紅富士蘋(píng)果樹(shù)皮中的根皮苷的提取 及抗氧化活性研究

夏琳，趙媛，時(shí)志春，王丹，李軍，王金蘭，趙明，張樹(shù)軍

（齊齊哈爾大學(xué) 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

蘋(píng)果（Malus pumila Mill.）為薔薇科蘋(píng)果屬落葉喬木，是世界上種植量最大的果樹(shù)之一，在我國(guó)遼寧、山西、山東、河北、陜西、甘肅、云南、四川、新疆等地廣泛種植。研究表明，蘋(píng)果枝葉及樹(shù)皮富含根皮苷[1]。根皮苷是二氫查爾酮葡萄糖苷，具有降低血糖、改善記憶力、抗氧化、抗癌等多種重要的生物活性，在新型藥物和天然保健食品開(kāi)發(fā)中具有廣泛的應(yīng)用前景[2]。由于蘋(píng)果樹(shù)與其他果樹(shù)一樣，在其生長(zhǎng)過(guò)程中，為了有效控制產(chǎn)量和質(zhì)量，整形與修剪是必不可少的重要環(huán)節(jié)，但每年修剪下來(lái)的枝條一般會(huì)被丟棄或焚燒，得不到很好的利用，大量的蘋(píng)果樹(shù)枝資源被浪費(fèi)。為開(kāi)發(fā)蘋(píng)果植物資源利用，本文以紅富士蘋(píng)果樹(shù)皮為原料提取富集根皮苷的方法及所得提取物的抗氧化活性進(jìn)行了初步研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

儀器：Aglient 1200 高效液相色譜儀（G1311A 四元泵，G1314B VWD 紫外檢測(cè)器，Chemstation 色譜工作站，美國(guó)安捷倫公司）；BT 124S/BT 25S 分析天平，賽多利斯貿(mào)易有限公司。試劑：甲醇、乙腈均為色譜醇，購(gòu)于山東禹王公司；水為娃哈哈純凈水；DPPH（1,1-二苯基-2-苦肼基＞97.0%），購(gòu)于梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；VC（L-抗壞血酸＞99.0%），購(gòu)于東京化成工業(yè)株式會(huì)社；磷酸，冰乙酸，正丁醇，無(wú)水乙醇均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

實(shí)驗(yàn)原料紅富士蘋(píng)果樹(shù)皮于2016 年12 月20 日在甘肅省慶陽(yáng)市慶城縣采集，切碎后室內(nèi)陰干晾干，經(jīng)齊齊哈爾大學(xué)時(shí)志春博士鑒定為蘋(píng)果樹(shù)皮，標(biāo)本（MP-20161220）收藏于齊齊哈爾大學(xué)天然產(chǎn)物研究室。

1.2 提取物的制備

1.2.1 水提法

取干燥的紅富士蘋(píng)果樹(shù)皮250 g，加400 mL 水，80 ℃恒溫浸泡提取1 h 后過(guò)濾，重復(fù)4 次，合并提取液得蘋(píng)果樹(shù)皮水提液。取蘋(píng)果樹(shù)皮水提液200 mL，每次用乙酸乙酯200 mL 萃取3 次，合并萃取液濃縮至恒重得乙酸乙酯萃取物（WE）。乙酸乙酯萃取后的水層每次用正丁醇200 mL 萃取3 次，合并萃取液濃縮至恒重得正丁醇萃取物（WE-D）；另取蘋(píng)果樹(shù)皮水提液4 份，每份200 mL，分別用正丁醇、乙酸乙酯-正丁醇 =4/1, 3/1, 2/1（V/V）的混合溶劑溶劑200 mL 萃取3 次，合并相同溶劑萃取液濃縮至恒重得正丁醇萃取物（WD）、乙酸乙酯-正丁醇4/1 萃取物（WE4/D1）、3/1 萃取物（WE3/D1）、2/1 萃取物（WE2/D1）；再取蘋(píng)果樹(shù)皮水提液200 mL，每次用正己烷-乙酸乙酯=2/1 的混合溶劑溶劑200 mL 萃取3 次，合并萃取液濃縮至恒重得正己烷-乙酸乙酯2/1 萃取物（WH2/E1），萃取后的水層每次用正丁醇200 mL 萃取3 次，合并萃取液濃縮至恒重得正丁醇萃取物（WH2/E1-D）；未萃取的水提液減壓濃縮至恒重得蘋(píng)果樹(shù)皮水提物（W）。

1.2.2 甲醇提取法

取干燥的紅富士蘋(píng)果樹(shù)皮200 g，每次用300 mL 甲醇室溫浸泡提取3 d 后過(guò)濾，重復(fù)3 次，合并浸泡液混勻后分成2 份，1 份濃縮至恒重得到蘋(píng)果樹(shù)皮甲醇提取物（M）。另1 份濃縮至小體積加水混懸后，每次用300 mL 正己烷萃取3 次，合并萃取液濃縮至恒重得到正己烷萃取物（MH）；正己烷萃取后的水層每次用乙酸乙酯300 mL 萃取3 次，合并萃取液濃縮至恒重得乙酸乙酯萃取物（ME）；乙酸乙酯萃取后的水層每次用正丁醇300 mL 萃取3 次，合并萃取液濃縮至恒重得正丁醇萃取物（MD）。

將以上制得的各種提取物配置成質(zhì)量濃度為0.50 mg/mL 的甲醇溶液，備用。

1.3 根皮苷的色譜分析

準(zhǔn)確稱(chēng)量6.0 mg 根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配制成濃度為1.00 mg/mL 的根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。在色譜儀上，選用Hypersil BDS-C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）色譜柱，體積分?jǐn)?shù)0.04%的磷酸水溶液和乙腈作為流動(dòng)相，在檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm，柱溫30 ℃，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量5 μL 的色譜條件下梯度洗脫，梯度變化：5～15 min, 85/15→80/20; 15～25 min, 80/20→78/22; 25～30 min, 78/22→70/30; 30～40 min, 70/30→30/70。

取配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇分別配制濃度為0.02, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 mg/mL 的溶液，用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，在上述色譜條件下每次進(jìn)樣5 μL 進(jìn)行色譜分析，每一質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)量3 次，并記錄峰面積，取得平均值。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（x）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品線(xiàn)性回歸方程：y=1 899x-66.64，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，表明在0.02～0.5 mg/mL的濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。在同樣色譜條件下對(duì)“1.2”節(jié)中制得的蘋(píng)果樹(shù)皮各種提取物進(jìn)行根皮苷的含量分析，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，峰面積取平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算根皮苷含量。

1.4 抗氧化活性測(cè)試

取7.5 mg DPPH 溶于20 mL 乙醇溶液中，配制成DPPH 乙醇溶液（測(cè)定時(shí)稀釋10 倍）。將待測(cè)樣品配置成濃度為200, 100, 20, 10, 2 μg/mL 的乙醇溶液；將VC 配置成濃度為100, 50, 10, 5, 1 μg/mL 的乙醇溶液，各取上述溶液20 μL 加入96 孔板中，再加入180 μL 稀釋后的DPPH 溶液。在孔板中加入Blank（200 μL EtOH），Control（20 μL EtOH+180 μL DPPH），避光反應(yīng)30 min，在517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并按式(1)計(jì)算VC 和樣品對(duì)DPPH 自由基的清除率（SR）。

式中，A照對(duì)為對(duì)照品吸光度；A樣品為樣品吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 根皮苷的含量分析

將紅富士蘋(píng)果樹(shù)皮分別采用醇提和水提2 種方法進(jìn)行提取，使用不同溶劑進(jìn)行萃取制得13 種提取物，不同提取物中根皮苷相對(duì)含量測(cè)定結(jié)果如表1 所示。

依據(jù)表1 的結(jié)果，對(duì)比1 號(hào)和10 號(hào)根皮苷的含量可知，甲醇提取物中根皮苷含量明顯優(yōu)于水提物；對(duì)比2、3、4、12 和13 號(hào)根皮苷的含量可以看出，不管是甲醇提取液還是水提液，乙酸乙酯萃取物根皮苷的含量都較高，經(jīng)乙酸乙酯萃取后再用正丁醇萃取，所得萃取物中根皮苷的含量大體相同，大約都在11%左右，說(shuō)明乙酸乙酯萃取可以獲得大部分的根皮苷，同時(shí)還說(shuō)明對(duì)于乙酸乙酯-水體系和正丁醇-水體系，根皮苷在乙酸乙酯中的分配比高于正丁醇；但對(duì)比5、6 和7 號(hào)的結(jié)果可以看出，使用乙酸乙酯和正丁醇混合溶劑萃取并不是乙酸乙酯比例越大根皮苷含量越高，而是在乙酸乙酯-正丁醇體積比為2/1 時(shí)根皮苷的含量最高，達(dá)到59.7%。

表1 不同溶劑萃取物根皮苷的含量測(cè)定結(jié)果

2.2 不同提取物的抗氧化活性

以VC 作為對(duì)照，將紅富士蘋(píng)果樹(shù)皮的水提物（W）、水提液乙酸乙酯萃取物（WE）、水提液乙酸乙酯萃取后丁醇萃取物（WE-D）、水提液丁醇萃取物（WD）、甲醇提取物（M）、甲醇提取液正己烷萃取物（MH）、正己烷萃取后乙酸乙酯萃取物（ME）、乙酸乙酯萃取后正丁醇萃取物（MD）和根皮苷（P）共9 個(gè)樣品進(jìn)行DPPH 抗氧化活性測(cè)定，利用Excel 的FORECAST 命令，通過(guò)線(xiàn)性回歸方程，計(jì)算IC50值，結(jié)果如表2 所示。

表2 不同溶劑萃取物以及對(duì)照品對(duì)DPPH 自由基的清除率

由表2 的結(jié)果可知，紅富士蘋(píng)果樹(shù)皮的各種溶劑提取物均顯示一定的抗氧化活性，相對(duì)而言，水提液乙酸乙酯萃取后丁醇萃取物（WE-D）、甲醇提取物（M）、甲醇提取物正己烷萃取后乙酸乙酯萃取物（ME）、甲醇提取物乙酸乙酯萃取后正丁醇萃取物（MD）等幾種提取物抗氧化活性稍強(qiáng)些，其中甲醇提取物乙酸乙酯萃取后正丁醇萃取物（MD）最強(qiáng)，IC50值為160 μg/mL。此外，由于根皮苷的抗氧化活性不如多數(shù)提取物強(qiáng)，說(shuō)明其中可能還含有抗氧化活性更強(qiáng)物質(zhì)，其成分有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

紅富士蘋(píng)果樹(shù)皮中含有大量的根皮苷，從中提取富集根皮苷的較佳工藝條件為：80 ℃熱水浸泡提取，提取液冷卻至室溫后用乙酸乙酯-正丁醇=2/1 的混合溶劑萃取，萃取液蒸出溶劑得提取物，其中根皮苷含量可達(dá)59.7%。紅富士蘋(píng)果樹(shù)皮各種溶劑提取物顯示一定的抗氧化活性，其中將干燥的紅富士蘋(píng)果樹(shù)皮用甲醇室溫浸泡提取，提取液濃縮至小體積加水分散后，用正丁醇萃取制得萃取物的抗氧化活性相對(duì)較好，IC50值為160 μg/mL。