3D打印和CAD/CAM氧化鋯種植體骨結(jié)合性能的動物實驗評價

倪王成，胡琳馳，張維丹，周貝貝，黃溫棉，朱秦天，余季蘭，王仁飛

鈦種植體雖然因良好的“骨結(jié)合”[1]性能被廣泛應(yīng)用[2-3]，但也會因金屬過敏或美學(xué)問題而被限制應(yīng)用[4]。隨著數(shù)字化技術(shù)與修復(fù)技術(shù)緊密結(jié)合，氧化鋯種植修復(fù)有了技術(shù)突破[5-6]。本研究已建立氧化鋯種植體的三維模型[7]，并制造3D打印氧化鋯種植體和計算機輔助設(shè)計與制造(computer aided design & computer assomated manufacture，CAD/CAM)氧化鋯種植體。

為了氧化鋯種植體能夠達到與BEGO鈦種植體TiPurePlus相當?shù)谋砻娲植诙?粗糙度Ra=1～2 μm)[8-9]，預(yù)先對其表面進行噴砂和加熱酸蝕處理。采用硬組織切片技術(shù)和反向轉(zhuǎn)矩實驗，比較兩組氧化鋯種植體與某公司純鈦種植體的成功率、骨結(jié)合率、種植體周骨密度和反向轉(zhuǎn)矩值，評價氧化鋯種植體骨結(jié)合性能[10]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器 Exakt510脫水儀、Exakt520光固化包埋機、Exakt 300 CP切片機、Exakt 400 CS 磨片機(EXAKT公司，德國)，光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.1.2 手術(shù)器械 NSK種植機(NSK公司，日本)，種植器械盒(Thommen Medical AG，瑞士)，手術(shù)刀柄，刀片，持針器骨膜剝離器，血管鉗，組織剪，1號絲線，巾鉗，鋪巾。

1.1.3 實驗藥物 速眠新(圣達動物藥品有限公司，中國)，3%戊巴比妥鈉(科豐化學(xué)試劑有限公司，中國)，注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，中國)，多聚甲醛溶液、亞甲基藍、酸性品紅、高錳酸鉀、苦味酸、磷酸氫二鈉(豪普斯生物技術(shù)有限公司，中國)。

1.1.4 種植體 根據(jù)實驗?zāi)康姆譃?組。實驗組1：經(jīng)過表面處理的3D打印氧化鋯種植體20枚(昆山博力邁三維打印科技有限公司)(圖1A)；實驗組2：經(jīng)過表面處理的CAD/CAM氧化鋯種植體20枚(杭州口腔醫(yī)院)(圖1B)；實驗組3：某知名公司提供純鈦超親水種植體20枚(上海宇井貿(mào)易有限公司)。所有種植體直徑3.5 mm，長度8 mm，穿齦2 mm，基臺高度4 mm。

A：3D打??；B：CAD/CAM制作圖1 實驗用一段式氧化鋯植體Fig.1 One-stage zirconia implant for experiment

1.2 實驗方法

1.2.1 兩組氧化鋯種植體植入前表面處理 3D打印氧化鋯種植體和CAD/CAM氧化鋯種植體植入前采用顆粒尺寸為250 μm的Al2O3粒子，噴砂力度0.8 MPa，距離18 mm，垂直噴砂4個循環(huán)，40%氫氟酸60 ℃酸蝕60 min，蒸餾水超聲震蕩干燥后采用掃描電鏡對3D打印氧化鋯種植體和CAD/CAM氧化鋯種植體表面形貌進行顯微觀察。

1.2.2 實驗動物及模型制作 實驗動物成年雄性健康的Beagle犬共6只，15個月齡，質(zhì)量為16～17 kg。實驗動物使用許可證號：SYXK(浙)2018-0012。使用動物質(zhì)量合格證明編號：201807863。動物種植體植入手術(shù)及飼養(yǎng)均在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心進行，所有實驗動物在手術(shù)前均在籠子中隔離飼養(yǎng)1周。

將60枚植體編號1～60號，按隨機分配的原則(隨機數(shù)字表)植入6只Beagle犬的脛骨中，每只Beagle犬每側(cè)脛骨植入5枚種植體。全麻前準備：術(shù)前禁食12 h；術(shù)前0.5 h肌注青霉素鈉80萬U以預(yù)防感染。種植手術(shù)：氣管插管下，速眠新(0.04～0.08 mg/kg)對Beagle犬進行后腿肌肉注射。全麻起效后，常規(guī)消毒鋪巾，后腿阿替卡因1.7 mL浸潤麻醉，切開、翻瓣、暴露脛骨外側(cè)，逐級預(yù)備種植窩，植入種植體，安放愈合帽。對位縫合創(chuàng)口，種植術(shù)后即刻拍攝X線片，觀察植入位置、角度(圖2)。術(shù)后常規(guī)抗感染處理。

圖2 種植術(shù)后即刻拍攝X線片F(xiàn)ig.2 X-rays taken immediately after implantation

1.2.3 標本處理 在8周時，取3組種植體各10枚進行反向扭矩測試，將扭力扳手與種植體垂直相接，緩慢擰出種植體，扭力扳手刻度顯示將種植體擰松的扭力值即為旋出扭力峰值。隨后處死Beagle犬，將帶有種植體的脛骨整段鋸下(圖3)，生理鹽水反復(fù)沖洗，固定后制備不脫鈣硬組織切片。

圖3 帶有種植體的整段脛骨Fig.3 Entire tibia with implants

1.2.4 不脫鈣種植體骨切片的制備和染色 用4%的甲醛固定浸泡，4 ℃冰箱保存72 h，然后用70%乙醇溶液浸泡。修整帶種植體的標本，標本大小約5 mm×15 mm×10 mm，在Exakt510 脫水儀中使用70%～100%的乙醇溶液梯度脫水，在Exakt520光固化包埋機中進行樹脂浸透包埋和聚合(圖4)。完成聚合反應(yīng)后，準備A、B兩張載玻片，用Technovit 4000粘接劑把標本包埋塊粘合于載玻片A上，將載玻片A吸附于切片機夾具上，修整組織塊，使用Exakt 400 CS磨片機對標本表面進行拋光，然后用Technovit-7210VLC膠水將載玻片B粘合于標本的拋光面?zhèn)?，形成兩?cè)載玻片、中間組織塊的雙夾結(jié)構(gòu)。將載玻片A吸附在Exakt 300 CPa切片機夾具上，將切割厚度設(shè)定為150～200 μm，切下載玻片B側(cè)約150 μm厚的切片,使用SiC和Al2O3砂紙自動磨片，設(shè)置厚度為30 μm，再用細砂紙進行切片表面拋光，最終制作出作厚度約為30 μm的光滑種植體骨磨片。將切磨好的骨切片使用雙蒸水進行超聲清洗10 min，自然干燥后用亞甲基藍-酸性品紅染色，樹脂封片。

圖4 樹脂浸透包埋塊Fig.4 Resin impregnated embedded block

1.2.5 圖像分析/光學(xué)觀察及骨接觸率測定 在光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像，結(jié)合圖像處理軟件(Image- Pro Plus 6.0)進行測量并根據(jù)骨接觸率(bone-to-implant contact，BIC)和種植體周圍骨密度(bone density，BD)公式計算，得到兩組氧化鋯種植體和某知名公司純鈦組種植體的不含骨髓腔骨結(jié)合率、含骨髓腔骨結(jié)合率、平均骨接觸率和種植體周圍骨密度。骨接觸率(不含骨髓腔)=骨皮質(zhì)、骨松質(zhì)與種植體螺紋實際接觸的長度之和/種植體螺紋植入骨皮質(zhì)、骨松質(zhì)的長度×100%；骨接觸率(含骨髓腔)=骨髓腔與種植體螺紋實際接觸的長度之和/種植體螺紋植入骨髓腔內(nèi)的長度×100%；平均骨接觸率=骨與種植體實際接觸長度之和/種植體螺紋植入骨組織內(nèi)的長度×100%；種植體周圍骨密度(BD)=骨結(jié)合區(qū)域/整個結(jié)合區(qū)域×100%[11],測量方法為在螺紋端上放置一條切線，計算該切線與槽內(nèi)種植體輪廓之間的像素。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組氧化鋯種植體表面處理后掃描電鏡觀察

結(jié)果見圖5～6，可見經(jīng)噴砂+酸蝕后的氧化鋯表面形成均勻的粗化效果。3D打印組表面大孔徑12～17 μm，小孔徑1.1～2.6 μm。經(jīng)噴砂+酸蝕后的CAD/CAM組表面大孔徑18～21 μm，小孔徑1.0～2.6 μm。

A：表面大孔徑為12～17 μm( ×1 000)；B：小孔徑為1.1～2.6 μm( ×10 000)圖5 3D打印種植體(實驗組1)表面電鏡觀察Fig.5 Surface electron microscopy of 3D printed implants (Experimental group 1)

A：表面大孔徑為18～21 μm( ×1 000)；B：小孔徑為1.0～2.6 μm( ×10 000)圖6 CAD/CAM種植體(實驗組2)表面電鏡觀察Fig.6 Surface electron microscopy of CAD/CAM implants (Experimental group 2)

2.2 影像學(xué)觀察結(jié)果

術(shù)后離體的Beagle犬脛骨經(jīng)便攜式X線機拍照，得到種植體植入的骨界面愈合情況(圖7)。種植體和周圍骨組織嵌合緊密無間隙存在，螺紋均位于骨平面以下，光滑面均位于脛骨骨皮質(zhì)外，植體植入方向與骨面垂直，植體之間的間距在2～3 mm，植體周圍未見異常透射影像。三組種植體的成功率均為100%。

圖7 種植體植入的骨界面愈合情況Fig.7 Healing of bone interface after implantation

2.3 反向轉(zhuǎn)矩值統(tǒng)計

3D打印氧化鋯種植體組及CAD/CAM氧化鋯種植體組的反向轉(zhuǎn)矩值均大于35 N·m；鈦種植體組中2顆為20～35 N·m，8顆大于35 N·m。

2.4 亞甲基藍-酸性品紅染色、骨接觸率測定

圖8為種植體植入8周后，3D打印氧化鋯種植體、CAD/CAM氧化鋯種植體和純鈦種植體的亞甲基藍酸性品紅染色圖。亞甲基藍酸性品紅染色可清晰顯示新舊骨組織邊界和成骨細胞，便于區(qū)分軟硬組織。圖中可看到紫紅色的是骨小梁，藍色的是間質(zhì)。新生的編織骨較疏松，染色較深紫色；密質(zhì)骨為淺紫色，骨小梁間的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為淺藍色，纖維軟組織呈深藍色，藍色為類骨質(zhì)。另外，位于螺紋表面可以看到較粗的新生骨小梁。3組種植體不含骨髓腔骨結(jié)合率、含骨髓腔骨結(jié)合率、平均骨接觸率和種植體周圍骨密度數(shù)值如表1所示，差異均無顯著性(P>0.05)。

A：3D打印氧化鋯種植體；B：CAD/CAM氧化鋯種植體；C：純鈦種植體；密質(zhì)骨、編織骨、類骨質(zhì)、纖維軟組織分別呈深紫色、淺紫色、藍色、深藍色；3D打印種植體、CAD/CAM氧化鋯種植體、純鈦種植體分別呈黃棕色、黑色 圖8 種植術(shù)后8周不脫鈣種植體骨切片經(jīng)亞甲基藍酸性品紅染色的光學(xué)顯微鏡圖像Fig.8 Optical microscope image of the undecalcified implants stained with methylene blue acid fuchsin at the 8th week after implantation

表1 3組種植體骨結(jié)合率和種植體周骨密度Tab.1 Rates of bone osseointegration and the bone density value of 3 implant groups

3 討 論

評價種植體骨結(jié)合性能的方法主要有影像學(xué)檢查、旋出扭力法、硬組織切片技術(shù)等。本研究選擇Beagle犬作為實驗動物模型來評價種植體的骨結(jié)合性能，結(jié)合自身實驗條件，選擇X線牙片縱向觀察種植體骨界面愈合情況、種植體旋出扭矩、種植體骨接觸率、種植體周圍骨密度等指標來比較3D打印氧化鋯種植體、CAD/CAM氧化鋯種植體、純鈦種植體的骨結(jié)合性能。

本實驗采用X線片方法,觀察種植體植入術(shù)后8周的骨界面愈合情況,結(jié)果顯示3組標本均未發(fā)現(xiàn)種植體周圍異常透射影像,植體植入的三維位置與相互距離均正確，表明實驗動物模型成功建立。

旋出扭力法屬破壞性實驗,會使種植體的骨結(jié)合產(chǎn)生不可逆的損傷,所以臨床應(yīng)用受到限制。但其仍是動物實驗中評價骨結(jié)合程度的重要方法,一般采用數(shù)字扭力測試儀測量并記錄種植體骨結(jié)合被破壞時的扭力峰值,間接評價骨結(jié)合的狀況。Sullivan等[12]通過臨床研究,將20 N·m的扭力閾值作為種植體骨結(jié)合成功的標準。本實驗使用扭力扳手測量旋出扭矩峰值,結(jié)果顯示種植體植入術(shù)后8周以后，3組種植體扭力峰值均大于20 N·m,提示各組種植體均能形成良好的骨結(jié)合，可認為是成功骨結(jié)合的標準[13]。

不脫鈣種植體骨切片技術(shù)因其可以保存骨組織的細微結(jié)構(gòu),已被廣泛用于種植體骨結(jié)合的形態(tài)學(xué)研究。主要的骨形態(tài)計量學(xué)參數(shù)有骨接觸率和種植體周圍骨密度。骨接觸率和種植體周圍骨密度主要反映種植體周圍新骨形成的量，這個量很難達到100%[14]。文獻報道氧化鋯種植體的BIC為27.1%～74%.0[15-16]，純鈦種植體的BIC為23.2%～83.7%[17-18]，一般認為大于50%為適宜的骨結(jié)合率[19]。并且所有研究均顯示,同一觀察時間點氧化鋯種植體和鈦種植體BIC差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究植入8周時的組織學(xué)結(jié)果顯示,3組樣本的平均骨接觸率均達到48%以上，種植體周圍骨密度均在58%以上，均可獲得良好的初期穩(wěn)定性，并且3組骨接觸率和種植體周圍骨密度的差異無顯著性?；诒狙芯康慕Y(jié)果可得出，3D打印氧化鋯種植體、CAD/CAM氧化鋯種植體和純鈦種植體可達到相似且良好的骨結(jié)合程度，此結(jié)果和Stenlund、王曉娜等的研究結(jié)果一致[20-21]。