫表型

取P3代細(xì)胞以4 500 cm-2的密度接種于T-175培養(yǎng)瓶，細(xì)胞過夜貼壁后將培養(yǎng)基換成含20 μmol/L油酸或亞麻酸的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以不加脂肪酸為空白對(duì)照組，細(xì)胞融合度達(dá)90%后，取各組細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的具體步驟如下:收集各組ADSCs并使用1 mL PBS重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，將1 mL細(xì)胞懸液均分至11個(gè)EP管中，每個(gè)EP管中的細(xì)胞數(shù)量為2.2×105個(gè)，3 000 r/min 離心 6 min，小心棄上清后再加入25 μL的PBS重懸細(xì)胞沉淀，將流式單抗PE-ISO(同型對(duì)照)及 CD13、CD29、CD31、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105 對(duì)應(yīng)的抗體各取 5 μL加入相應(yīng)的EP管中，陰性對(duì)照組加入5 μL的DPBS(未染色的細(xì)胞即為陰性對(duì)照)，混勻后4℃冰箱避光孵育30 min。孵育終止后，每管加入500 μL的PBS洗滌樣品，3 000 r/min離心6 min，小心棄上清。洗滌兩次后加入200 μL的PBS重懸，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到流式管中，采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面抗原的表達(dá)情況。

1.6 細(xì)胞三系分化能力檢測(cè)

取P3代的ADSCs細(xì)胞以4 500 cm-2的密度接種于T-175培養(yǎng)瓶，細(xì)胞過夜貼壁后將培養(yǎng)基換成含20 μmol/L油酸或亞麻酸的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以不加脂肪酸為空白對(duì)照組，細(xì)胞融合度達(dá)90%后，取各組細(xì)胞進(jìn)行成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)并染色鑒定。

成脂分化能力檢測(cè):取4.5×105個(gè)ADSCs接種到裝有2 mL MSC培養(yǎng)基的6孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，換成2 mL MSC成脂分化培養(yǎng)基A液[含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松、胰島素、吲哚美辛]；3 d后更換為2 mL培養(yǎng)基B液(含胰島素及10% FBS)；24 h后再更換成A液誘導(dǎo)，循環(huán)誘導(dǎo)7 d后使用油紅O染液進(jìn)行染色鑒定。

成骨分化能力檢測(cè):取4.5×105個(gè)ADSCs接種到裝有1 mL MSC培養(yǎng)基的12孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)到基本融合時(shí)，更換1 mL MSC成骨分化培養(yǎng)基，每隔2 d更換一次MSC成骨分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d后使用茜素紅進(jìn)行染色鑒定。

成軟骨分化能力檢測(cè):收集各組細(xì)胞并制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后取出含有1.0×106個(gè)ADSCs的細(xì)胞懸液，1 200 r/min離心獲得細(xì)胞沉淀，吸棄上清后加入10 μL MSC培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，取5 μL細(xì)胞沉淀置于24孔板，以形成細(xì)胞微團(tuán)。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h后向24孔板中加入1 mL MSC成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，每隔2 d換一次MSC成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d后使用阿利新藍(lán)染液進(jìn)行染色鑒定。

1.7 Q-PCR檢測(cè)成骨、成軟骨及成脂分化相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)水平

取P3代細(xì)胞以4 500 cm-2的密度接種于T-175培養(yǎng)瓶，細(xì)胞過夜貼壁后將培養(yǎng)基換成含20 μmol/L油酸或亞麻酸的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)90%后，取1×106個(gè)細(xì)胞接種到裝有2 mL完全培養(yǎng)基的6孔板中，每組重復(fù)2個(gè)孔，培養(yǎng)24 h后更換特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)9 d后根據(jù)QIAzol Lysis Reagent說明書分別提取各組ADSCs的總RNA，并用微量分光光度儀檢測(cè)RNA的濃度和純度，隨后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA作為模板，以GAPDH為內(nèi)參，采用Q-PCR檢測(cè)成脂標(biāo)志基因PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor-γ)、成軟骨標(biāo)志基因SOX9(SRY-related protein 9)和COL2A1(typeⅡ collagen-A1)以及成骨標(biāo)志基因ALP(alkaline phosphatase)、OCN(osteocalcin)、RUNX2(runt-related transcription factor 2)的mRNA表達(dá)水平。上下游引物均是根據(jù)NCBI提供的mRNA序列，使用Primer 3 Plus軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程股份有限公司最終合成。PCR引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR analysis

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的油酸或亞麻酸對(duì)ADSCs增殖的影響

為了得出油酸或亞麻酸誘導(dǎo)ADSCs增殖的最佳濃度，我們開展了濃度梯度實(shí)驗(yàn)。首先，設(shè)置油酸或亞麻酸的濃度梯度為 20 μmol/L、40 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L，結(jié)果如圖 1所示。當(dāng)油酸或亞麻酸濃度為20 μmol/L時(shí)，總細(xì)胞個(gè)數(shù)與對(duì)照組相比明顯升高(P＜0.05)，細(xì)胞活率無顯著變化(P＞0.05)；當(dāng)濃度達(dá)到 40 μmol/L 時(shí)，總細(xì)胞個(gè)數(shù)有降低的趨勢(shì)，而當(dāng)濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活率明顯降低(P＜0.05)(圖 1A～D)。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可初步得出，油酸或亞麻酸的適用濃度應(yīng)低于40 μmol/L。因此，我們進(jìn)一步開展了小范圍的濃度梯度實(shí)驗(yàn)，設(shè)置油酸或亞麻酸的濃度梯度為 10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，當(dāng)油酸或亞麻酸濃度達(dá)到20 μmol/L時(shí)，總細(xì)胞個(gè)數(shù)有明顯的上升(P＜0.01)(圖 1E，G)，而當(dāng)濃度達(dá)到 25 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的活率出現(xiàn)下降的趨勢(shì)(圖1F)。綜上可知，油酸或亞麻酸誘導(dǎo)ADSCs增殖的最佳濃度為20 μmol/L。

圖1 不同濃度的油酸或亞麻酸對(duì)ADSCs增殖的影響與空白對(duì)照組比較:*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Fig.1 Effects of different concentrations of oleic acid or linolenic acid on proliferation of ADSCs*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，compared with the control group.

2.2 油酸或亞麻酸對(duì)ADSCs生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞形態(tài)的影響

通過濃度梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出油酸或亞麻酸誘導(dǎo)ADSCs增殖的最佳濃度為20 μmol/L。因此，我們繪制了20 μmol/L油酸或亞麻酸培養(yǎng)的ADSCs的生長(zhǎng)曲線，并通過重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證油酸或亞麻酸是否能促進(jìn)ADSCs增殖。從圖2A可知，與對(duì)照組相比，20 μmol/L 亞麻酸培養(yǎng) 48 h、20 μmol/L油酸培養(yǎng)72 h后ADSCs數(shù)量顯著增加(P＜0.05)，而培養(yǎng)96 h后各組細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期，且總的細(xì)胞數(shù)量基本一致。從統(tǒng)計(jì)數(shù)量來看，與對(duì)照組相比，細(xì)胞在添加了脂肪酸的培養(yǎng)體系培養(yǎng)72 h后，其數(shù)量增加了20%左右。另外，從圖2B可知，油酸或亞麻酸組在各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的活率與對(duì)照組相比無顯著差異(P＞0.05)，且都大于95%。使用油酸或亞麻酸培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞形態(tài)如圖3所示，細(xì)胞長(zhǎng)梭形，較均一，呈旋渦狀或編織狀排列，各組細(xì)胞的形態(tài)無明顯差異。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，油酸或亞麻酸能夠促進(jìn)ADSCs增殖，且不會(huì)引起細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。

圖2 油酸或亞麻酸培養(yǎng)ADSCs的生長(zhǎng)曲線(A)及細(xì)胞活率(B)亞麻酸組與空白對(duì)照組比較:*P＜0.05；油酸組與空白對(duì)照組比較:#P＜0.05。Fig.2 The growth curve(A)and cell viability(B)of ADSCs cultured with oleic acid or linolenic acid*P＜0.05，the linolenic acid group compared with the control group；#P＜0.05，the oleic acid group compared with control group.

圖3 油酸或亞麻酸培養(yǎng)48 h后ADSCs的形態(tài)(40×)Fig.3 The morphology of ADSCs cultured with oleic acid or linolenic acid for 48 hours(40×)

2.3 油酸或亞麻酸培養(yǎng)后ADSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)情況

油酸、亞麻酸能促進(jìn)ADSCs增殖，為驗(yàn)證它們是否會(huì)影響ADSCs的干細(xì)胞特性，我們對(duì)其培養(yǎng)后的ADSCs進(jìn)行了表面抗原檢測(cè)。結(jié)果表明，20 μmol/L油酸或亞麻酸培養(yǎng)的ADSCs均表達(dá)CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，不表達(dá)或低表達(dá)CD31及CD45，細(xì)胞表型和不添加脂肪酸的空白對(duì)照組無差異(表2、圖4)。

圖4 不同實(shí)驗(yàn)組的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果(A)同型對(duì)照及陰性對(duì)照；(B)空白對(duì)照組；(C)油酸組；(D)亞麻酸組。Fig.4 The results of flow cytometry analysis in different experimental groups(A)The isotype control and negative control；(B)The control group；(C)The oleic acid group；(D)The linolenic acid group.

表2 油酸或亞麻酸培養(yǎng)后ADSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)情況Table 2 Expression of surface markers on ADSCs cultured with oleic acid or linolenic acid

2.4 油酸或亞麻酸培養(yǎng)后ADSCs的三系分化能力及分化相關(guān)基因的表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證油酸或亞麻酸培養(yǎng)是否對(duì)細(xì)胞的分化能力產(chǎn)生影響，我們對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行了成軟骨、成骨及成脂誘導(dǎo)和染色鑒定(圖5)，并從分子水平檢測(cè)了三系分化誘導(dǎo)培養(yǎng)9 d后相關(guān)標(biāo)志基因的mRNA表達(dá)水平。ADSCs在成軟骨誘導(dǎo)體系中誘導(dǎo)14 d后，細(xì)胞團(tuán)逐步形成一個(gè)密實(shí)且有彈性的乳白色小球，阿利新藍(lán)染色結(jié)果顯示軟骨細(xì)胞團(tuán)呈藍(lán)色。與對(duì)照組相比，油酸組及亞麻酸組誘導(dǎo)形成的軟骨細(xì)胞團(tuán)體積較大，形態(tài)較完整。Q-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，油酸組及亞麻酸組的成軟骨標(biāo)志基因SOX9和COL2A1的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增高(P＜0.05，圖6A～B)。細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)14 d后，茜素紅染色可見密集的細(xì)胞間散在大量的染為橘紅色的礦化結(jié)節(jié)，說明誘導(dǎo)后細(xì)胞周圍有明顯鈣沉積。其中，亞麻酸組生成的礦化結(jié)節(jié)稠密且染色最深，油酸組次之，而對(duì)照組生成的礦化結(jié)節(jié)面積較小且分散。Q-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，油酸組或亞麻酸組的成骨標(biāo)志基因ALP、OCN及RUNX2的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增高(P＜0.05，圖6C～E)。細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)7 d后進(jìn)行油紅O染色，顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)脂滴呈鮮紅色且邊界清晰。在油酸或亞麻酸增殖培養(yǎng)后的ADSCs內(nèi)脂滴的大小和數(shù)量均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，且成脂標(biāo)志基因PPAR-γ的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組有顯著增加(P＜0.01，圖6F)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明油酸或亞麻酸能促進(jìn)ADSCs的三系分化能力。此外，從表3的數(shù)據(jù)可得出，與成軟骨及成脂相關(guān)基因的表達(dá)水平相比，油酸或亞麻酸對(duì)ADSCs成骨分化能力的促進(jìn)更為顯著。

表3 各組ADSCs三系誘導(dǎo)分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)Table 3 The mRNA expression data of multilineage differentiation of ADSCs in each group

圖5 各組ADSCs的成軟骨分化(40×)、成骨分化(40×)和成脂分化(200×)效果Fig.5 Chondrogenesis(40×)，osteogenesis(40×)，and adipogenesis(200×)of ADSCs in each group

圖6 各組ADSCs三系誘導(dǎo)分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較:*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Fig.6 The mRNA expression levels of multilineage differentiation of ADSCs in each group*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，compared with the control group.

3 討論

MSCs是一種多能成體干細(xì)胞，存在于胎盤、臍帶、骨髓和脂肪等多種組織中，具有一定的分化潛能，可分泌多種利于組織重塑和免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子，這些特性使得MSCs成為治療各種先天性和后天性疾病的出色候選者[14]。脂肪來源的MSCs具有來源豐富、取材方便、回植體內(nèi)無需配型、免疫原性低、無腫瘤化傾向、可避免倫理法律問題等優(yōu)點(diǎn)，在臨床研究方面使用廣泛[1]。國(guó)內(nèi)臨床研究顯示，18名骨關(guān)節(jié)炎患者接受了不同劑量的自體脂肪來源的MSCs注射，96周的隨訪結(jié)果表明，關(guān)節(jié)內(nèi)注射ADSCs可以改善患者膝關(guān)節(jié)的疼痛、功能和軟骨體積[15]。另有研究表明，ADSCs移植可減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管新生、促進(jìn)肉芽組織形成以及加速上皮化形成等，從而促進(jìn)糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合[16]。在醫(yī)療美容領(lǐng)域，有研究表明ADSCs可用于豐胸豐唇、促進(jìn)皮膚再生和傷口愈合、治療脫發(fā)等[17～18]。臨床試驗(yàn)和組織再生工程需要大量具有生物學(xué)活性的ADSCs，但是脂肪供體可以提供的脂肪樣本量有限，且細(xì)胞在體外擴(kuò)增培養(yǎng)的時(shí)間也有上限。為更好地滿足臨床需求，有必要在不降低細(xì)胞生物學(xué)活性的前提下，提高單位時(shí)間內(nèi)收獲的ADSCs的數(shù)量和質(zhì)量。為實(shí)現(xiàn)這一目的，我們?cè)诩?xì)胞分離技術(shù)、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等多方面進(jìn)行技術(shù)攻關(guān)，提高ADSCs從組織中的分離效率以及在培養(yǎng)過程中的擴(kuò)增效率。

ADSCs分離方法主要包括組織塊貼壁法、膠原酶消化法、機(jī)械分離法、膠原酶結(jié)合組織塊貼壁法和懸浮培養(yǎng)法等，其中主流的分離方法是組織塊貼壁法和膠原酶消化法[19]。Ⅷ型膠原酶來源于溶組織梭菌，可產(chǎn)生粗膠原酶，具有梭菌蛋白酶、非特異性中性蛋白酶和胰蛋白酶活性，經(jīng)測(cè)試適合脂肪細(xì)胞的消化和解離[20]。本研究采用0.15%Ⅷ型膠原酶對(duì)脂肪組織進(jìn)行消化，結(jié)果顯示該分離方法可獲得形態(tài)均一的ADSCs。目前，MSCs的體外培養(yǎng)擴(kuò)增體系常用基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加一定濃度的FBS，但FBS可能攜帶某些未確診的動(dòng)物傳染病病毒或者含有致病性的朊病毒蛋白質(zhì)以及針對(duì)胎?？乖漠惙N蛋白質(zhì)，在培養(yǎng)過程中動(dòng)物源的蛋白質(zhì)或肽段可能會(huì)污染MSCs，從而使其輸入人體后發(fā)生免疫排斥反應(yīng)[21]。研究發(fā)現(xiàn)，人血小板裂解液可以在體外擴(kuò)增培養(yǎng)MSCs，且并不會(huì)引起MSCs生物學(xué)特性的改變[22]。另外，人血小板裂解液來源于人類，臨床應(yīng)用安全性高，故可作為FBS合適而安全的替代品。本研究使用0.15%Ⅷ型膠原酶進(jìn)行組織消化后，使用含5%人血小板裂解液的α-MEM培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)體系。在此基礎(chǔ)上，我們創(chuàng)新性地提出了在培養(yǎng)體系中加入一定濃度的油酸或亞麻酸。亞麻酸是Ω-3族PUFA中EPA及DHA的合成前體，其可能通過環(huán)氧化酶(cyclooxygenase-2，COX-2)代謝通路，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物前列腺素(prostaglandin，PG)，進(jìn)而促進(jìn)多種干細(xì)胞的增殖[8]。另外，有研究報(bào)道在20～60 μmol/L濃度范圍內(nèi)，反油酸和反異油酸能夠顯著促進(jìn)ADSCs的成脂分化，其作用呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，其機(jī)制可能與Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)[23]。

本研究將ADSCs使用20 μmol/L油酸或亞麻酸培養(yǎng)72 h后，與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞數(shù)量增加了20%左右(圖2A)，所獲得的ADSCs高表達(dá)CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，低表達(dá)CD31、CD45，和不添加脂肪酸的培養(yǎng)基獲得的ASDCs無顯著差異(表2、圖4)。在促進(jìn)細(xì)胞增殖的同時(shí)，我們的培養(yǎng)方法也提高了細(xì)胞三系分化潛能(圖5)，與成軟骨及成脂相關(guān)基因的表達(dá)水平相比，油酸或亞麻酸對(duì)成骨分化的影響更為顯著(圖6C～E)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，油酸或亞麻酸的濃度大于100 μmol/L時(shí)會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡(圖 1A～D)；而在 20～40 μmol/L 有效濃度范圍內(nèi)可促進(jìn)ADSCs的增殖(圖1E～F)，且不會(huì)影響其干細(xì)胞特性。因此，低濃度的油酸或亞麻酸可考慮用作添加劑制備促進(jìn)ADSCs增殖的培養(yǎng)基，在提高細(xì)胞增殖率的同時(shí)，又能提高細(xì)胞的分化潛能，從而快速獲得更多穩(wěn)定可靠的ADSCs，以用于各種基礎(chǔ)研究及疾病治療的臨床試驗(yàn)。需要指出的是，油酸及亞麻酸促進(jìn)ADSCs增殖及分化的機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究，且作為添加劑加入培養(yǎng)基中時(shí)，培養(yǎng)所得ADSCs的安全性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。