楸樹種子發(fā)育過程中內(nèi)源激素含量的動(dòng)態(tài)變化

韓東花，楊桂娟，肖 遙，麻文俊，趙 鯤，王軍輝，易 飛,3＊

(1. 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2. 北京師范大學(xué)珠海校區(qū)后勤處，廣東 珠海 519087；3. 三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002；4. 洛陽農(nóng)林科學(xué)院，河南 洛陽 471023)

楸樹（Catalpa bungei）為紫葳科（Bignoniaceae）梓屬（Catalpa）的落葉喬木[1]，是我國特有的珍貴優(yōu)質(zhì)用材樹種和園林觀賞樹種，其材性優(yōu)良，干形端直，樹姿優(yōu)美，用途十分廣泛。楸樹根系發(fā)達(dá)，耐旱耐寒，具有防風(fēng)固沙的良好生態(tài)價(jià)值[2]，其體內(nèi)的活性成分具有多種藥理作用[3-4]。自然狀態(tài)下，楸樹自花授粉不育，僅能通過昆蟲的活動(dòng)進(jìn)行少量授粉，結(jié)實(shí)量很低，出種率僅10%左右[2]；生產(chǎn)上，目前主要通過嫁接、組織培養(yǎng)等方法進(jìn)行繁殖。近年來，對(duì)楸樹的種質(zhì)資源調(diào)查、良種選育、繁殖和栽培技術(shù)、抗性機(jī)理等方面開展了較多工作[2,4]，而對(duì)楸樹生殖生物學(xué)的研究，特別是對(duì)種子和胚胎發(fā)育過程中生理特性和規(guī)律的研究少有報(bào)道[5]。

植物激素在植物胚胎發(fā)育、種子萌發(fā)、果實(shí)成熟、營養(yǎng)生長等生長發(fā)育的各階段均發(fā)揮重要作用，尤其是胚胎的正常發(fā)育需要多種激素的動(dòng)態(tài)平衡及某一時(shí)期某一激素的主導(dǎo)作用[6-8]。楸樹的自花授粉不育可能與傳粉受精和胚胎發(fā)育有關(guān)[5]，因此，開展楸樹胚胎發(fā)育過程及內(nèi)源激素的研究可為探明自花授粉不育的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)是植物快速繁殖的重要手段和遺傳轉(zhuǎn)化的有效體系，體胚發(fā)生與合子胚發(fā)育過程具有類似的機(jī)制[9]，研究合子胚發(fā)育過程中的內(nèi)源激素含量變化可為體胚誘導(dǎo)提供參考。本研究通過對(duì)楸樹胚胎發(fā)育過程中生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素和脫落酸等激素含量變化的分析，揭示內(nèi)源激素在楸樹合子胚發(fā)育過程的調(diào)控作用，可作為楸樹體胚誘導(dǎo)中外源激素添加的依據(jù)，為解決楸樹體胚誘導(dǎo)率低這一技術(shù)瓶頸提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

楸樹蒴果采自河南省洛陽市白馬寺鎮(zhèn)試驗(yàn)地（34°42′55″ N, 112°32′36″ E）內(nèi)的2 個(gè)無性系良種洛楸1 號(hào)（LQ1）和洛楸3 號(hào)（LQ3）。2018 年4 月楸樹盛花期授粉后，分別于授粉后45 d（6 月1 日）、授粉后70 d（6 月26 日）、授粉后90 d（7 月16 日）采集樣品。2 個(gè)無性系各選取9 個(gè)固定單株，每次采集時(shí)選取樹冠中部南向的果實(shí)，每株采集10 個(gè)蒴果，即2 個(gè)無性系各采集90 個(gè)蒴果。從采自各單株的蒴果中各隨機(jī)選取1 個(gè)，去除果皮，選擇中間部位健康發(fā)育的種子，混合后分成3 份，用錫紙包裹置于液氮中，其余蒴果混合后用保鮮膜包裹置于冰盒中，樣品在24 h 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。液氮中的種子保存在?80℃的超低溫冰箱中用于內(nèi)源激素含量檢測。將冰盒中的蒴果剝?nèi)》N子，用于種子形態(tài)和胚胎發(fā)育時(shí)期鑒定。

1.2 激素檢測方法

取超低溫保存的種子約0.5 g，用研磨儀（MM400，Retsch）研磨（30 Hz，1 min）至粉末狀，稱取120 mg 粉末溶解于1.2 mL 80%甲醇-水提取液中，每30 min 渦旋1 次，共渦旋6 次，4℃冰箱中保存過夜。提取液于4℃，12000 g 離心15 min，吸取上清，35℃加熱模式下液氮吹干。100 μL 30%甲醇-水復(fù)溶樣品，渦旋使目標(biāo)物質(zhì)充分溶解，12000 g 離心15 min，吸取上清，并保存于進(jìn)樣瓶中。植物內(nèi)源激素的檢測采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)，分別檢測吲哚乙酸(IAA)、異戊烯腺嘌呤核苷(iPA)、赤霉素(GAs；C19-GAs:GA1、GA3、GA7)及脫落酸(ABA)的含量，激素含量使用鮮質(zhì)量表示，單位為ng·g?1。每個(gè)發(fā)育時(shí)間的樣品各3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品3 次技術(shù)重復(fù)。

1.3 胚胎發(fā)育時(shí)期鑒定、胚胎數(shù)量和種子性狀的測定

冰盒中對(duì)授粉45、70、90 d 的樣品分別隨機(jī)選擇3 個(gè)蒴果去除果皮，剝?nèi)≈虚g部位健康發(fā)育的種子，混合后隨機(jī)選擇60 粒種子，去除種皮，采用超景深顯微鏡（Leica DVM6）進(jìn)行種子形態(tài)和胚胎發(fā)育時(shí)期鑒定，統(tǒng)計(jì)各時(shí)期胚胎的數(shù)量。并隨機(jī)選擇授粉后70、90 d 種子各50 粒，用超景深顯微鏡拍照后測量種子的長度和寬度，計(jì)算長寬比。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003、SPSS17.0進(jìn)行分析處理，使用Duncan 新復(fù)極差法檢驗(yàn)顯著性。使用GraphPad Prism 做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 楸樹胚胎發(fā)育過程及其在無性系間的差異

植物胚胎發(fā)育始于合子胚分裂，經(jīng)過原胚發(fā)育和胚的分化，最終形成成熟胚胎。合子胚第一次的不對(duì)等分裂形成的二細(xì)胞原胚直至球形胚期間的胚胎發(fā)育狀態(tài)為原胚時(shí)期。雙子葉原胚發(fā)育歷經(jīng)球形胚、心形胚、魚雷胚時(shí)期，最終發(fā)育為子葉胚。

楸樹胚胎發(fā)育過程的觀察結(jié)果表明：合子胚首先進(jìn)入球形胚時(shí)期（圖1A），胚胎被大量透明狀胚乳包裹。由于球形胚兩側(cè)的細(xì)胞單位時(shí)間內(nèi)較上下的兩部分細(xì)胞分裂次數(shù)多，因而產(chǎn)生2 個(gè)子葉原基，胚胎進(jìn)入心形胚階段（圖1B）。心形胚的2 個(gè)側(cè)生突起發(fā)育成為2 片側(cè)生的子葉，子葉下方的細(xì)胞發(fā)育成為胚軸，子葉和胚軸進(jìn)行伸長生長，形成魚雷胚（圖1C）。從球形胚到魚雷胚，胚胎呈現(xiàn)乳白色，大小變化不明顯，透明狀的胚乳一直存在。胚胎體積迅速增大，進(jìn)入子葉胚時(shí)期，此時(shí)可見2 片明顯的子葉，約呈90°角，胚胎透明度有所下降（圖1D）。授粉70 d 后，胚胎體積進(jìn)一步增加，子葉變得狹長并位于同一直線上，整個(gè)胚胎呈現(xiàn)長條狀；此時(shí)胚乳已經(jīng)完全消失，胚胎白色不透明，僅在子葉連接處為淺黃色（圖1E）。再經(jīng)過20 d 左右的發(fā)育，胚胎成熟，為淺黃色，子葉邊緣及連接處顏色較深，呈黃褐色，但胚胎的體積較早期子葉胚時(shí)有所下降（圖1F）。

圖1 不同發(fā)育時(shí)期的楸樹胚胎形態(tài)Fig.1 Embryo morphology of C.bungei at different developmental stages

表1 授粉后45、70、90 d 各種胚形態(tài)所占比例Table 1 Statistics on the proportion of various embryo forms at 45,70 and 90 DAP

2 個(gè)無性系的胚胎發(fā)育速度在授粉后45 d 存在較大差異（表1），60 粒洛楸1 號(hào)種子中，處于心形胚時(shí)期的有43 個(gè)，占71.67%，處于魚雷胚時(shí)期的僅有2 個(gè)；洛楸3 號(hào)的胚胎發(fā)育速度更快，60 粒種子中處于子葉胚時(shí)期的已有20 個(gè)，占33.33%，處于心形胚和魚雷胚時(shí)期的分別占20.00%和31.67%。這種差異表明，洛楸1 號(hào)胚胎發(fā)育的同步性高，而洛楸3 號(hào)胚胎發(fā)育不同步，同時(shí)存在各時(shí)期的胚胎，且各時(shí)期的比例差別也不明顯。在授粉70 d 后，2 個(gè)無性系的胚胎都全部到達(dá)子葉胚時(shí)期，均無其它發(fā)育時(shí)間的胚胎。授粉90 d 后，洛楸1 號(hào)種子的長度和寬度都比授粉70 d的顯著增加，且長寬比下降（圖2），表明授粉70 d時(shí)胚胎未達(dá)到成熟狀態(tài)，細(xì)胞仍在不斷分裂。授粉90 d 的洛楸3 號(hào)種子與授粉70 d 時(shí)相比，長度、寬度略有下降，長寬比則無顯著差異（圖2），表明洛楸3 號(hào)的胚胎在授粉70 d 后，細(xì)胞分裂基本完成，進(jìn)入胚胎的成熟階段，水分逐漸減少，干物質(zhì)不斷積累，因此體積稍有減小。

2.2 不同發(fā)育時(shí)間楸樹種子內(nèi)源激素含量的變化

本研究中，檢測出IAA、iPA、GA1、GA7、ABA，而沒檢測出GA3，不同發(fā)育時(shí)期各類內(nèi)源激素含量變化情況不同。

圖2 授粉后70 d 與授粉后90 d 楸樹種子長度、寬度和長寬比的變化Fig.2 Changes in length,width and aspect ratio of C.bungei seeds at 70 and 90 DAP

2.2.1 IAA 含量 2 個(gè)無性系的不同發(fā)育時(shí)間種子內(nèi)源IAA 含量變化趨勢不同（圖3）。洛楸1 號(hào)IAA 含量呈先下降后上升的變化趨勢，在授粉后90 d，含量到達(dá)最高，為0.70 ng·g?1。方差分析表明：3 個(gè)時(shí)期的含量均差異顯著。洛楸3 號(hào)IAA 含量則在授粉45 d 時(shí)最高（1.37 ng·g?1），隨后迅速下降，到授粉70 d 時(shí)，僅為0.27 ng·g?1，此后變化較?。ㄊ诜酆?0 d 為0.32 ng·g?1）。在種子發(fā)育過程中，洛楸3 號(hào)IAA 的含量只在授粉90 d 時(shí)低于洛楸1 號(hào)，而在授粉45、70 d 時(shí)，其IAA 的含量分別是洛楸1 號(hào)的3.76 倍和2.37 倍。結(jié)果表明：洛楸3 號(hào)在發(fā)育早期高水平的IAA 促進(jìn)了胚胎細(xì)胞迅速伸長，發(fā)育速度快，授粉后45 d 即有約1/3 的胚胎進(jìn)入子葉胚時(shí)期。洛楸1 號(hào)IAA 的含量在發(fā)育過程中維持較低水平，導(dǎo)致其發(fā)育速度明顯落后于洛楸3 號(hào)。但在發(fā)育后期洛楸1 號(hào)的IAA含量達(dá)到峰值，且高于洛楸3 號(hào)，說明在此階段其胚胎細(xì)胞仍在繼續(xù)伸長，種子體積也有明顯增大。

圖3 不同發(fā)育時(shí)間楸樹種子內(nèi)源IAA 含量的變化Fig.3 The changes of endogenous IAA content of C.bungei seeds at different developmental periods

2.2.2 iPA 含量 圖4 表明：iPA 含量在2 個(gè)無性系中均極低。授粉70 d 的洛楸1 號(hào)種子iPA 含量達(dá)到最大值，為0.023 ng·g?1，授粉45、90 d 的種子iPA 含量分別為0.018 9、0.019 2 ng·g?1；而洛楸3 號(hào)種子iPA 含量在3 個(gè)發(fā)育時(shí)期均低于0.02 ng·g?1。方差分析表明：2 個(gè)無性系的iPA 含量在3 個(gè)發(fā)育時(shí)期中均差異不顯著。

圖4 不同發(fā)育時(shí)間楸樹種子內(nèi)源iPA 含量的變化Fig.4 The changes of endogenous iPA content of C.bungei seeds at different developmental periods

2.2.3 GAs 含量 2 個(gè)無性系中的GAs 含量變化趨勢一致，均隨著發(fā)育進(jìn)程下降（圖5）。洛楸1 號(hào)種子的GA1 含量在授粉后45 d 最高，為29.81 ng·g?1，此后就迅速下降；授粉后70 d，含量為3.74 ng·g?1；至授粉90 d 時(shí)，其含量僅為1.06 ng·g?1。洛楸3 號(hào)種子GA1 含量同樣在授粉45 d 時(shí)達(dá)到最大值（9.31 ng·g?1），而授粉后70、90 d 的含量分別為0.76 、0.56 ng·g?1。洛楸1 號(hào)GA1 的含量在各個(gè)發(fā)育時(shí)間都明顯高于洛楸3 號(hào)，分別是洛楸3 號(hào)含量的3.20、4.92、1.89倍。2 個(gè)無性系中GA7 含量的變化與GA1 相同，都在授粉后45 d 的含量最高，并與后2 個(gè)時(shí)期的含量差異顯著，且同樣是洛楸1 號(hào)GA7 含量高于洛楸3 號(hào)的含量，差異倍數(shù)的最大值也出現(xiàn)在授粉70 d 時(shí)（差異倍數(shù)分別為3.95、4.69、2.67 倍）。GAs 含量（GA1 + GA7）呈現(xiàn)與2 種赤霉素相同的變化趨勢，授粉后45 d 的含量顯著高于后2 個(gè)時(shí)期，而授粉70 d與90 d 的含量差異不顯著。GA7的含量在整個(gè)發(fā)育過程中都遠(yuǎn)低于GA1 的含量，2 個(gè)無性系中GA7 含量在3 個(gè)發(fā)育時(shí)間均不超過GAs 的20%。

圖5 不同發(fā)育時(shí)間楸樹種子內(nèi)源GAs 含量的變化Fig.5 The changes of endogenous GAs content of C.bungei seeds at different developmental periods

2.2.4 ABA 含量 2 個(gè)無性系種子的內(nèi)源ABA 含量在發(fā)育全程中明顯高于IAA、iPA 和GAs（GA1 +GA7）的含量，且在2 個(gè)無性系中變化趨勢基本一致（圖6）。洛楸1 號(hào)授粉后45 d，ABA 含量高達(dá)349.78 ng·g?1，隨后逐漸下降，到授粉后90 d 含量最低，但仍達(dá)到96.90 ng·g?1。洛楸3 號(hào)的ABA含量同樣在授粉后45 d 最高（189.51 ng·g?1），授粉后90 d 最低（43.33 ng·g?1）。方差分析表明：洛楸1 號(hào)3 個(gè)發(fā)育時(shí)間的ABA 含量均差異顯著；洛楸3 號(hào)授粉后45 d 的ABA 含量顯著高于授粉后90 d 的含量，但授粉后70 d 的ABA 含量與另2 個(gè)時(shí)期均差異不顯著。與GAs 含量類似，洛楸3 號(hào)的ABA 含量在發(fā)育全程中均低于洛楸1 號(hào)，差異倍數(shù)在授粉70 d 時(shí)最低（1.76 倍）。

圖6 不同發(fā)育時(shí)間楸樹種子內(nèi)源ABA 含量的變化Fig.6 The changes of endogenous ABA content of C.bungei seeds at different developmental periods

圖7 不同發(fā)育時(shí)間楸樹種子內(nèi)源激素間比例的變化Fig.7 The changes of endogenous hormones ratio of C.bungei seeds at different developmental periods

2.2.5 種子發(fā)育過程中內(nèi)源激素含量比值 種子的發(fā)育是多種植物激素共同作用的結(jié)果，激素之間既相互制約又相互促進(jìn)。由圖7 可知：洛楸1 號(hào)IAA/ABA 和iPA/ABA 的比值呈上升趨勢，授粉后90 d 的比值顯著高于前2 個(gè)時(shí)期的比值，但授粉后45 d 和70 d 的比值差異并不顯著；GAs/ABA和（IAA + iPA + GAs）/ABA 的比值變化趨勢相同，最高值均出現(xiàn)在授粉后45 d，與后2 個(gè)時(shí)期的比值差異顯著，而授粉后70 d 和90 d的比值差異不顯著。洛楸3 號(hào)IAA/ABA 的比值先下降后上升，授粉后70 d 的比值最?。?.002），顯著低于授粉后45 d 的比值（0.007），但該比值在授粉后70 d 與90 d、45 d 與90 d 之間的差異均不顯著；洛楸3 號(hào)的iPA/ABA、GAs/ABA 和（IAA + iPA +GAs）/ABA 比值變化趨勢與洛楸1 號(hào)相同。2 個(gè)無性系中IAA 和iPA 的含量均明顯低于GAs 含量，GAs 占促進(jìn)生長類激素（生長素、細(xì)胞分裂素和赤霉素）的主體，因此，導(dǎo)致（IAA + iPA +GAs）/ABA 的比值由GAs/ABA 的比值決定，并呈現(xiàn)相同的變化趨勢。

3 討論

本研究通過對(duì)不同發(fā)育時(shí)間的楸樹種子解剖觀察，結(jié)果表明，楸樹胚胎發(fā)育過程遵循雙子葉植物的胚胎發(fā)育過程，即原胚發(fā)育歷經(jīng)球形胚、心形胚、魚雷胚，最終發(fā)育為子葉胚。2 個(gè)無性系的胚胎發(fā)育速度有差異，洛楸3 號(hào)的發(fā)育速度明顯快于洛楸1 號(hào)，但洛楸1 號(hào)胚胎發(fā)育的同步性更高。

生長素通常在胚胎發(fā)育早期作用顯著[10]，在種子生長發(fā)育過程中，IAA 通過促進(jìn)細(xì)胞伸長、加快細(xì)胞代謝和縮短細(xì)胞分裂周期，實(shí)現(xiàn)種子的快速膨大[9,11-12]。在本研究中，2 個(gè)楸樹無性系授粉后45 d 的種子都具有較高水平的IAA，其中，洛楸3 號(hào)IAA 含量達(dá)到峰值。由于在發(fā)育早期洛楸3 號(hào)的IAA 含量明顯高于洛楸1 號(hào)，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)更快，洛楸3 號(hào)胚胎發(fā)育速度更快，授粉后45 d 即有33.09%的胚胎進(jìn)入到子葉胚期，而此時(shí)洛楸1 號(hào)的胚胎多處于心形胚時(shí)期。細(xì)胞分裂素主要參與胚胎發(fā)育前期的器官形成，并促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大，誘導(dǎo)營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸，增加種子重量[13-14]。根據(jù)前人研究，細(xì)胞分裂素在胚胎發(fā)育前期含量高，在隨后的發(fā)育過程中持續(xù)降低，接近種子脫水干燥期細(xì)胞分裂素作用最小[10,15-16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，2 個(gè)無性系中的iPA 含量在胚胎發(fā)育過程中一直維持低水平，且無顯著變化。推測可能的原因是，楸樹授粉后細(xì)胞分裂素迅速合成，含量很快達(dá)到頂峰，在此期間細(xì)胞快速分裂及伸長，胚胎及貯藏器官迅速分化發(fā)育，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)向種子流動(dòng)。由于筆者在授粉后45 d 才首次檢測內(nèi)源激素，此時(shí)iPA 含量已經(jīng)很低，在儀器檢出限（0.02 ng·g?1）附近或以下，故在不同發(fā)育時(shí)間及2 個(gè)無性系間差異不顯著。赤霉素通過增加細(xì)胞壁延展性來促進(jìn)細(xì)胞伸長生長，研究表明，在胚胎的細(xì)胞極性生長期，尤其是魚雷胚期以及早期子葉胚期，赤霉素對(duì)胚軸細(xì)胞的伸長調(diào)控作用非常明顯[17]。2 個(gè)楸樹無性系的GAs 含量與IAA 含量呈正相關(guān)，在授粉后45 d 達(dá)到最大值，此后迅速下降，與紅松、玉米等種子內(nèi)部赤霉素含量變化一致[10,18]。洛楸1 號(hào)GAs含量一直高于洛楸3 號(hào)，與胚胎發(fā)育速度的差異不一致，這是因?yàn)槌嗝顾卮龠M(jìn)種子發(fā)育的作用主要是通過促進(jìn)生長素的合成而間接實(shí)現(xiàn)的[13,19]，較高的IAA 含量是導(dǎo)致洛楸3 號(hào)胚胎早期發(fā)育更快的直接原因。

從授粉45 d 之后，2 個(gè)無性系的IAA 含量均開始下降，到子葉胚期含量最低（授粉70 d）；胚胎發(fā)育后期IAA 含量又有所上升，這與扇脈杓蘭（Cypripedium japonicumThunb.）[20]、華中五味子（Schisandra sphenantheraRehder & E. H. Wilson.）[21]、月季（Rosa hybridaE. H. L. Krause.）[22]、結(jié)縷草（Zoysia japonicaSteud.）[23]和沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）[24]的研究結(jié)果一致。發(fā)育后期洛楸1 號(hào)的IAA 含量顯著上升，通過調(diào)節(jié)核酸和蛋白質(zhì)的合成促進(jìn)生長，吸引同化物從葉片向種子運(yùn)輸[25]，使得種子的長度、寬度和體積都有顯著增加。胚胎發(fā)育后期，洛楸1 號(hào)和洛楸3 號(hào)的GAs含量顯著下降，抑制水解酶合成，有利于淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)合成[26]。

植物種子發(fā)育分為2 個(gè)長度大致相同的階段，第一階段是以細(xì)胞分裂增殖為特征，第二階段以儲(chǔ)藏物積累為特征，細(xì)胞停止分裂，淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)大量積累，種子脫水，此時(shí)胚胎的耐干燥性也逐漸增強(qiáng)。ABA 對(duì)種子的發(fā)育和成熟具有重要的生理作用，可促進(jìn)耐干燥性的形成、促進(jìn)休眠、抑制胎萌、控制脂質(zhì)及蛋白質(zhì)合成等[9,27-28]。在種子發(fā)育過程中，ABA 濃度變化遵循較為一致的變化趨勢，即在形成初期ABA 僅以極低含量存在；在種子發(fā)育至1/3～1/2 的階段時(shí)含量達(dá)到高峰；在成熟的過程中不斷下降[11,22,29]。白云杉（Picea glaucaVoss.）種子成熟晚期ABA 含量達(dá)到頂峰，而火炬松（Pinus taedaL.）種子成熟晚期ABA 含量下降，說明針葉樹中ABA 積累可能依賴于物種[22]。本研究中，從授粉45 d 開始ABA含量逐漸下降，說明楸樹胚胎開始進(jìn)入成熟期；授粉后70～90 d，ABA 含量雖下降，但水平仍然維持在一個(gè)較高水平，表明ABA 是控制楸樹胚胎儲(chǔ)藏物質(zhì)積累的重要因素。

種子的正常發(fā)育受內(nèi)源激素的絕對(duì)含量和激素動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)控，而激素之間的平衡關(guān)系比單一激素的作用更重要[7,20]，尤其是受到促進(jìn)生長類激素與抑制生長類激素之間比例的影響[30]。在2 個(gè)楸樹無性系種子發(fā)育過程中，4 種植物激素含量存在明顯的差異，IAA 和iPA 含量相對(duì)較低，GAs 和ABA 則相對(duì)較高，作為抑制生長類激素的ABA 在授粉45 d 后的發(fā)育過程中，含量一直明顯高于促進(jìn)生長類激素（IAA、iPA）；2 個(gè)楸樹無性系的種子均能正常發(fā)育，這表明激素間的比例關(guān)系才是更重要的影響因素。由于GAs 含量占促進(jìn)生長類激素的主體，故（IAA + iPA + GAs）/ABA 的比值由GAs/ABA 的比值決定，二者均呈下降趨勢。（IAA + iPA + GAs）/ABA 在授粉后45 d 達(dá)到最大值，表明早期的球形胚、心形胚和魚雷胚發(fā)育需要較高的促進(jìn)生長類激素；至授粉后70 d，所有胚胎均達(dá)到子葉胚時(shí)期，（IAA + iPA + GAs）/ABA顯著下降，此時(shí)抑制類激素的比例上升，促進(jìn)胚胎與種子的成熟，在華北駝絨藜[6]和扇脈杓蘭[20]等研究中也有類似結(jié)果。洛楸3 號(hào)的IAA/ABA 比值在授粉后45 d 即達(dá)到最大值，并明顯高于洛楸1 號(hào)，發(fā)育早期相對(duì)高比例的生長素促進(jìn)洛楸3 號(hào)胚胎發(fā)育速度更快，與解剖結(jié)果相符；洛楸1 號(hào)的IAA/ABA 比值在授粉后90 d 顯著上升，生長素促進(jìn)了細(xì)胞的伸長生長，使種子的長度和寬度顯著增加。雖然2 個(gè)楸樹無性系的（IAA + iPA +GAs）/ABA 變化趨勢相同，但I(xiàn)AA/ABA 的差異卻導(dǎo)致了它們胚胎發(fā)育速度的明顯差異，這表明生長素在楸樹胚胎和種子發(fā)育過程中具有顯著作用，即使它的含量和變化幅度并不是各種內(nèi)源激素中最大的。

生長素是誘導(dǎo)體胚發(fā)生的關(guān)鍵因素[31-32]，其含量在合子胚和體胚中變化較一致[33]。前期研究利用授粉后60 d 的楸樹（無性系9-14）合子胚成功誘導(dǎo)出胚性愈傷組織[34]，此時(shí)內(nèi)源IAA 的含量已經(jīng)顯著下降，故胚性愈傷組織的誘導(dǎo)需要添加較高濃度外源生長素（1.0 mg·L?12,4-D）[34]。不同楸樹無性系種子的內(nèi)源IAA 含量存在較大差異，這影響了外源生長素的添加量，應(yīng)測定內(nèi)源IAA 含量以提供參考，基本原則是內(nèi)源生長素含量相對(duì)高，則外源生長素添加量相應(yīng)降低。需要注意的是，2,4-D 會(huì)對(duì)胚性愈傷組織的增殖及體胚分化產(chǎn)生不利影響，因此，需要及時(shí)降低濃度或更換為脫分化能力稍弱的生長素類。授粉后60 d 的楸樹合子胚是比較合適的誘導(dǎo)胚性愈傷組織的材料，此時(shí)內(nèi)源細(xì)胞分裂素已經(jīng)極低，此后也無明顯變化，因此外源細(xì)胞分裂素可能對(duì)誘導(dǎo)胚性愈傷組織的作用不明顯。脫落酸對(duì)胚胎形態(tài)建成及成熟具有重要作用，同樣也用于促進(jìn)體胚的成熟[11,35]；但在前期研究中，增殖后的楸樹愈傷組織在未添加外源ABA 的1/2MS 培養(yǎng)基上成功分化出體胚并萌發(fā)成苗，這表明ABA 的作用因物種不同而異，ABA 不是楸樹體胚成熟的必需條件。

此外，赤霉素主要分為C20-GAs 和C19-GAs兩大類，有活性的赤霉素均屬于C19-GAs，主要是GA1、GA3、GA7 等[36]。在本研究中均未檢測出GA3，這是否是因?yàn)镚A3 在楸樹胚胎發(fā)育過程中的含量極低或是合成受阻，需要通過進(jìn)一步研究才能明確。

4 結(jié)論

在楸樹種子發(fā)育過程中，內(nèi)源激素的含量隨著胚胎發(fā)育進(jìn)程而發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。抑制生長類激素ABA 的含量一直高于促進(jìn)生長類激素的含量；除IAA 外，其余激素含量及激素間比例的變化趨勢在2 個(gè)無性系間一致。IAA 在楸樹胚胎發(fā)育過程中起重要的調(diào)控作用，是導(dǎo)致2 個(gè)無性系發(fā)育速度差異的主要原因。需要指出的是，本研究開始取樣的時(shí)間較晚，這可能是導(dǎo)致未檢測到細(xì)胞分裂素含量峰值的原因。本研究中均未檢測出GA3，對(duì)此有待進(jìn)一步研究。