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    響應(yīng)面法優(yōu)化山地五月茶黃酮提取工藝

    2021-03-19 07:18:56范春雅樊雪瓊郭教玲謝世瑩李娟周丹
    熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年1期
    關(guān)鍵詞:面法山地黃酮

    范春雅 樊雪瓊 郭教玲 謝世瑩 李娟 周丹

    (海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 海南???571199)

    山地五月茶(Antidesma montanum),是大戟科五月茶屬植物,主產(chǎn)于廣東、海南、廣西等地。五月茶屬植物通常以根、葉、莖入藥,具有健脾、抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、生津、活血、收斂、解毒等功效[1]。山地五月茶,在海南分布廣泛。民間常將其與眼樹蓮合用治療眼疾。前期研究表明,山地五月茶安全無毒,有很好的藥理活性和開發(fā)前景[2-3]。

    黃酮類化合物是植物界分布最為廣泛的一大類次生物質(zhì),具有很好的藥理生理活性,如治療心腦血管系統(tǒng)和消化、呼吸系統(tǒng)疾?。豢拱?、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌,消除自由基、抗氧化、抗衰老等,抗病毒及提高機(jī)體免疫力等,已被列為保健食品的一類功能因子[4-5]。黃酮的提取方法有溶劑提取法、吸附法、超臨界流體萃取法、堿溶酸沉法等。溶劑法是提取黃酮類化合物最常用的方法,此法操作簡(jiǎn)單、易行。李萍[6]用溶劑法提取蘋果屬植物葉片中的類黃酮,發(fā)現(xiàn)影響提取率的關(guān)鍵因素有提取劑濃度、料液比,其次為提取溫度和時(shí)間;此外,類黃酮在提取過程中可能會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng),可采用在提取劑中加入BHT(二丁基羥基甲苯)、抗壞血酸等還原劑加以預(yù)防。黃酮的測(cè)定方法主要有紫外分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)等[7-10]。紫外分光法能快速地測(cè)出黃酮的含量,操作簡(jiǎn)便,因而得到廣泛應(yīng)用[11]。

    本研究旨在探討山地五月茶總黃酮的提取工藝,并采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件,為山地五月茶的研究開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 藥材與試劑

    山地五月茶地上部分采自海南省萬寧市興隆縣,經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院曾念開教授鑒定為山地五月茶(Antidesma montanum)。

    蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)20771,上海源葉生物科技有限公司)、無水乙醇(西隴科學(xué)股份有限公司)、亞硝酸鈉(西隴科學(xué)股份有限公司)、氫氧化鈉(西隴化工股份有限公司)、硝酸鋁(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。所有試劑級(jí)別均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

    1.1.2 儀器

    UV 1800C型紫外可見分光光度計(jì)(上海鳳凰儀器有限公司);AE100 型電子分析天平(南京庚辰科學(xué)儀器有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 山地五月茶黃酮的提取與含量測(cè)定

    1.2.1.1 山地五月茶黃酮的提取

    準(zhǔn)確稱取2 g 樣品粉末于100 mL 圓底燒瓶中,加入60%乙醇20 mL,于80℃下加熱回流提取2 h,離心過濾;提取3 次,合并濾液,用60%乙醇定容至100 mL,即得山地五月茶樣品溶液[12]。

    1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    準(zhǔn)確稱取干燥蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg于50 mL容量瓶中,用無水乙醇定容,搖勻,即得濃度為0.400 0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液[13];準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、3.50 mL 于比色管中,分別加入5%NaNO2溶液1.00 mL,搖勻后靜置6 min;加入10%Al(NO3)3溶液1.00 mL,搖勻后靜置6 min,加入4% NaOH 溶液4.00 mL,用無水乙醇定容至10 mL,搖勻并靜置10 min,于500 nm 處測(cè)定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo),濃度C(g/L)為橫坐標(biāo)[10],繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.1.3 黃酮含量的測(cè)定

    準(zhǔn)確移取1.00 mL 樣品液于比色管中,按“1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”測(cè)定吸光度;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算黃酮得率。總黃酮得率公式如下(Y):

    Y=CV/M

    式中:Y為黃酮得率,單位為1;C為提取液濃度,g/mL;V為提取液原始體積,mL;M為所稱取山地五月茶粉末質(zhì)量,g。

    1.2.2 山地五月茶黃酮提取工藝優(yōu)化

    以乙醇為溶劑對(duì)山地五月茶進(jìn)行加熱回流提取,結(jié)合單因素試驗(yàn),利用響應(yīng)面法對(duì)山地五月茶黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

    1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

    分別考察乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)山地五月茶加熱回流提取效果的影響(表1),黃酮含量測(cè)定方法同“1.2.1.3 黃酮含量的測(cè)定”。

    表1 加熱回流提取的條件

    1.2.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

    結(jié)合上述單因素試驗(yàn)結(jié)果,采用4 因素3 水平進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì),試驗(yàn)因素與水平如表2所示。自變量的試驗(yàn)水平分別以-1、0、1 進(jìn)行編碼,共設(shè)計(jì)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。

    表2 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

    2 結(jié)果與分析

    2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與黃酮含量的測(cè)定

    按“1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”,依次測(cè)得各標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度。以濃度C為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如圖1所示。線性方程為A=0.229 4C+0.023 7,相關(guān)系數(shù)r=0.999 1。

    圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

    2.2 山地五月茶黃酮提取工藝優(yōu)化

    2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

    2.2.1.1 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

    在提取時(shí)間為1 h、料液比為1∶40、提取溫度為60℃、提取3 次的條件下,考察不同乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)對(duì)山地五月茶黃酮提取效果的影響,結(jié)果如圖2 所示。由圖2 中可知,乙醇濃度對(duì)樣品中黃酮的提取影響較大,隨著乙醇濃度的增加,黃酮的含量呈先升高而后下降的變化趨勢(shì);當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí),總黃酮含量最高。這說明山地五月茶中中等極性的黃酮苷類物質(zhì)含量比較高,當(dāng)乙醇濃度大于50%時(shí),溶劑極性降低,導(dǎo)致部分黃酮苷類物質(zhì)不能溶解,某些脂溶性雜質(zhì)溶出,使黃酮提取率降低。因此,最佳乙醇濃度為50%。

    2.2.1.2 料液比對(duì)加熱回流提取效果的影響

    圖2 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

    在提取時(shí)間為1 h、乙醇濃度為60%、提取溫度為60℃、提取3 次的條件下,考察1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 料液比對(duì)山地五月茶黃酮提取效果的影響,結(jié)果如圖3所示。當(dāng)料液比為1∶30 時(shí),總黃酮提取率達(dá)到峰值。繼續(xù)提高料液比,黃酮提取率反而下降。這可能是因?yàn)橐呀龅拇罅侩s質(zhì)影響了黃酮的浸出率;或者是因?yàn)橐呀龅拇罅奎S酮對(duì)剩余黃酮有協(xié)同浸提作用[9]。

    圖3 乙醇體積對(duì)提取效果的影響

    2.2.1.3 提取時(shí)間對(duì)加熱回流提取效果的影響

    在提取溫度為60℃、料液比為1∶40、乙醇濃度為60%、提取3次的條件下,考察提取時(shí)間(30、60、90、120、150 min)對(duì)山地五月茶黃酮提取效果的影響,結(jié)果如圖4 所示。從圖4 可知,黃酮含量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,當(dāng)提取時(shí)間為90 min 時(shí),黃酮含量達(dá)到極值,之后又逐漸降低。因此,最佳提取時(shí)間為90 min。

    2.2.1.4 提取溫度對(duì)加熱回流提取效果的影響

    在提取時(shí)間為1 h、料液比為1∶40、乙醇濃度為60%、提取3次的條件下,考察不同溫度(50、60、70、80、90℃)對(duì)山地五月茶黃酮提取效果的影響,結(jié)果如圖5 所示。從圖5 可知,黃酮含量隨著提取溫度的升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì),在溫度為80℃時(shí)含量最高。這是因?yàn)樯郎丶铀倭它S酮類物質(zhì)的滲透、擴(kuò)散、溶解等,更有利于黃酮的提??;但過高的溫度易使黃酮類物質(zhì)氧化變性,從而導(dǎo)致提取率下降[7]。因此,最佳提取溫度為80℃。

    圖4 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

    圖5 提取溫度對(duì)提取效果的影響

    2.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

    2.2.2.1 回歸方程建立與方差分析

    根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以料液比(A)、乙醇濃度(B)、提取溫度(C)、提取時(shí)間(D)為自變量,山地五月茶黃酮得率為因變量進(jìn)行響應(yīng)面法設(shè)計(jì)(表2),共設(shè)計(jì)29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn),響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝分析方案及結(jié)果如表3所示。

    利用Design-Expert 8.0 軟件對(duì)表3 的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,方差分析結(jié)果見表4。由表4 可知,料液比(p<0.01)和乙醇濃度(p<0.50)對(duì)總黃酮的提取影響顯著。以山地五月茶中總黃酮得率(Y)為響應(yīng)值,經(jīng)回歸擬合后,得到回歸方程:

    Y=0.866-2.95×10-3A+6.415×10-3B-0.015C-6.56×10-3D+3.75×10-5AB+5.5×10-5AC+2.5×10-5AD+3.5×10-5BC+1.08×10-5BD+6.92×10-5CD-7.02×10-5A2-1.08×10-4B2+3.67×10-5C2-2.04×10-6D2

    表3 響應(yīng)面優(yōu)化分析方案

    由表4 可知,該模型顯著(p= 0.0048<0.05),失擬項(xiàng)不顯著 (p= 0.9045>0.05),決定系數(shù)R2=0.812 5,說明有81.25%的變差能夠由該模型解釋;變異系數(shù)CV為8.94%,說明變異(偏離)程度較小。因此,該模型具有良好的擬合度,能真實(shí)地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系,可對(duì)山地五月茶黃酮的提取條件進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析[14]。

    2.2.2.2 各因素響應(yīng)面交互作用分析

    將2 個(gè)因素固定在0 水平,通過Design-Ex-pert 8.06 軟件統(tǒng)計(jì)分析,觀察其余2 個(gè)因素的交互作用。通過響應(yīng)面和等高線圖,分析各影響因素的響應(yīng)面交互作用。由圖6-a可知,響應(yīng)面坡度都比較陡峭,說明料液比(A)和乙醇濃度(B)對(duì)黃酮提取率影響較大[8]。由響應(yīng)面的等高線圖(圖6-b)可知,等高線為橢圓形,說明料液比和乙醇濃度這2個(gè)自變量間交互作用較強(qiáng)。通過軟件分析得知,山地五月茶總黃酮的最佳提取條件為:乙醇濃度57.38%、料液比1∶39.58、提取溫度84.15℃,加熱回流提取101.13 min,在此條件下,預(yù)期山地五月茶黃酮得率可達(dá)到0.121 0。為實(shí)際操作方便,實(shí)際的最優(yōu)提取條件為乙醇濃度57%、料液比1∶39、提取溫度84℃,加熱回流提取100 min,進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn),山地五月茶總黃酮得率平均值為(0.118 9±0.02),與預(yù)測(cè)值接近,說明此響應(yīng)面法得到的回歸模型具有一定的可靠性。

    表4 方差分析

    4 結(jié)論

    本實(shí)驗(yàn)研究了山地五月茶黃酮的提取工藝,通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法確定了山地五月茶黃酮的最佳提取條件為:乙醇濃度57%、料液比1∶39、提取溫度84℃、加熱回流提取100 min,黃酮得率為(0.118 9±0.02)。

    圖6 乙醇濃度和料液比交互作用對(duì)黃酮得率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

    此提取工藝操作簡(jiǎn)便、工藝成熟、提取率高、綠色環(huán)保,將為山地五月茶的研究開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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