云龍石斑魚胃排空特征和攝食消化特性研究*

高云紅 景琦琦 黃 濱 關(guān)長濤 張佳偉李文升 翟介明 賈玉東①

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2. 青島國家科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；4. 萊州明波水產(chǎn)有限公司 萊州 261400)

魚類的攝食和消化是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)生理過程，多種激素和消化酶參與其中，保證其有序進(jìn)行。在激素和消化酶的作用下，魚類形成各自特有的胃排空類型，一直以來，研究者都將胃排空率(Gastric evacuation rate, GER)作為評價(jià)魚類消化功能的重要指標(biāo)(余方平等, 2007)。胃排空率是指攝食后食物從胃中排出的速率(李可貴等, 2009)。自20世紀(jì)60年代起，胃排空率被廣泛應(yīng)用于魚類生理、生態(tài)學(xué)的評價(jià)。迄今為止，國內(nèi)學(xué)者已對多種養(yǎng)殖魚類的胃排空率進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并以多種數(shù)學(xué)模型擬合胃排空率，為科學(xué)制定養(yǎng)殖魚類投喂頻率提供重要參數(shù)。馮憲斌等(2012)深入分析了巖原鯉(Procypris rabaudi)幼魚胃排空率和攝食量；余方平等(2007)測定了美國紅魚(Sciaenops ocellatus)的胃排空率；郭浩宇等(2017)闡明了許氏平鲉(Sebastes schlegelii)幼魚的胃排空特征；仇登高等(2018)明確了投喂頻率對鞍帶石斑魚(Epinephelus lanceolatus)胃排空率及消化酶的影響。研究表明，魚類胃排空率受自身內(nèi)在因素和諸多外在因素的共同影響，如魚類的種屬、日齡、飼養(yǎng)溫度、飼料種類、投喂頻率等(張波等, 2001)。攝食后，魚類攝食神經(jīng)中樞產(chǎn)生神經(jīng)沖動(dòng)，刺激下丘腦垂體分泌促進(jìn)攝食或抑制攝食因子，加之食物攝入后對胃腸道刺激，生理性反饋調(diào)控?cái)z食因子分泌，引起血液生理指標(biāo)和消化酶活性的變化，影響魚類攝食行為發(fā)生。而攝食消化過程中，胃排空率與魚類血液生理狀態(tài)和消化酶活性變化是否具有相關(guān)性目前尚未有深入研究。因此，闡明魚類血液生理、消化酶和胃排空之間的關(guān)系，將有助于了解其食欲恢復(fù)狀況，科學(xué)制定最佳投喂方案，對魚類高效健康養(yǎng)殖和經(jīng)濟(jì)性狀調(diào)控意義重大。

云龍石斑魚(E. moara ♀ × E. lanceolatus ♂)是由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所與萊州明波水產(chǎn)有限公司選育的石斑魚新品種，其父本為鞍帶石斑魚，母本為云紋石斑魚(E. moara)，云龍石斑魚兼具二者優(yōu)點(diǎn)，具有肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高、生長速度快的特點(diǎn)(唐江等, 2018; 李振通等, 2019; 成美玲等,2018)。2016 年初全面推向市場后，獲得了極高贊譽(yù)。目前，對云龍石斑魚的研究主要集中在親本表型數(shù)量性狀分析、幼魚溫度和鹽度適應(yīng)調(diào)控機(jī)制(邢道超等,2017)、肌肉營養(yǎng)成分分析及品質(zhì)評價(jià)(王林娜等, 2018)等方面，而有關(guān)云龍石斑魚攝食投喂的研究尚未見報(bào)道。本文通過研究云石斑魚攝食后胃排空特征，比較線性模型、平方根模型和立方模型對胃排空曲線的擬合程度，構(gòu)建云龍石斑魚胃排空的最佳數(shù)學(xué)模型，查明云龍石斑魚攝食后血清中葡萄糖、皮質(zhì)醇含量和肝臟消化酶活性的變化規(guī)律，旨在優(yōu)化云龍石斑魚養(yǎng)殖投喂策略，為實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖提供有效技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)魚由萊州明波水產(chǎn)有限公司提供，共150尾，平均體重為(680.35±39.84) g，體長為(30.05±1.72) cm。實(shí)驗(yàn)前在5 m×5 m×1.5 m養(yǎng)殖池中暫養(yǎng)1周(50尾/池，共3個(gè)養(yǎng)殖池)，水溫為18℃～19℃，溶氧為9～10 mg/L，pH為7.8～8.2，NH3-N＜0.5 mg/L。采用循環(huán)水飼養(yǎng)，每天投喂2次(間隔12 h)。投喂海童系列商品配合飼料(粗蛋白≥48%，粗脂肪≥10%，粗灰分≤17.0%，Ca≤4.0%，賴氨酸≥2.5%，總磷≥1.5～3.0，含少量幾丁質(zhì)的蝦或蟹)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品收集

實(shí)驗(yàn)開始前24 h 停止投喂，以保證其消化道徹底排空。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，用顆粒飼料進(jìn)行一次性飽食投喂，1 h 后清除殘餌。在投喂后0、3、6、9、12、15、18 和24 h，依次從每個(gè)養(yǎng)殖池中取6 尾魚，MS-222(100 mg/L)麻醉，解剖取樣。測定全長、體長和體重，尾靜脈取血，置于1.5 ml 的EP 管中，靜置15～20 min，3500 r/min 離心10 min，取上清液，保存于–20℃，用于檢測皮質(zhì)醇和葡萄糖含量。解剖取出胃、肝臟和腸組織。以濾紙吸干胃表面水分、稱重，排凈胃內(nèi)容物；用蒸餾水反復(fù)清洗胃內(nèi)壁，濾紙吸干、稱重，所得重量差值即為胃內(nèi)容物質(zhì)量(濕重)(曾令清等, 2011)；肝臟和腸組織于–20℃保存，用于檢測消化酶活性。

1.3 樣品處理與指標(biāo)檢測

1.3.1 血清中皮質(zhì)醇和葡萄糖含量測定 血清中葡萄糖含量采用南京建成公司試劑盒檢測，血清中的葡萄糖經(jīng)葡萄糖氧化酶的作用生成葡萄糖酸和H2O2，后者在過氧化物酶的作用下，將還原性4-氨基安替比林與酚偶聯(lián)縮合成可被分光光度計(jì)測定的物質(zhì)，所用波長為505 nm，單位為mmol/L。血清中皮質(zhì)醇含量采用競爭法檢測，向預(yù)先包被了抗體的酶標(biāo)孔中加入樣本，再加入生物素標(biāo)記的識(shí)別抗原，在37℃下孵育30 min，經(jīng)PBST 洗滌5 次后，加入親和素HRP，在37℃下孵育30 min，洗滌后加入顯色液，37℃顯色10 min，再加入終止液，在450 nm 波長下檢測，單位為ng/ml。

1.3.2 消化酶的測定 準(zhǔn)確稱重肝臟和腸組織，按重量(g)∶體積(ml)=1∶9，加入9倍體積1.2%的生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，2500 r/min，離心10 min，取上清液，以生理鹽水1∶9稀釋為1%組織勻漿。肝臟和腸組織總蛋白濃度，淀粉酶、糜蛋白酶、脂肪酶比活力均采用南京建成公司試劑盒檢測，波長為562、660、580和660 nm，所用儀器為UV 2800紫外可見分光光度計(jì)。

1.3.3 胃排空率計(jì)算 胃內(nèi)容物殘余百分比計(jì)算公式為：

式中，P 表示任一取樣時(shí)間胃內(nèi)容物重量(濕重)占總攝食量的百分比，W0表示在任一取樣時(shí)間時(shí)胃內(nèi)容物的重量，W1表示實(shí)驗(yàn)魚飽食狀態(tài)下的總攝食量(謝小軍等, 1998)。

用線性、立方根和平方根3 種數(shù)學(xué)模型分別擬合云龍石斑魚胃排空率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。各數(shù)學(xué)模型公式如下：

線性模型：Y=A–Bt

立方模型：Y=At3+Bt2+Ct+D

平方根模型：Y0.5=A–Bt

式中，Y 為胃內(nèi)殘余食物的濕重；t 為進(jìn)餐后的時(shí)間；A、B、C、D 為常數(shù)。

采用SPSS 18.0 和GraphPad Prism 7.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。通過比較分析各擬合模型的相關(guān)系數(shù)(R2)、殘差標(biāo)準(zhǔn)差(SDR)、殘差平方和(RSS)值，確定云龍石斑魚最佳胃排空模型。

以相鄰取樣點(diǎn)胃內(nèi)容物量差值(St)的自然對數(shù)值與所對應(yīng)的間隔取樣時(shí)間(t)進(jìn)行線性回歸，其線性方程為：

式中，所得線性方程的斜率a 即為云龍石斑魚的瞬時(shí)排空率(劉麗華等, 2005)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，當(dāng)差異達(dá)到顯著水平，進(jìn)行Duncan 氏多重比較。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示，P＜0.05 為差異顯著。3 種數(shù)學(xué)模型的參數(shù)A、B、C、D 均由統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行曲線擬合得到。

2 結(jié)果

2.1 云龍石斑魚胃排空特征及胃排空模型

飽食投喂后，云龍石斑魚的胃內(nèi)容物百分比隨時(shí)間呈規(guī)律性變化(圖1)。投喂后，云龍石斑魚胃內(nèi)容物百分比呈逐漸下降的趨勢，3～6 h 急劇下降，由88.5%降至33.2%，差異顯著(P＜0.05)，0～3、6～15 h胃內(nèi)容物百分比下降速率較緩，攝食后15 h，胃內(nèi)容物基本排空，屬于典型的先慢后快再慢胃排空類型。

圖1 云龍石斑魚胃排空變化Fig.1 The changes of gastric evacuation of Yunlong grouper(E. moara ♀× E. lanceolatus ♂)

利用SPSS 軟件將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，可知線性模型、平方根模型、立方模型均可擬合本實(shí)驗(yàn)胃排空率(圖2)。從R2來看，立方模型＞平方根模型＞線性模型；從RSS 來看，線性模型＞平方根模型＞立方模型；從SDR 來看，線性模型＞平方根模型＞立方模型(表2)。綜合R2、RSS、SDR 結(jié)果，立方模型對云龍石斑魚胃排空率的擬合程度最佳，其公式為Y=–0.001t3+ 0.099t2–2.644t+20.677，根據(jù)公式可得，投喂后14.8 h，胃內(nèi)容物完全排空。

2.2 云龍石斑魚消化酶的變化

云龍石斑魚消化酶呈規(guī)律性變化(圖3)。飽食投喂后0～3 h，云龍石斑魚肝臟內(nèi)淀粉酶活性無顯著變化，3～6 h 呈急劇上升趨勢(P＜0.05)，6 h 時(shí)活性達(dá)到最高值(0.151 U/g prot)，之后呈下降趨勢，至投喂后15 h 時(shí)，肝臟內(nèi)淀粉酶活性恢復(fù)至初始水平，而投喂后云龍石斑魚腸道內(nèi)的淀粉酶活性無顯著變化，且肝臟內(nèi)淀粉酶活性高于腸道內(nèi)淀粉酶活性(圖3A)。肝腸內(nèi)的糜蛋白酶、脂肪酶活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，且均在飽食投喂后6 h 時(shí)，活性達(dá)到最高(P＜0.05)，隨后顯著下降(圖3B、圖3C)。同時(shí)，腸道內(nèi)糜蛋白酶活性顯著高于肝臟(P＜0.05)。如表2 所示，云龍石斑魚瞬時(shí)胃排空率與肝腸消化酶(除腸道內(nèi)淀粉酶)均呈正相關(guān)(P＜0.05)，消化酶之間無顯著相關(guān)性。

表1 云龍石斑魚胃排空曲線的3 種數(shù)學(xué)模型擬合Tab.1 The fitting with 3 types of mathematical models for gastric evacuation of Yunlong grouper(E. moara ♀ × E. lanceolatus ♂)

圖2 云龍石斑魚胃排空曲線的3 種數(shù)學(xué)模型擬合Fig.2 The fitting with 3 types of mathematical models for gastric evacuation of Yunlong grouper(E. moara ♀×E. lanceolatus ♂)

2.3 云龍石斑魚血清皮質(zhì)醇和葡萄糖的變化

云龍石斑魚血清中皮質(zhì)醇和葡萄糖的含量均呈先升高后降低的變化趨勢(圖4)。投喂后0～3 h，云龍石斑魚血清中葡萄糖含量逐漸升高，3～6 h 急劇升高，差異性顯著(P＜0.05)，6 h 時(shí)葡萄糖含量達(dá)到最高(21.02 mmol/L)，6～18 h 呈下降趨勢，18 h 后血清中葡萄糖含量不再變化(圖4A)。血清中皮質(zhì)醇含量同葡萄糖含量呈相似的變化趨勢，投喂后，血清中皮質(zhì)醇含量逐漸升高，3～6 h 急劇增加，差異顯著(P＜0.05)，6 h 時(shí)，其含量達(dá)到最高(152.6 mmol/L)。6 h 后，血清中皮質(zhì)醇含量呈顯著下降趨勢，12 h 后無顯著差異(圖4B; P＞0.05)。

3 討論

3.1 魚類胃排空方式與模型選擇

魚類種屬多樣，攝食習(xí)性和消化道結(jié)構(gòu)存在差異，胃排空方式復(fù)雜多樣。研究表明，魚類胃排空方式主要有3 種類型：直線下降型、先快后慢型和先慢后快再慢型。胃排空類型與食物類型、飼料組成及魚類攝食偏好存在顯著相關(guān)性，以大而不易碎食物為食的魚類，胃排空方式多為直線下降型，如黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)(張波等, 2001)、美國紅魚(余方平等, 2007)；以小而易碎食物為食的魚類，多呈先快后慢型，也被稱為固有的內(nèi)在排空方式，如：黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)(覃志彪等, 2011)、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)(孫曉峰等, 2011)。本研究中，投喂云龍石斑魚顆粒飼料中添加了幾丁質(zhì)外殼的蝦或蟹，延緩了消化酶與食物作用的時(shí)間，云龍石斑魚胃排空方式呈先慢后快再慢型。日本皇姑魚(Nibea japonica)(朱云海等,2013)、俄羅斯鱘魚(Acipenser gueldenstaedtii)(張濤等,2015)也呈現(xiàn)類似的胃排空方式。

表2 云龍石斑魚瞬時(shí)排空率與消化酶相關(guān)性分析Tab.2 Correlation between instantaneous emptying rate and digestive enzymes in Yunlong grouper(E. moara ♀ × E. lanceolatus ♂)

圖3 云龍石斑魚攝食24 h 內(nèi)消化酶變化Fig.3 Changes of digestive enzymes of Yunlong grouper (E. moara ♀ × E. lanceolatus ♂) within 24 hours of feeding

圖4 云龍石斑魚攝食24 h 內(nèi)血清中葡萄糖和皮質(zhì)醇變化Fig.4 Changes of glucose and cortisol in serum of Yunlong grouper(E. moara ♀×E. lanceolatus ♂) within 24 hours after ingestion

魚類的胃排空方式復(fù)雜多樣，如何選擇并構(gòu)建合適的胃排空數(shù)學(xué)模型存在較大爭議。Jobling(1981)首次以數(shù)學(xué)模型評估了魚類胃排空率變化。隨后，各國研究者紛紛開展了以數(shù)學(xué)模型擬合胃排空率的研究，但如何選擇合適的數(shù)學(xué)模型擬合數(shù)據(jù)，鑒于魚類種屬間差異，仍要根據(jù)具體情況進(jìn)行深入分析研究。目前，常見的數(shù)學(xué)擬合模型有線性模型、指數(shù)模型和平方根模型3 種(張波等, 2001)。本研究中，線性模型、平方根模型、立方模型均可擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，立方模型擬合度最佳。Ruohonen 等(1998)對虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的研究發(fā)現(xiàn)，在投喂后15 h，胃內(nèi)容物消化完全，但在其胃排空率達(dá)到80%～90%時(shí)(投喂后6 h)，其食欲已經(jīng)基本恢復(fù)，所以，將投喂后6 h 作為最適投喂間隔。Riche 等(2004)對尼羅羅非魚的研究同樣可以證實(shí)這一點(diǎn)。根據(jù)立方模型公式得出，云龍石斑魚在投喂后9.5 h 胃排空率達(dá)到80%，14.8 h 時(shí)，胃內(nèi)容物全部排空。

3.2 消化酶活性分析

消化酶依據(jù)消化對象不同分為淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶，其活性變化直接影響魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進(jìn)而調(diào)控魚類的生長發(fā)育(Vera et al,2007)。魚類消化酶活性受魚類種屬、生理狀態(tài)、發(fā)育階段等內(nèi)在因素和水溫、鹽度、飼料等外在因素共同影響(黃瑾等, 2011)。魚類食性不同，消化道內(nèi)消化酶組成和活性存在顯著差異，肉食性魚類消化道短，食物的消化吸收主要在腸道，腸道中蛋白酶活性遠(yuǎn)高于其他組織(區(qū)又君等, 2012; 向梟, 2002; 吳水清,2014)。本研究結(jié)果顯示，攝食后云龍石斑魚肝臟和腸道內(nèi)消化酶活性均呈規(guī)律性變化，且在肝臟和腸道內(nèi)消化酶分布有所不同。肝臟中淀粉酶呈先升高后降低的變化趨勢，腸道內(nèi)淀粉酶活性無顯著變化，腸道內(nèi)糜蛋白酶活性顯著高于肝臟內(nèi)糜蛋白酶活性，脂肪酶在肝臟和腸道內(nèi)活性均呈先升高后降低的趨勢。吳婷婷等(1994)對鱖魚(Siniperca chuatsi)、青魚(Mylopharyngodon piceus)、鯉(Cyprinus carpio)、鯽(Carassius auratus)、草魚(Ctenopharyngodon idellus)和鰱(Hypophthalmichthys molitrix)消化酶活性的研究中也得到了類似結(jié)果，發(fā)現(xiàn)草魚、鯉、鰱肝臟內(nèi)淀粉酶活性要高于腸道內(nèi)淀粉酶活性，但青魚和鯽肝臟內(nèi)淀粉酶活性顯著低于腸道內(nèi)淀粉酶活性。付新華等(2005)對大菱鲆(Scophalmus maximus)的研究發(fā)現(xiàn)，腸是水解脂肪和淀粉的主要器官，而腸水解蛋白的能力較弱。魚類消化酶分布廣泛，種屬差異必然會(huì)造成其時(shí)空分布及表達(dá)活性不同。Santos 等(2016)也得出了相似的結(jié)論。云龍石斑魚作為肉食性魚類，其糜蛋白酶活力和脂肪酶活性顯著高于淀粉酶活性，同時(shí)，胃排空速率與肝腸消化酶呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

3.3 血液生理學(xué)變化

哺乳動(dòng)物下丘腦中存在中樞葡萄糖感應(yīng)器和整合與發(fā)放食欲信號(hào)的中樞，可通過監(jiān)測機(jī)體內(nèi)葡萄糖的變化控制動(dòng)物體的攝食情況(楊麗萍等, 2014)。Fuentes等(2013)發(fā)現(xiàn)，魚類存在與哺乳動(dòng)物類似的攝食調(diào)控機(jī)制，葡萄糖同樣對魚類的攝食有著重要的調(diào)控作用。本研究中，攝食后，云龍石斑魚血清中葡萄糖含量顯著升高，6 h 時(shí)達(dá)到峰值，且在3～12 h 時(shí)，血清中葡萄糖含量持續(xù)維持在較高水平，認(rèn)為此時(shí)云龍石斑魚食欲尚未恢復(fù)，不適宜投喂。李晨晨等(2018)在對黃顙魚的研究中指出，攝食后魚體血清葡萄糖濃度顯著升高，且飼喂不同飼料葡萄糖升高濃度有所不同。皮質(zhì)醇為糖皮質(zhì)激素，皮質(zhì)醇誘導(dǎo)葡萄糖水平升高，促進(jìn)脂肪積累(Kominiarek et al, 2018)。葡萄糖和皮質(zhì)醇協(xié)同作用，共同參與調(diào)節(jié)魚類攝食和營養(yǎng)物質(zhì)的攝取。Milligan 等(2003)對虹鱒的研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇可以激活肝臟內(nèi)酶活性，促進(jìn)糖元合成。因此，攝食后4～9 h 中，血清中皮質(zhì)醇濃度顯著升高，可能主要用于葡萄糖合成，但具體代謝調(diào)控機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，攝食后云龍石斑魚血清內(nèi)葡萄糖和皮質(zhì)醇含量、肝臟及腸道內(nèi)消化酶活性均呈規(guī)律性變化，胃排空率呈典型的先慢后快再慢類型，其最優(yōu)擬合模型為立方模型，根據(jù)模型可知，云龍石斑魚食欲基本恢復(fù)時(shí)間為投喂后9.5 h (80%胃排空)，基于以上數(shù)據(jù)結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，云龍石斑魚每日飼喂2 次，每次間隔10 h 左右效果最佳。