小鼠持續(xù)葡萄糖監(jiān)測(cè)技術(shù)的建立及其血糖時(shí)間序列的多尺度熵分析

李 成，張明亮，應(yīng)令雯，蘇嬌溶，陶 睿，于 霞，包玉倩，周 健

1.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，上海市糖尿病研究所，上海市糖尿病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市糖尿病臨床醫(yī)學(xué)中心，上海200233；2.東北大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院，沈陽(yáng)110819

目前， 持續(xù)葡萄糖監(jiān)測(cè)（continuous glucose monitoring，CGM）已廣泛應(yīng)用于臨床，為糖尿病及其并發(fā)癥等相關(guān)研究提供了海量的葡萄糖數(shù)據(jù)［1］?；A(chǔ)研究中，常使用血糖儀檢測(cè)等方法獲取糖尿病、肥胖等代謝性疾病動(dòng)物模型的血糖水平，但該方法會(huì)受到許多因素的影響，如應(yīng)激反應(yīng)（小鼠模型）、采血頻率不一致等，難以全面反映疾病進(jìn)展中血糖水平的連續(xù)變化。新近研發(fā)的以全植入式血糖遙測(cè)系統(tǒng)為基礎(chǔ)的小鼠CGM 技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)在小鼠自由活動(dòng)的狀態(tài)下，每10 s 或60 s獲得1 個(gè)血糖數(shù)據(jù)并連續(xù)收集4周以上［2］。因此，該系統(tǒng)的應(yīng)用可減少甚至解決傳統(tǒng)采血方式存在的諸多問(wèn)題。同時(shí)，該系統(tǒng)還可記錄小鼠的體溫及活動(dòng)情況，被認(rèn)為是代謝性疾病藥理學(xué)及生理學(xué)研究的一種新方法［3］。

近年來(lái)，時(shí)間序列分析越來(lái)越廣泛地被應(yīng)用于生理信號(hào)分析領(lǐng)域。其中，多尺度熵（multiscale entropy，MSE）分析是一種分析長(zhǎng)時(shí)間序列復(fù)雜度的方法，能夠在不同時(shí)間尺度上量化時(shí)間序列的復(fù)雜性［4］。目前，該方法已應(yīng)用于2 型糖尿病血糖時(shí)間序列復(fù)雜度的分析［5-6］。研究［7］顯示肥胖人群是糖尿病高危人群之一，因此明確肥胖人群的糖代謝變化特征是探究肥胖和糖尿病相關(guān)機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。采用傳統(tǒng)的時(shí)點(diǎn)血糖測(cè)定或口服葡萄糖耐量試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，部分肥胖人群的血糖水平處于正常范圍［8］。2014年Salkind等［8］針對(duì)血糖水平正常的肥胖人群進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該類人群的血糖波動(dòng)幅度已有明顯上升，其頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度較非肥胖對(duì)照人群增大，提示該增厚可能與血糖波動(dòng)相關(guān)。因此，應(yīng)用新的監(jiān)測(cè)技術(shù)及統(tǒng)計(jì)分析方法探究肥胖人群血糖及其波動(dòng)特征，或?qū)樘悄虿〉脑缙诜乐渭捌渑c肥胖相關(guān)的作用機(jī)制研究提供新思路。

研究［9］顯示，C57BL/6J 小鼠和飲食誘導(dǎo)肥胖（dietinduced obesity，DIO）型小鼠是研究肥胖等代謝性疾病病理生理機(jī)制的常用動(dòng)物模型。而針對(duì)DIO 小鼠模型，尚未獲得較為全面的血糖數(shù)據(jù)及血糖時(shí)間序列復(fù)雜度的相關(guān)信息?；诖?，本研究建立以全植入式血糖遙測(cè)系統(tǒng)為基礎(chǔ)的小鼠CGM技術(shù)，結(jié)合MSE分析方法，對(duì)小鼠的血糖時(shí)間序列復(fù)雜度進(jìn)行分析，以期為糖尿病、肥胖等代謝性疾病的動(dòng)物模型提供更為詳細(xì)且準(zhǔn)確的血糖信息，同時(shí)為糖代謝早期異常相關(guān)研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20 周齡SPF 級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠3 只（對(duì)照組），體質(zhì)量30～35 g；20 周齡SPF 級(jí)雄性DIO 型C57BL/6J 小鼠3 只（DIO 組），體質(zhì)量45～50 g。上述2 種小鼠均購(gòu)于江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2018-0008。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于上海頓慧醫(yī)療科技發(fā)展有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)籠中，動(dòng)物使用許可證：SYXK（滬）2016-0015。對(duì)照組小鼠飼以普通飼料，DIO 組小鼠飼以高脂飼料（含60%脂肪）。飼養(yǎng)條件：溫度21～24 ℃、濕度40%～70%、光照12/12 h，自由進(jìn)食、飲水。本研究根據(jù)上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)指導(dǎo)，按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》對(duì)動(dòng)物進(jìn)行操作。

1.1.2 主要試劑和儀器 葡萄糖［生工生物工程（上海）股份有限公司］，戊巴比妥鈉（Bioszune Life Sciences DEP，美國(guó)）。血糖儀及血糖試紙（Roche，德國(guó)），小動(dòng)物手術(shù)顯微鏡、小動(dòng)物體溫維持儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）。醫(yī)用5-0帶線縫合針、醫(yī)用5-0縫合線（上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司）。全植入式血糖遙測(cè)系統(tǒng)（包括電腦終端及數(shù)據(jù)軟件、Matrix 2.0數(shù)模轉(zhuǎn)換裝置、塑料籠接收器及HD-XG 血糖遙測(cè)植入子）（Date Sciences International，美國(guó)）。

1.2 研究方法

1.2.1 小鼠HD-XG 血糖遙測(cè)植入子植入手術(shù) 分別稱量2組小鼠的體質(zhì)量，并按100 mg/kg計(jì)算1%戊巴比妥鈉用量，對(duì)其進(jìn)行麻醉。取小鼠仰臥位，固定后對(duì)頸部手術(shù)區(qū)域進(jìn)行備皮。手術(shù)區(qū)域經(jīng)消毒鋪巾后，于正中左側(cè)處取約1 cm 頸動(dòng)脈切口，于顯微鏡下鈍性分離左側(cè)頸動(dòng)脈周圍的脂肪及結(jié)締組織，應(yīng)避免傷及迷走神經(jīng)。在左側(cè)頸總動(dòng)脈分叉處使用醫(yī)用5-0縫合線結(jié)扎，并在結(jié)扎的尾端放置一根約4 cm 的手術(shù)線以備后期固定HD-XG血糖遙測(cè)植入子（圖1A）。用針尖在左側(cè)頸總動(dòng)脈形成一小切口，將HD-XG 血糖遙測(cè)植入子的傳感器探頭部分沿著切口插入動(dòng)脈，植入子前端感受器至主動(dòng)脈弓2 mm（圖1B），具體長(zhǎng)度可參照植入子前端長(zhǎng)度標(biāo)記。結(jié)扎提前放置的手術(shù)線，以將傳感器探頭固定在動(dòng)脈內(nèi)。HD-XG 血糖遙測(cè)植入子信號(hào)發(fā)射器部分置于小鼠腹部右側(cè)皮下（圖1C）?？p合頸部切口，并行碘伏消毒。

1.2.2 術(shù)后護(hù)理 術(shù)后，將2 組小鼠分別置于體溫維持儀（37 ℃）中保溫，蘇醒后行單籠飼養(yǎng)。DIO 組小鼠仍以高脂飼料喂養(yǎng)，對(duì)照組小鼠以普通飼料喂養(yǎng)。術(shù)后第2日，用碘伏對(duì)小鼠縫合處進(jìn)行消毒，并將飼養(yǎng)籠置于與全植入式血糖遙測(cè)系統(tǒng)連接好的接收器上方。

1.2.3 全植入式血糖遙測(cè)系統(tǒng)的使用及校準(zhǔn) 用磁鐵靠近小鼠植入子腹側(cè)，以啟動(dòng)植入子。按照Ponemah v6.41 系統(tǒng)操作搜尋并匹配每只小鼠對(duì)應(yīng)的植入子，輸入植入子對(duì)應(yīng)參數(shù)，設(shè)置血糖、體溫2個(gè)通道，待校準(zhǔn)后系統(tǒng)將自動(dòng)記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。為排除手術(shù)對(duì)血糖及體溫可能造成的影響，取2組小鼠術(shù)后第10～14日的血糖和體溫?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行分析。

配置20%葡萄糖溶液，按照劑量1 g/kg 向小鼠行腹腔注射。注射前，取小鼠尾靜脈血檢測(cè)血糖水平，記錄為參考值1；注射后15 min，再次取尾靜脈血進(jìn)行檢測(cè)，記錄為參考值2。當(dāng)|參考值1-參考值2|>3 mmol/L，則校準(zhǔn)成功。系統(tǒng)每7～14 d需校準(zhǔn)1次。

圖1 HD-XG血糖遙測(cè)植入子植入小鼠的手術(shù)模式圖Fig 1 Operation pattern of HD-XG glucose telemetry implant in mice

1.2.4 血糖時(shí)間序列復(fù)雜度分析 采用MSE 分析小鼠血糖時(shí)間序列的復(fù)雜度。MSE 的基本原理是對(duì)時(shí)間序列進(jìn)行粗?；谠絹?lái)越粗略的時(shí)間分辨率下分析時(shí)間序列［4］。熵值大小與時(shí)間序列的規(guī)律性相關(guān)，熵值越大則血糖時(shí)間序列的重復(fù)模式越少，表明該血糖時(shí)間序列具有較高的復(fù)雜度。利用MATLAB R2019b軟件對(duì)獲得的血糖時(shí)間序列進(jìn)行分析，選取小鼠術(shù)后第11～17日的血糖數(shù)據(jù)，對(duì)其血糖時(shí)間序列復(fù)雜度進(jìn)行MSE 分析，將2 組中的每只小鼠的血糖時(shí)間序列分解到1～10 的尺度上（對(duì)應(yīng)序列的時(shí)間長(zhǎng)度為1～10 min），計(jì)算每個(gè)尺度上對(duì)應(yīng)的熵值，并進(jìn)行組間比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料以x±s 表示，采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 全植入式血糖遙測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)2 組小鼠的記錄時(shí)間及血糖數(shù)據(jù)

本研究中，6只小鼠均成功完成了植入手術(shù)，并順利收集了相關(guān)數(shù)據(jù)，提示以全植入式血糖遙測(cè)系統(tǒng)為基礎(chǔ)的小鼠CGM技術(shù)建立完成。經(jīng)植入后，全植入式血糖遙測(cè)系統(tǒng)每1 min記錄1次血糖數(shù)據(jù)，6只小鼠共計(jì)收集了232 887個(gè)血糖數(shù)據(jù)。6只小鼠的平均記錄時(shí)間為（27.3±9.3）d，每只小鼠的系統(tǒng)記錄時(shí)間及血糖值數(shù)量（包括有效值及無(wú)效值）如表1所示。

表1 全植入式血糖遙測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)2組小鼠的記錄時(shí)間及血糖值數(shù)量Tab 1 Recording time and the number of glucose values of the two groups monitored by implantable glucose telemetry system

2.2 2組小鼠體質(zhì)量、血糖及體溫?cái)?shù)據(jù)比較

DIO 組小鼠的體質(zhì)量高于對(duì)照組［（45.6±1.3）g vs（31.7±2.1）g，P=0.001］。通過(guò)對(duì)2 組小鼠術(shù)后第10～14日的血糖和體溫?cái)?shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示：DIO 組小鼠5 d 的平均血糖為（7.04±0.71）mmol/L，對(duì)照組小鼠為（6.92±0.48）mmol/L，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DIO 組小鼠5 d的平均體溫為（33.34±0.18）℃，對(duì)照組小鼠為（33.79±0.68）℃，組間差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，經(jīng)全植入式血糖遙測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)的2 組中每只小鼠第10～14 日的平均血糖和體溫水平見(jiàn)表2，該連續(xù)5 d 2 組小鼠的血糖及體溫水平圖譜見(jiàn)圖2、3。

表2 2組中每只小鼠第10～14日的平均血糖和體溫Tab 2 Mean blood glucose and body temperature of each mouse in the two groups from Day 10 to Day 14

圖2 2組小鼠第10～14日的血糖圖譜Fig 2 Glucose profiles of mice in the two groups from Day 10 to Day 14

圖3 2組小鼠第10～14日的體溫水平圖譜Fig 3 Body temperature profiles of mice in the two groups from Day 10 to Day 14

2.3 2組小鼠血糖時(shí)間序列復(fù)雜度的MSE分析

圖4 2組小鼠不同時(shí)間尺度下血糖時(shí)間序列的熵值Fig 4 Entropy of glucose time series on different scales in the two groups

小鼠血糖時(shí)間序列復(fù)雜度的MSE 分析結(jié)果（圖4）顯示：在1～10 的時(shí)間尺度下，2 組小鼠熵值逐漸增加，即血糖時(shí)間序列復(fù)雜度增加；而在每一個(gè)時(shí)間尺度上，DIO 組小鼠的血糖時(shí)間序列復(fù)雜度均低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

目前，CGM 作為葡萄糖監(jiān)測(cè)的有效工具之一，可提供連續(xù)、全面、可靠的葡萄糖譜，已逐漸在臨床治療及研究中廣泛應(yīng)用，但在動(dòng)物模型的研究中該技術(shù)仍處于發(fā)展階段。本研究以全植入式血糖遙測(cè)系統(tǒng)為基礎(chǔ)，建立了小鼠CGM 技術(shù)，該技術(shù)不僅具有較長(zhǎng)的使用壽命、較高的準(zhǔn)確性，還可使動(dòng)物在監(jiān)測(cè)期間的活動(dòng)不受限制［10］。研究［11-14］顯示，該系統(tǒng)主要應(yīng)用于大鼠、猴等模型。如在大鼠的減重手術(shù)模型中，Lu 等［13］成功應(yīng)用了該技術(shù)并獲得了代謝手術(shù)前后大鼠血糖的變化情況。由于在大鼠模型中葡萄糖傳感器探頭植入手術(shù)難度相對(duì)較低，即植入腹主動(dòng)脈，而在小鼠模型中植入頸動(dòng)脈，其血管相對(duì)較細(xì)，手術(shù)難度較高，需要更細(xì)致的手術(shù)操作。因此，小鼠CGM技術(shù)的建立仍待進(jìn)一步優(yōu)化。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型CGM 技術(shù)的建立，使得對(duì)血糖特征的研究從“點(diǎn)”（各時(shí)點(diǎn)血糖）到“線”（持續(xù)血糖監(jiān)測(cè)）成為可能。全植入式血糖遙測(cè)系統(tǒng)可獲得大量的血糖數(shù)據(jù)（如每60 s 獲得1 個(gè)血糖值，則每日可獲得1 440 個(gè)），而使用常規(guī)的均值計(jì)算方法（如平均值、標(biāo)準(zhǔn)差等）對(duì)血糖波動(dòng)特征進(jìn)行分析則會(huì)使數(shù)據(jù)利用率較低，造成一定程度的資源浪費(fèi)，且難以進(jìn)一步分析血糖的波動(dòng)規(guī)律。近年來(lái)，時(shí)間序列分析在代謝性疾病研究的應(yīng)用逐漸增加，不僅為分析與代謝相關(guān)的生理信號(hào)提供新的方向和思路，同時(shí)也為發(fā)現(xiàn)如肥胖、糖尿病等臨床前期的病理生理改變提供更多的可能［15-16］。

本研究結(jié)合MSE 分析方法，對(duì)小鼠血糖時(shí)間序列的復(fù)雜度進(jìn)行分析。MSE 這一概念由Costa 等［17］提出，已應(yīng)用于生理數(shù)據(jù)如姿勢(shì)、血糖［6，18］等方面。MSE 應(yīng)用于血糖時(shí)間序列分析時(shí)，不僅能夠體現(xiàn)血糖序列在時(shí)間尺度上的規(guī)律性，提取更全面的血糖數(shù)據(jù)有效信息，還可以從不同角度分析代謝性疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的血糖波動(dòng)規(guī)律。Raubertas 等［19］在恒河猴糖尿病模型的研究中發(fā)現(xiàn)，與正常恒河猴相比，其血糖時(shí)間序列復(fù)雜度較低。一項(xiàng)采用全植入式血糖遙測(cè)系統(tǒng)并結(jié)合MSE 分析方法的研究［20］發(fā)現(xiàn)，在自發(fā)型肥胖型糖尿?。╖ucker diabetic fatty，ZDF）大鼠出現(xiàn)明顯血糖升高的癥狀之前（即糖尿病前期），血糖時(shí)間序列復(fù)雜度已經(jīng)降低。DIO 小鼠是糖尿病、肥胖等代謝性疾病常用的動(dòng)物模型。本研究結(jié)果顯示DIO 組小鼠的血糖水平尚未達(dá)到糖代謝異常水平，即與對(duì)照組血糖的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但利用MSE 分析DIO 組小鼠血糖時(shí)間序列復(fù)雜度發(fā)現(xiàn)，其復(fù)雜度低于對(duì)照組且組間差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮可能與樣本量較小有關(guān)。

既往研究［21］發(fā)現(xiàn)，生物信號(hào)的復(fù)雜度可隨著疾病的出現(xiàn)和年齡的增加逐漸下降。Chen 等［6］對(duì)2 型糖尿病患者的血糖時(shí)間序列復(fù)雜度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其較正常人群有明顯降低。來(lái)云云等［22］研究顯示，血糖水平控制不佳以及血糖波動(dòng)大均可造成2型糖尿病患者血糖時(shí)間序列動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)復(fù)雜度的損失。同樣，利用時(shí)間序列分析對(duì)胰島素分泌模式的研究［16］顯示，糖耐量受損個(gè)體的胰島素分泌率、血糖曲線在中餐后發(fā)生“畸變”，且缺乏“三峰兩谷”的變化特征，這可能是胰島素分泌模式復(fù)雜度降低的表現(xiàn)。因此，血糖時(shí)間序列復(fù)雜度可能是糖尿病或糖尿病前期的預(yù)測(cè)新指標(biāo)，但仍需進(jìn)一步在不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和人群中進(jìn)行研究。

在成功建立以全植入式血糖遙測(cè)系統(tǒng)為基礎(chǔ)的小鼠CGM 技術(shù)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)存在以下問(wèn)題值得關(guān)注：首先，全植入式血糖遙測(cè)系統(tǒng)的使用條件之一即為植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，要求操作人員具有較高的手術(shù)技術(shù)水平，因此，該類人員需經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)并反復(fù)練習(xí)后方可進(jìn)行實(shí)操；第二，術(shù)后小鼠需要恢復(fù)時(shí)間，且對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境和條件有一定要求；第三，全植入式血糖遙測(cè)系統(tǒng)購(gòu)置費(fèi)用相對(duì)較高，或?qū)⒔o大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本研究造成一定的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，需在開(kāi)展研究前進(jìn)行評(píng)估。本研究尚存在部分局限性：①樣本量較小，尚需增加樣本數(shù)量。②由于實(shí)驗(yàn)條件有限，2 組小鼠的血糖監(jiān)測(cè)時(shí)長(zhǎng)存在不齊同的問(wèn)題，且僅對(duì)DIO 小鼠一段時(shí)間內(nèi)的血糖進(jìn)行監(jiān)測(cè)，未來(lái)應(yīng)在不同階段對(duì)DIO 小鼠及對(duì)照小鼠進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，同時(shí)在系統(tǒng)允許范圍內(nèi)延長(zhǎng)監(jiān)測(cè)時(shí)間，以進(jìn)一步探究其糖代謝特征。③僅對(duì)DIO 小鼠的血糖及體溫水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)，未分析其他表型與糖代謝變化的關(guān)系，未來(lái)應(yīng)對(duì)其活動(dòng)量、體溫與血糖變化之間的關(guān)系行進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究在國(guó)內(nèi)首次成功建立了小鼠CGM技術(shù)，并結(jié)合MSE 分析方法，獲得了代謝性疾病研究中常用的DIO 小鼠更為全面的血糖信息；本研究結(jié)果或?qū)榇x性疾病的研究技術(shù)手段提供一定的參考。