珍稀瀕危植物金絲李種子休眠解除的轉(zhuǎn)錄組分析

張俊杰，張靈藝，夏 科，蔣 冕，韋 霄＊

(1.重慶交通大學(xué)建筑與城市規(guī)劃學(xué)院，重慶 400074；2.廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

種子由休眠階段轉(zhuǎn)換到萌發(fā)階段，涉及非常復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程[1]。兩階段相比對(duì)，常存在較多的差異表達(dá)基因（DEGs）[2]。與種子休眠相關(guān)的基因功能研究主要集中在擬南芥（Arabidopsis thaliana(L.) Heynh）[3]、煙草（Nicotiana tabacumL.）[4]及水稻（Oryza sativaL.）[5]等模式植物中。近年來(lái)，有關(guān)重樓（Paris polyphyllaSmith）等中草藥[6-7]、杉木（Cunninghamia lanceolata(Lamb.) Hook.）和湖北梣（Fraxinus hupehensisChu）等林木[8-9]以及桃（Amygdalus persicaL.Spp.）[10-11]和芍藥（Paeonia lactifloraPall.）[12]等觀賞植物的種子休眠相關(guān)的基因功能研究也陸續(xù)被報(bào)道。

種子休眠解除涉及復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。華重樓（P.polyphyllaSm.var chinensis (Franch.) Hara）種子在發(fā)育與休眠解除過(guò)程中，差異表達(dá)基因主要富集在次生代謝產(chǎn)物合成、碳代謝、磷酸戊糖途徑、多糖分解、蛋白質(zhì)合成以及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路[7]。人參（Panax ginsengC.A.Mey.）后熟發(fā)育時(shí)期的DEGs 主要富集到代謝過(guò)程、次生代謝合成和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路[13]。具有形態(tài)生理休眠的遼東楤木（Aralia elataL.）種子在破眠起始階段的呼吸代謝途徑主要以糖酵解和三羧酸循環(huán)為主[14]；而油菜（Brassica napusL.）種子休眠性則與脂肪酸代謝密切相關(guān)[15]。

內(nèi)源激素在調(diào)控植物種子休眠與萌發(fā)過(guò)程中有十分重要的作用。近年來(lái)，在種子休眠與萌發(fā)過(guò)程中有關(guān)激素的合成與分解、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究取得了較大進(jìn)展，其中，脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）、生長(zhǎng)素（auxin）和乙烯（ETH）等是研究最多的內(nèi)源激素。三七（Panax notoginsengWall.）種子中共篩選出78 個(gè)與其休眠釋放有關(guān)的DEGs，其中，15 個(gè)與ABA和GA 相關(guān)（如ABI5、GAI、KS、GA2ox等）[16]。擬南芥種子中的AtCYP707A2基因參與ABA 水平的調(diào)節(jié)，其休眠釋放也與該基因的表達(dá)有關(guān)[17]。催化GA 生物合成的基因GA20ox1、GA 活性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶基因GA3ox2與GA 分解代謝的關(guān)鍵基因GA2ox1[18]在西洋參（Panax quinquefoliusL.）種子休眠解除過(guò)程中表達(dá)量顯著變化[19]。擬南芥的GA 受體GID1基因突變后，突變體種子中α-淀粉酶的活性被抑制，從而導(dǎo)致種子不能萌發(fā)[20]?；ㄉˋrachis hypogaeaL.）種子休眠解除過(guò)程中除了與GA 和ABA 相關(guān)的unigenes 顯著差異表達(dá)以外，與auxin 和ETH相關(guān)的DEGs 也較多[21]。ACO1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控乙烯生成，在打破山毛櫸屬（FagusL.）植物種子休眠過(guò)程中起主要作用[22]。

金絲李（Garcinia paucinervisChun et How）為藤黃科（Clusiaceae）藤黃屬（GarciniaL.）喬木，主要分布于廣西西部和云南東南部喀斯特山地，集經(jīng)濟(jì)、生態(tài)、觀賞和藥用價(jià)值于一身。因其木材名貴，金絲李曾遭受過(guò)度采伐，成為了珍稀瀕危樹(shù)種。前期研究表明，金絲李種子萌發(fā)緩慢且不整齊，被歸為具有生理休眠的低度頑拗性種子[23-24]，其休眠主要是由于胚和胚乳中存在內(nèi)源抑制物的同時(shí)缺乏萌發(fā)促進(jìn)物質(zhì)。以外源6-BA 或GA3處理，亦或32℃條件下均可加快金絲李種子萌發(fā)的進(jìn)程，在一定程度上可打破種子休眠。但處理后的種子平均萌發(fā)時(shí)間均大于100 d，萌發(fā)仍較為緩慢[25-26]，這并不利于金絲李的育苗栽培和資源的保護(hù)利用。目前，有關(guān)金絲李的分子生物學(xué)研究有限，僅有關(guān)于其不同種群遺傳多樣性的報(bào)道[27]，而藤黃屬植物種子休眠機(jī)理的分子方面研究幾乎空白。為了獲得更有效地打破金絲李種子休眠的方法，需探索其休眠的分子機(jī)理，分析其休眠解除與種子萌發(fā)過(guò)程中參與調(diào)控的基因及其調(diào)控方式。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）屬于功能基因組學(xué)的研究范疇，可從整體水平上研究基因功能和基因結(jié)構(gòu)，揭示不同轉(zhuǎn)錄組樣本中基因表達(dá)水平的變化，挖掘特定生物學(xué)過(guò)程中的分子機(jī)理[28]。種子能否解除休眠取決于種子休眠程度與胚胎克服休眠能力之間的相互博弈。然而，科學(xué)界對(duì)種子休眠解除和萌發(fā)啟始階段的界定十分困難[29]。金絲李種子萌發(fā)緩慢且不規(guī)律，很難把握其從休眠狀態(tài)轉(zhuǎn)為休眠解除狀態(tài)的關(guān)鍵時(shí)間，故本研究預(yù)設(shè)以種子萌發(fā)為其休眠解除的判斷標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)將新鮮成熟的金絲李種子、播種后同一時(shí)間未萌發(fā)和已萌發(fā)種子的種胚和胚乳進(jìn)行無(wú)參考基因組轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，找出種子從休眠向萌發(fā)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的差異表達(dá)基因，挖掘調(diào)控其休眠解除的候選基因，以期為后續(xù)開(kāi)展金絲李種子的休眠功能基因研究及分子育種實(shí)踐提供有益參考，為藤黃屬植物種子，甚至具有休眠屬性的頑拗性種子的基因組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，也為探討其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供有價(jià)值的信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

成熟金絲李種子于2017 年7 月采集自廣西龍州縣弄崗國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)0.1%的K2MnO4溶液消毒并洗凈后，選取飽滿且無(wú)病蟲(chóng)害的種子（經(jīng)TTC 法測(cè)試其生活力達(dá)98.00%），一部分種子去除種皮后用滅菌刀片切取中部（包含胚和胚乳）約3 mm 部分，迅速用錫箔紙包裹放入液氮速凍，存于?80℃冰箱作為原種子，記為OS（original seeds）；另一部分種子參照張俊杰等[25]的播種條件，以河沙為基質(zhì)播種于25℃的培養(yǎng)箱中，經(jīng)過(guò)60 d 取出種子（萌發(fā)率為（28.33 ± 2.36）%），未萌發(fā)的種子記為UG（ungerminated seeds）；已萌發(fā)的種子記為GS（germinated seeds），去除種皮后取種子中部（包含胚和胚乳）約3 mm 部分（圖1），迅速用錫箔紙包裹放入液氮速凍，于?80℃冰箱保存（種皮不是其休眠的主要原因[23]，故本研究采用了去種皮操作）。

1.2 金絲李種胚和胚乳的RNA 提取

使用廣州艾基生物技術(shù)有限公司的IPure TRizol植物RNA 提取試劑盒（K417-S）分別對(duì)OS、UG和GS 3 組材料進(jìn)行種胚和胚乳（混合）的RNA提取。經(jīng)超微量核酸蛋白測(cè)定儀（ScanDrop 100）測(cè)定提取的RNA 純度及濃度（選擇A260/280≈ 1.8～2.1，A260/230>1.8），再經(jīng)過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的RNA 完整性，合格后存于?80℃冰箱以備下一步試驗(yàn)。

圖1 試驗(yàn)材料與取樣部分Fig.1 Experimental materials and the extraction parts

1.3 cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

將OS、UG 和GS 3 組材料各5 粒種子作為1組混池處理，3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。在上機(jī)前分別對(duì)總RNA 的純度、濃度及完整度用Nanodrop、Qubit及Agilent 2100 進(jìn)行檢測(cè)，選用評(píng)定等級(jí)為A 的樣品。樣品RNA 經(jīng)DNase I 處理后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA，加入打斷試劑將mRNA 打斷成短片段，并以打斷后的mRNA為模板用六堿基隨機(jī)引物（random hexamers）合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs 和DNA polymerase I 合成cDNA 第二鏈，經(jīng)QiaQuick PCR試劑盒純化回收、粘性末端修復(fù)、3′末端加上堿基“A”和連接測(cè)序接頭，得到的片段進(jìn)行大小選擇后，PCR 擴(kuò)增富集。構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer 和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System質(zhì)檢合格后使用Illumina HiSeqTM2500 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 數(shù)據(jù)過(guò)濾和de novo 拼接 為減少測(cè)序錯(cuò)誤對(duì)后續(xù)分析的影響，用FastaQC 軟件進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。測(cè)序得到的原始raw reads 中，將含有低質(zhì)量的和帶接頭的reads 進(jìn)行過(guò)濾（去掉包含adapter，不確定堿基N 比例超過(guò)5%及低質(zhì)量堿基（Q ≤10）,含量大于50%的reads）后得到clean reads。之后使用組裝軟件Trinity（version:trinityrnaseq_r20140717）對(duì)去重復(fù)的clean reads 進(jìn)行組裝。然后使用Tgicl v2.1 去其冗余并進(jìn)一步拼接，再對(duì)這些序列進(jìn)行同源轉(zhuǎn)錄本聚類(lèi)，獲得最終的unigenes。

1.4.2 unigene 功能注釋及差異表達(dá)基因的篩選

通過(guò)Blast 比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得功能注釋?zhuān)褂肂last2GO 對(duì)unigenes 集進(jìn)行GO 注釋。采用FPKM法來(lái)衡量基因的表達(dá)量。采用DESeq2 R package進(jìn)行unigenes 的差異表達(dá)分析，對(duì)金絲李3 個(gè)比較組合的DEGs 進(jìn)行篩選，條件為：|Log2Ratio| ≥1且錯(cuò)誤發(fā)生率（FDR）≤0.01。在KOBAS2.0 網(wǎng)站上進(jìn)行DEGs 的KEGG 的pathway富集分析。對(duì)于激素合成與降解及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)DEGs，在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中找到對(duì)應(yīng)注釋?zhuān)瑢⑵鋵?duì)應(yīng)的CDS 序列分別在NCBI 上進(jìn)行Blast 比對(duì)分析以確認(rèn)。

1.5 qRT-PCR 分析驗(yàn)證

采用qRT-PCR 技術(shù)驗(yàn)證此次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性，測(cè)試3 個(gè)比較組合中12 個(gè)DEGs 的表達(dá)量變化。以Actin3做為參照基因，采用Primer Premier v5.0 設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。采用Aidlab 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TUREscript 1st Strand cDNA SYNTHESIS Kit）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作。反應(yīng)程序：95℃，3 min；95℃，10 s；58℃，30 s；72℃，20 s；39 個(gè)循環(huán)。以2?△△CT方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平[30]。每個(gè)樣品進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)與3 次技術(shù)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)值以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SE）表示。使用Graphpad Prism 6 與SigmaPlot 11.0 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的產(chǎn)量與質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

通過(guò)對(duì)金絲李種胚和胚乳的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了OS、UG 和GS 3 組樣品共9 個(gè)樣本轉(zhuǎn)錄本信息，共超過(guò)120 G 的數(shù)據(jù)量；9 個(gè)樣本的GC 含量均在45.70%～47.49%間，Q20、Q30 的范圍分別為96.08%～96.56%、90.81%～92.38%（表2）。表明構(gòu)建的3 個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)測(cè)序質(zhì)量較好，可以滿足后續(xù)分析要求。

組裝結(jié)果顯示：9 個(gè)樣本共獲得了120 040 個(gè)unigenes，平均長(zhǎng)度為1 104.92 nt，N50 為1 874。所有樣品轉(zhuǎn)錄組的Unigenes 的長(zhǎng)度有26.68%都在200～300 bp 的范圍內(nèi)，3 000 bp 以上的Unigenes占5.95%。

2.2 熒光定量PCR 驗(yàn)證

熒光定量PCR 驗(yàn)證過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，除CL7766.Contig1 與CL6835.Contig2 外，隨機(jī)挑選DEGs 的qRT-PCR 的相對(duì)表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNASeq）的數(shù)據(jù)基本呈相似的變化趨勢(shì)（圖2），說(shuō)明RNA-Seq 分析的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)結(jié)果在qRTPCR 分析中有較高的再現(xiàn)性，從而解釋RNA-Seq分析具有較高的可信度。

表1 熒光定量引物列表Table 1 List of primers sequence of selected genes

2.3 金絲李種胚和胚乳的差異表達(dá)基因

對(duì)金絲李種胚和胚乳的OS、UG 和GS 3 組樣本進(jìn)行兩兩比較，篩選出一些DEGs，其中，GS相對(duì)OS 有1 174 個(gè)unigenes 上調(diào)表達(dá)，2 232 個(gè)下調(diào)表達(dá)；UG 相對(duì)OS 有849 個(gè)unigenes 上調(diào)表達(dá)，1 926 個(gè)下調(diào)表達(dá)；GS 相對(duì)UG 有814 個(gè)unigenes上調(diào)表達(dá)，670 個(gè)下調(diào)表達(dá)（圖3A），表明金絲李種胚和胚乳在播種后涉及復(fù)雜的生物過(guò)程。OS_VS_GS、OS_VS_UG 和UG_VS_GS 3 個(gè)比較組合的共同與特有的DEGs 分布圖見(jiàn)圖3B。

2.4 unigene 的KEGG 功能注釋

依據(jù)KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋信息可以進(jìn)一步獲得unigenes 的pathway 注釋?zhuān)?6 224 個(gè)注釋到該基因庫(kù)。≥3%的pathway 名稱(chēng)及其包含的基因數(shù)量見(jiàn)表3，其中，13 020 個(gè)代謝途徑（Metabolic pathways）的相關(guān)基因數(shù)量第一，占比23.16%，其次為6 727 個(gè)占比11.96%的次生代謝產(chǎn)物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）的相關(guān)基因。

2.5 差異表達(dá)基因的pathway 富集分析

利用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)將3 個(gè)比較組合文庫(kù)篩選得到的DEGs 進(jìn)行pathway 富集分析，以Qvalue ≤0.05 為標(biāo)準(zhǔn)。在3 個(gè)比較組合中注釋到的前4 條途徑一致，以代謝通路（Metabolic pathway）中的DEGs 最多，分別達(dá)709、533、256 個(gè)；其次是次生代謝產(chǎn)物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）途徑，分別有480、359、160 個(gè)DEGs被分別注釋到該途徑。說(shuō)明金絲李種子從休眠到萌發(fā)過(guò)程中，其基因表達(dá)差異多集中在這些途徑中。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的組裝質(zhì)量統(tǒng)計(jì)表Table 2 Summary of the sequence assembly after Illumina sequencing

圖2 12 個(gè)差異表達(dá)基因qRT-PCR 的驗(yàn)證分析Fig.2 qRT-PCR validation and analysis of 12 selected DEGs

2.6 休眠解除過(guò)程中的相關(guān)基因

2.6.1 與休眠解除相關(guān)基因的pathway 富集與表達(dá)OS_VS_GS 和UG_VS_GS 2 個(gè)比較組合牽涉到金絲李種子休眠的解除和萌發(fā)，筆者從中挑選出差異量較大的122 個(gè)基因（閾值log2|Fold Change| >2，且FDR <0.01）做熱圖，其富集到的pathway及其表達(dá)情況見(jiàn)圖4。從播種到萌發(fā)階段，富集到鈣信號(hào)通路（Calcium signaling pathway）、次生代謝產(chǎn)物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）（包括萜類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)化合物等）、核糖體（Ribosome）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Plant hormone signal transduction）等相關(guān)基因的表達(dá)量顯著升高；而富集到糖酵解/糖異生（Glycolysis/Gluconeogenesis）、脂肪酸合成與降解（Fatty acid biosynthesis and degradation）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）、氨基酸合成（Biosynthesis of amino acids）等相關(guān)基因的表達(dá)量則顯著降低。

圖3 3 個(gè)比較組合間的差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)（A）和共同與特有差異表達(dá)基因分布圖（B）Fig.3 Statistics of differentially expressed genes among three comparison groups of samples (A) and distribution of the genes commonly and specifically DEGs among three comparison groups of samples (B)

表3 金絲李種子的轉(zhuǎn)錄組unigene 的KEGG 代謝途徑注釋?zhuān)ā?3%）Table 3 KEEG pathway annotation of unigenes of transcriptome for G.paucinervis seeds (≥ 3%)

分析可知：在種子休眠解除的過(guò)程中，信號(hào)傳導(dǎo)、激素作用、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞分裂與代謝、次生代謝產(chǎn)物合成等比較活躍，且從原種子到種子吸脹過(guò)程中糖、脂肪和蛋白質(zhì)分解代謝也較旺盛，當(dāng)種子開(kāi)始萌發(fā)后，這些代謝相關(guān)基因逐漸關(guān)閉。

2.6.2 植物激素相關(guān)基因的篩選 在3 個(gè)比較的組合中篩選出40 個(gè)在種子休眠至萌發(fā)過(guò)程中與激素相關(guān)的基因，根據(jù)功能注釋可知，涉及到ABA、GA、auxin 和ETH 等相關(guān)的基因，其中，與激素合成、分解或衍生相關(guān)的基因有7 個(gè)，涉及ABA、GA 及ETH 共3 種植物激素；受體3 個(gè)，僅涉及GA 1 種植物激素；與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因有17 個(gè)，涉及到ABA、GA、auxin 和ETH 4 種激素；轉(zhuǎn)錄因子12 個(gè)，涉及ABA 和ETH 2 種激素，以ERF 家族成員最多；其他基因1 個(gè)。

與植物激素相關(guān)的DEGs 的表達(dá)情況見(jiàn)圖5，其中ZEP、GA2ox1、GA2ox3、GAI、GID1、SnRK2.2和ACO1在種子休眠解除時(shí)顯著下調(diào)表達(dá)，以ACO1下調(diào)最顯著，而CYP707A2、GA20ox1和GA3ox2在此過(guò)程中顯著上調(diào)表達(dá)。這些調(diào)控ABA、GA、auxin 和ETH 等相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生顯著的變化，很可能導(dǎo)致對(duì)應(yīng)激素的含量發(fā)生變化，促進(jìn)種子休眠的解除。

2.7 差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子分析

圖4 OS_VS_GS 與UG_VS_GS 比較組合中共有的部分差異表達(dá)顯著的基因的表達(dá)情況Fig.4 Expression profile analysis of common DEGs in OS_VS_GS and UG_VS_GS comparison groups of samples

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）在種子發(fā)育、休眠與萌發(fā)等植物生命周期中起著非常重要的作用。從3 個(gè)比較組合中共發(fā)現(xiàn)375 個(gè)差異表達(dá)的TFs，分屬于57 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族。OS_VS_GS樣本間有170 個(gè)差異表達(dá)的TFs，其中，ERF 和WRKY 家族各有20 個(gè)差異表達(dá)的TFs，MYB 和NAC 家族也均含14 個(gè)；OS_VS_UG 樣本間有147 個(gè)差異表達(dá)的TFs，其中，ERF 和NAC 家族各有20 個(gè)差異表達(dá)的TFs，MYB 和WRKY 家族也均含16 個(gè)；UG_VS_GS 樣本關(guān)系到種子從吸脹階段到萌發(fā)階段，它們間有75 個(gè)差異表達(dá)的TFs，其中，ERF 家族有14 個(gè)，HD-ZIP 和C3H 家族也均含6 個(gè)。

通過(guò)注釋發(fā)現(xiàn)，與結(jié)合蛋白、含結(jié)構(gòu)域的家族蛋白、ABA 和乙烯有關(guān)的TFs 表達(dá)量變化較大，其中，與乙烯有關(guān)的差異表達(dá)的TFs 達(dá)10 個(gè)。說(shuō)明有較多的轉(zhuǎn)錄因子家族和轉(zhuǎn)錄因子參與了金絲李種子由休眠到萌發(fā)的過(guò)程，推測(cè)它們?cè)诜N子破眠的過(guò)程中也起著一定作用。

圖5 與植物激素相關(guān)的差異表達(dá)基因的表達(dá)情況Fig.5 Expression profile analysis of DEGs related to plant hormone

3 討論

3.1 休眠解除過(guò)程中與物質(zhì)代謝、鈣信號(hào)通路相關(guān)的差異表達(dá)基因

糖酵解途徑是三條最基本的呼吸代謝途徑之一，為種子萌發(fā)提供所需能量[31]。Simmonds 等對(duì)野燕麥（Avena fatuaL.）種子休眠過(guò)程中糖代謝途徑研究證明，由糖酵解途徑/三羧酸循環(huán)向磷酸戊糖途徑轉(zhuǎn)變是解除其休眠的主要原因[32]。萌發(fā)前期的天女木蘭（Magnolia sieboldiiK.Koch）種子主要通過(guò)糖酵解途徑為種子萌發(fā)提供能量，定位于糖酵解/糖異生通路的5 種差異蛋白質(zhì)均在種子萌發(fā)前期高峰度表達(dá)[33]。本研究中發(fā)現(xiàn)8 個(gè)與糖酵解/糖異生合成或分解相關(guān)DEGs 在播種到種子吸脹、萌發(fā)過(guò)程中逐漸下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明糖酵解途徑為種子萌發(fā)提供能量后，這些糖酵解/糖異生代謝相關(guān)基因逐漸關(guān)閉。

在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成與代謝相關(guān)基因中，脂肪酸是一些植物種子的主要能量來(lái)源之一。巫山淫羊藿（Epimedium wushanenseYing）種子休眠解除過(guò)程中各脂肪酸含量變化顯著[34]。水曲柳（Fraxinus mandshuricaRuprecht）種子在休眠解除過(guò)程中，脂肪酶活性和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)快速增加，脂肪酸合成或分解的相關(guān)基因在休眠解除過(guò)程中差異表達(dá)，將貯藏物質(zhì)轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可為細(xì)胞分裂及胚根、胚軸和子葉的分化提供能量，為種子的萌發(fā)作準(zhǔn)備[35]。脂肪酸合成與降解相關(guān)的5 個(gè)基因CL5358.Contig3、CL6410.Contig10、CL5358.Contig9、CL3542.Contig2 和CL3542.Contig1 在金絲李種子休眠解除時(shí)表達(dá)量顯著變化，表明種子在破眠過(guò)程中脂肪酸代謝活躍。

鈣離子（Ca2+）作為第二信使參與調(diào)節(jié)植物的多種生理過(guò)程，參與許多胞內(nèi)信息或胞外刺激的接收和傳遞[36]。Somyong 等從水稻中鑒定出與鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的候選基因，涉及ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及對(duì)萌發(fā)至關(guān)重要的功能蛋白關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)[37]。此外，Ca2+信號(hào)參與GA 信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[38]，Ca2+-CaM（Calmodulin，鈣調(diào)蛋白）信號(hào)系統(tǒng)參與乙烯生成，以間接方式調(diào)節(jié)乙烯生成中ACC 合酶向乙烯轉(zhuǎn)化[39]。5 個(gè)鈣信號(hào)通路相關(guān)基因CL629.Contig5、CL6715.Contig3、CL629.Contig3、CL7156.Contig2和CL629.Contig4 均在種子吸脹且未萌發(fā)時(shí)（UG）表達(dá)量變化不大，但在萌發(fā)時(shí)均顯著上調(diào)，說(shuō)明鈣信號(hào)通路相關(guān)基因在休眠解除過(guò)程中可能起到一定的調(diào)控作用，可能參與了ABA、GA 和乙烯等激素有關(guān)基因的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或合成。

3.2 休眠解除過(guò)程中植物激素相關(guān)基因的表達(dá)

種子休眠解除受多種植物內(nèi)源激素調(diào)控[40]。Qi 等利用高通量胚胎轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)挖掘出重樓在種子層積過(guò)程中的11 個(gè)激素相關(guān)的DEGs[6]。此外，植物激素與植物的玩拗性密切相關(guān)[41]，而金絲李種子為較特殊的具有休眠屬性的玩拗性種子，故本文重點(diǎn)分析3 個(gè)比較組合中激素調(diào)控相關(guān)基因的差異表達(dá)。

GA 和ABA 的相關(guān)基因在種子休眠和萌發(fā)中的作用是通過(guò)合成、分解代謝與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的平衡來(lái)實(shí)現(xiàn)的[42]。杉木[8]、桃[10,12]等植物種子的休眠解除過(guò)程中，調(diào)控GA 和ABA 的相關(guān)基因表達(dá)量差異較大。金絲李種子在休眠解除過(guò)程中，ABA 和GA 合成途徑上的一些相關(guān)基因表達(dá)也有顯著差異，如ZEP是催化ABA 生物合成的關(guān)鍵酶基因[40]，從播種到萌發(fā)，ZEP表達(dá)顯著下調(diào)，表明ABA 合成的關(guān)鍵步驟受阻。CYP707A家族編碼ABA 8′-羥化酶，其影響種子從休眠到萌發(fā)的過(guò)程[17]，CYP707A2作用于ABA 的分解代謝[43]，在金絲李種子播后60 d，無(wú)論萌發(fā)與否，CYP707A2表達(dá)量均顯著上升。因此，CYP707A2與ZEP可能共同參與調(diào)控ABA 含量的降低。SnRk2.2主要參與ABA 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，正調(diào)控ABA 信號(hào)[44]。SnRk2.2在OS_VS_GS比較組合中表達(dá)量顯著下調(diào)。CL3120.Contig6 為一種RNA 結(jié)合蛋白，對(duì)ABI3、ABI4和ABI5起抑制作用，ABI3隸屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族，正向調(diào)控種子休眠，種子播后60 d，CL3120.Contig6 的表達(dá)量上調(diào)，說(shuō)明ABI3的表達(dá)受到抑制。因此，推斷ABA 調(diào)控金絲李種子萌發(fā)是多基因協(xié)同作用的結(jié)果，通過(guò)控制基因的表達(dá)量調(diào)控ABA 的合成或者改變ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，使得ABA 含量在種子萌發(fā)過(guò)程中發(fā)生變化。

GA20ox1與GA3ox2為GA 合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)控基因，而GA2ox1的高表達(dá)能夠?qū)е翯A 失活，從而調(diào)控GA 降解代謝。擬南芥種子在吸脹過(guò)程中，GA 合成的相關(guān)基因GA20ox1和GA3ox表達(dá)量均顯著增加[45]。本研究發(fā)現(xiàn)，GA20ox1在播后60 d 已萌發(fā)種子中表達(dá)量顯著上調(diào)，而GA3ox2在播后60 d 有無(wú)萌發(fā)的種子中表達(dá)量均顯著上調(diào)，推測(cè)GA20ox1與GA3ox2在金絲李種子休眠解除過(guò)程中有一定作用；而GA2ox1則在3 個(gè)比較組合中均下調(diào)表達(dá)。類(lèi)似的，西洋參種子在經(jīng)過(guò)層積處理的休眠解除過(guò)程中，其GA20ox3逐漸上調(diào)表達(dá)，不同的是，西洋參種子GA2ox3和ZEP的表達(dá)量變化不顯著[46]。GAI屬于DELLA 家族的基因，負(fù)調(diào)控GA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[47]。本研究發(fā)現(xiàn)，播后60 dGAI的表達(dá)量均下調(diào)，說(shuō)明對(duì)GA 信號(hào)的抑制作用減弱。GID1 通過(guò)蛋白質(zhì)間的相互作用，增強(qiáng)DELLA 對(duì)GA 的阻遏反應(yīng)[48]。GID1在播后60 d均下調(diào)表達(dá)，使得GA 的阻遏反應(yīng)減弱。因此，GA 控制金絲李種子休眠解除也是一個(gè)多基因協(xié)同的復(fù)雜過(guò)程，通過(guò)控制基因的表達(dá)量使得GA 含量在種子休眠解除時(shí)發(fā)生變化。結(jié)合張俊杰等所測(cè)量的金絲李種子從休眠到萌發(fā)進(jìn)程中內(nèi)源激素的變化情況分析[23]，其種子可能通過(guò)抑制ABA 的合成或促進(jìn)其分解，加強(qiáng)GA 的合成同時(shí)減弱其降解，與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)基因和有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相配合，使萌發(fā)促進(jìn)物與抑制物的比例趨于促進(jìn)以打破休眠。

ACO 控制種子萌發(fā)過(guò)程中乙烯的演化，是乙烯合成途徑中的關(guān)鍵酶。本研究播種后60 d 的種子中，ACO1的表達(dá)量均下調(diào)，且乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因和大部分乙烯應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子均下調(diào)表達(dá)，很可能導(dǎo)致乙烯的合成降低。推測(cè)乙烯很可能參與調(diào)控了金絲李種子的休眠與萌發(fā)。一些研究表明，乙烯作用于ABA 代謝降低ABA 含量，負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)途徑[49]，在休眠解除過(guò)程中含量逐漸升高[21,50]。但在本研究中，乙烯含量變化趨勢(shì)與之相反，具體原因有待進(jìn)一步研究。

轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控靶基因在特定的時(shí)間、空間和適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度進(jìn)行表達(dá)的一類(lèi)蛋白質(zhì)分子。本研究發(fā)現(xiàn)，bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族的CL9649.Contig2 和CL9649.Contig4 涉及到ABI5，而ABI5 通過(guò)與ABA 應(yīng)答元件（ABA-responsive-element,ABRE）結(jié)合來(lái)激活種子中ABA 介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，在種子萌發(fā)階段加強(qiáng)種子對(duì)外源ABA 的應(yīng)答[51]。在金絲李種子休眠解除時(shí)，與ABA 和乙烯有關(guān)的TFs 表達(dá)量變化較大，其中，與乙烯有關(guān)的差異表達(dá)的TFs 達(dá)10 個(gè)。無(wú)休眠的同屬植物山竹（G.mangostanaL.）種子在萌發(fā)過(guò)程中乙烯應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量變化也較大[52]，推測(cè)乙烯在藤黃屬植物種子中的作用具有更深入的研究意義。而金絲李種子休眠解除過(guò)程中各激素之間的互作機(jī)制，及其在種子休眠和萌發(fā)中的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)、蛋白互作的體內(nèi)證據(jù)及更多調(diào)控基因位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)都值得深入研究。

4 結(jié)論

本研究推測(cè)，金絲李種子休眠解除過(guò)程是通過(guò)上調(diào)鈣信號(hào)、次生代謝產(chǎn)物合成、核糖體和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等基因相關(guān)的通路，下調(diào)糖酵解/糖異生、脂肪酸合成與降解、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工和氨基酸合成等基因相關(guān)的通路，同時(shí)伴隨著上調(diào)GA 合成或ABA 分解的相關(guān)基因，下調(diào)ABA 的合成或GA 分解的相關(guān)基因，與有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相配合以打破休眠。乙烯很可能也參與調(diào)控其種子的休眠與萌發(fā)。