醫(yī)用鎂合金表面肝素/蒙脫石涂層耐蝕性研究

田景睿，李慧，鄒玉紅，曾榮昌

（山東科技大學(xué) a.化學(xué)與生物工程學(xué)院 b.材料科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島266590）

目前，介入性血管支架仍是治療心腦血管缺血性疾病的主要方法之一，醫(yī)用金屬材料在其中發(fā)揮著舉足輕重的作用。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物材料學(xué)的發(fā)展，研究重點(diǎn)聚焦于生物可降解支架，其最大的特點(diǎn)在于可降解性，因此，患者需要二次手術(shù)將支架取出的問(wèn)題迎刃而解[1]。近年來(lái)，研究最多的生物可降解支架有可降解聚合物支架、可降解鎂合金支架、可降解鐵合金支架和可降解鋅合金支架[2]。聚合物材料的降解行為可通過(guò)控制其分子量、單體種類(lèi)和側(cè)枝基團(tuán)得到調(diào)控，如Igaki-Tamai 支架[3]、XINSORB 支架[4]，但是與金屬材料相比，它們都存在支撐力不足、支架壁較厚、對(duì)血管有刺激作用等問(wèn)題，大大限制了其臨床應(yīng)用[5]。鐵合金作為支架材料表現(xiàn)出良好的機(jī)械性能及可視性，但其降解速率過(guò)慢的問(wèn)題[6]，增加了炎癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。鋅合金是一種新型生物可降解合金，有研究表明在大鼠試驗(yàn)中，鋅基支架可表現(xiàn)出令人接受的生物相容性，但會(huì)導(dǎo)致慢性和急性炎癥發(fā)生，且其在體內(nèi)外的降解機(jī)制和產(chǎn)物代謝吸收等問(wèn)題仍待進(jìn)一步研究[7]。鎂合金作為心血管支架材料具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如鎂可參與人體代謝[8]，具有低血栓源性，是ATP酶的輔因子，可抑制血管內(nèi)再狹窄，維持血管壁張力[9]等。Erbel[10]將71 個(gè)可降解鎂合金支架（長(zhǎng)10～ 15 mm，直徑3.0～3.5 mm）植入63 例病人的冠狀動(dòng)脈中，術(shù)后血管狹窄率由(61.5±13.1)%降至(12.6±5.6)%。但鎂合金在人體內(nèi)表現(xiàn)出良好生物相容性的同時(shí)，也面臨著降解速度過(guò)快的問(wèn)題[11]。鎂合金植入物降解過(guò)快使其機(jī)械性能降低，表面粗糙度增加，局部血液pH 值過(guò)高[12]，由此引發(fā)血栓、血管彈性回縮及血管再狹窄等一系列問(wèn)題，從而限制了該類(lèi)支架的應(yīng)用。目前，表面修飾成為了降低鎂合金腐蝕速率的主要方法，同時(shí)為了解決支架植入后的再狹窄等問(wèn)題，在支架表面攜帶各種藥物成為大勢(shì)所趨。Xu 等[13]將負(fù)載西羅莫司（一種防止內(nèi)膜增生的藥物）的絲素蛋白作為AZ31 鎂合金支架涂層的聚合物，研究表明絲素蛋白涂層減緩了藥物從絲素層的釋放，提高了支架的耐腐蝕性能，降低了血管再狹窄的風(fēng)險(xiǎn)。Ye 等[14]篩選了一種普通的口服阿托伐他汀鈣，并將其加載到AZ31 鎂合金表面的聚三亞甲基碳酸酯中，得到了具有降解速率可控、靶向藥物遞送和血管重塑等優(yōu)點(diǎn)的支架材料。

蒙脫石（又稱(chēng)蒙脫土）是一種天然的片層狀鋁硅酸鹽黏土礦物，具有良好的陽(yáng)離子交換能力和吸附性能，可作為黏膜保護(hù)劑[15]、抗菌緩釋劑[16]和分散劑[17]等，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療行業(yè)。許多臨床醫(yī)生[18-20]將蒙脫石用于消化道止血，取得較滿(mǎn)意的臨床療效。王建坤等[21]建立了大鼠肝臟出血模型，研究蒙脫石對(duì)肝臟創(chuàng)面的止血作用。結(jié)果表明，蒙脫石體外和體內(nèi)的凝血時(shí)間均比空白對(duì)照組、殼聚糖止血粉組明顯縮短，具有顯著的促進(jìn)創(chuàng)面止血功能及良好的生物安全性。筆者所在的課題組在鎂合金表面改性[22-24]、耐蝕性[25-27]、抗菌性[28-29]、生物相容性[30-31]等方面做了許多工作。前期已將MMT 成功制備到鎂合金表面，在此基礎(chǔ)上制備Zn-MMT[32]及MMT/BSA 涂層[33]，結(jié)果表明這兩種涂層提高了鎂合金的耐蝕性及生物相容性，Zn-MMT 涂層的抗菌性能優(yōu)越。

肝素是一種含磺酸基、磺氨基、羧酸基的天然陰離子多糖類(lèi)化合物，具有抗血栓、抗炎、抗過(guò)敏和降血脂等多種功能，是一種理想的抗凝血物質(zhì)。采用肝素功能化來(lái)提高醫(yī)用高分子材料的抗凝血性能已經(jīng)有幾十年的歷史。肝素在體內(nèi)與抗凝血酶III 、肝素結(jié)合蛋白和血小板因子等活性物質(zhì)結(jié)合后發(fā)揮抗凝血作用。在血管支架領(lǐng)域，研究人員常常將肝素制備載藥涂層[34-35]，解決支架植入后血管再狹窄的難題，效果顯著。

也有研究人員嘗試將蒙脫石、肝素聯(lián)合應(yīng)用。如陳亞紅等[36]將抗凝血肝素-季胺鹽插層蒙脫土制備成蒙脫土納米抗凝血中間體，然后與硅橡膠復(fù)合制備硅橡膠蒙脫土納米抗凝血復(fù)合材料，其具有較好的抗凝血性能。Meng 等[37]采用插層法制備了肝素苯扎爾銨改性蒙脫土/聚二甲基硅氧烷膜，抗凝性能明顯優(yōu)于純聚二甲基硅氧烷膜。但這些研究都局限在抗凝材料方面，將兩者聯(lián)合應(yīng)用在可降解鎂合金支架方面尚未見(jiàn)報(bào)道。

肝素是一種天然的具有陰離子特性的凝血抑制劑，具有強(qiáng)抗凝血作用，可將其與具有陽(yáng)離子表面的材料進(jìn)行結(jié)合，得到肝素化親水性材料。當(dāng)其與血液接觸時(shí)可持續(xù)釋放肝素，以防止局部血栓的形成，達(dá) 到抗凝血的效果。在金屬表面制備的肝素涂層不僅具有良好的血液相容性，可延緩或阻止血管內(nèi)支架置入早期形成血栓的過(guò)程，而且具有良好的穩(wěn)定性，有利于維持金屬良好的機(jī)械性能[38]。

因此，本試驗(yàn)在Na-MMT 涂層的基礎(chǔ)上，采用浸泡法，利用正負(fù)電荷相互吸引作用，使帶有負(fù)電荷的肝素與蒙脫石層間的陽(yáng)離子形成離子鍵，從而將其固定在蒙脫石內(nèi)表面得到HS-MMT 抗凝涂層，提高涂層的血液相容性。利用離子鍵將肝素固定在材料表面的結(jié)合方式能夠維持肝素的天然構(gòu)象，因而最大限度地優(yōu)化了涂層的抗凝效果[36]。本試驗(yàn)擬采用水熱法在鎂合金表面制備蒙脫石涂層，并采用浸泡法制得肝素/蒙脫石復(fù)合涂層以提高其耐蝕性和抗凝血性能，為可降解鎂合金血管支架表面改性提供了一種新方案。

1 試驗(yàn)

1.1 試劑及儀器

試劑包括：鈉化蒙脫石（藥品級(jí)）購(gòu)于浙江豐弘有限公司；肝素鈉（生物試劑）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基（生物級(jí)）購(gòu)于青島捷世康生物科技有限公司；氯化鈉等化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)于天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器包括：pH 計(jì)，STARTER 2100 型，奧豪斯儀器有限公司；電子天平，XY600-2C，常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，DF-101Z，鞏義市予華儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，DHG-9023A，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 復(fù)合涂層的制備

1.2.1 AZ31 鎂合金表面處理

采用規(guī)格為15 mm×15 mm×4 mm 和20 mm× 20 mm×4 mm 的擠壓態(tài)AZ31 鎂合金為研究對(duì)象，用360#、600#、800#、1000#水磨砂紙對(duì)樣品進(jìn)行打磨，以去除表面氧化層，用丙酮清除表面油污，乙醇清洗，吹干備用。

1.2.2 涂層的制備

稱(chēng)取鈉化蒙脫石（Na-MMT）溶于去離子水中，制成 Na-MMT 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2%的懸浮液，調(diào)節(jié)pH=10.2，80 ℃下恒溫?cái)嚢? h 后取60 mL 加入水熱釜中。將處理好的AZ31 鎂合金置于水熱釜中保持直立（放入2 塊聚四氟乙烯支撐），將其置于130 ℃恒溫干燥箱中，36 h 后取出，去離子水清洗，吹干得Na-MMT 涂層。將其浸泡于2.5 g/L 肝素鈉溶液（PBS緩沖溶液配成）中，調(diào)節(jié)pH=7.4，30 min 后取出，用去離子水清洗，吹干得肝素/蒙脫石（HS-MMT）復(fù)合涂層，制備流程見(jiàn)圖1。

圖1 HS-MMT 涂層制備流程圖 Fig.1 Schematic illustration of preparation of HS-MMT coating

1.3 HS-MMT 涂層的表征及性能檢測(cè)

1.3.1 涂層的表征

采用掃描電子顯微鏡（Nova Nano SEM 450，USA）觀(guān)察涂層表面、截面形貌及涂層厚度，利用能譜儀（EDS）分析樣品組成元素。通過(guò)傅里葉紅外分析儀（NicoletiS50）測(cè)定涂層官能團(tuán)。采用X-衍射儀（D/MAX-2500PC）表征物相組成。

1.3.2 涂層的耐蝕性測(cè)試

1）電化學(xué)測(cè)試。采用三電極體系，參比電極為飽和甘汞電極（SCE），對(duì)電極為鉑電極，工作電極為被測(cè)樣品，腐蝕介質(zhì)DMEM 溶液的pH 值為7.4，試驗(yàn)溫度為室溫，測(cè)試樣品面積與測(cè)試溶液體積比為1 cm2/400 mL。動(dòng)態(tài)極化測(cè)試時(shí)，電位掃描范圍相對(duì)自腐蝕電位從–350 mV（vs. SCE）到+450 mV（vs. SCE），掃描速度為1 mV/s。

2）析氫試驗(yàn)。用酸式滴定管、玻璃漏斗和燒杯自制析氫裝置。按1 cm2/25 mL的面積/溶液比將AZ31鎂合金基體和HS-MMT 涂層分別懸浮于DMEM 溶液中，每組3 個(gè)平行樣。將樣品浸泡5 d，每24 h 更新液體，溶液溫度保持在(36.5±1) ℃。每1 h 測(cè)定1 次樣品在腐蝕過(guò)程中產(chǎn)生的氫氣體積。

2 結(jié)果與討論

2.1 形貌觀(guān)察及成分分析

Na-MMT、HS-MMT 涂層電鏡形貌及EDS 分析見(jiàn)圖2?？梢钥闯觯捅剁R下Na-MMT 涂層呈顆粒狀結(jié)構(gòu)，HS-MMT 涂層除顆粒狀外還可觀(guān)察到片層狀結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)基體。與Na-MMT 涂層相比，HS-MMT涂層略為致密。從圖2b、2e 中可以看出，高倍鏡下兩種涂層均呈典型的蒙脫石片層狀結(jié)構(gòu)，此外圖2b、2e 中截面圖顯示 Na-MMT 涂層厚度為 40 μm，HS-MMT 涂層厚度為41 μm。以上結(jié)果表明，水熱法成功在A(yíng)Z31 鎂合金表面制備了Na-MMT 涂層和HS-MMT 涂層，且涂層制備過(guò)程未對(duì)蒙脫石的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，保留了蒙脫石的性質(zhì)。圖2c、2f 分別是Na-MMT 和HS-MMT 的EDS 元素分析，兩圖對(duì)比可知，HS-MMT 涂層中除存在O、Na、Mg、Al、Si、C 等Na-MMT 涂層的基本元素外還出現(xiàn)了N、S 元素，說(shuō)明通過(guò)浸泡法Na-MMT 涂層成功吸附了HS，在A(yíng)Z31 鎂合金表面制備了HS-MMT 涂層[21]。

圖2 Na-MMT 和HS-MMT 涂層電鏡下形貌及EDS 元素分析 Fig.2 SEM morphology and EDS of Na-MMT coating and HS-MMT coating

圖3 HS-MMT 涂層的XRD 譜圖 Fig.3 XRD patterns of HS-MMT coating

HS-MMT 涂層的XRD 譜圖如圖3 所示。從圖3中可以看出，HS-MMT 涂層與Na-MMT 涂層的圖譜 相似，都具有蒙脫石的特征峰，但由于肝素為有機(jī)物，XRD 測(cè)試無(wú)法顯示其特征峰。此外，HS-MMT 涂層與Na-MMT 涂層圖譜中還出現(xiàn)了Mg、Mg(OH)2的特征峰，說(shuō)明水熱法成功地將Na-MMT 應(yīng)用于A(yíng)Z31鎂合金表面并形成涂層[33]。

HS-MMT 涂層的FTIR 譜圖如圖4 所示。圖4 中顯示HS-MMT 涂層、Na-MMT 與Na-MMT 涂層在1038、1643、3627 cm–1處都出現(xiàn)了蒙脫石特有的吸收帶，分別對(duì)應(yīng)于Si—O 伸縮振動(dòng)、H—O—H 伸縮振動(dòng)和表面吸附水、層間水及氧化鎂引起的Al—O—H基團(tuán)的伸縮振動(dòng)。此外，HS-MMT 涂層與Na-MMT涂層在694 cm–1處還出現(xiàn)了Si—O—Mg 的伸縮振動(dòng)峰，這說(shuō)明在A(yíng)Z31 鎂合金表面成功制備了涂層[21,33,36]。與Na-MMT、Na-MMT 涂層相比，HS-MMT 涂層在620 cm–1處出現(xiàn)了肝素特有的—SO3H 伸縮振動(dòng)峰[39]，在1235 cm–1和3417 cm–1處出現(xiàn)了肝素分子中S==O和—NH—的伸縮振動(dòng)峰[38,40]，這證明在HS-MMT 涂層中存在肝素。

圖4 HS-MMT 涂層的FTIR 譜圖 Fig.4 FTIR spectrum of HS-MMT coating

2.2 耐蝕性能

所得涂層樣品的EIS 表征如圖5 所示。樣品的容抗弧直徑越大，說(shuō)明其耐蝕性能越好。Nyquist 圖顯示樣品的耐腐蝕性能依次為HS-MMT 涂層>Na-MMT涂層>AZ31 鎂合金，這表明HS-MMT 涂層能有效減緩AZ31 鎂合金在DMEM 溶液中的腐蝕，提高了其耐腐蝕能力。所得涂層樣品的極化曲線(xiàn)如圖6 所示，經(jīng)Tafel 外推法得到的涂層的自腐蝕電位（Ecorr）和腐蝕電流密度（Jcorr）見(jiàn)表1。由結(jié)果可知，在極化過(guò)程中，AZ31 鎂合金的Ecorr最小、Jcorr最大，與其相比，Na-MMT 涂層的 Ecorr增大、Jcorr減小，而HS-MMT 涂層的Ecorr最大、Jcorr最小，這說(shuō)明HS-MMT涂層具有更好的耐腐蝕性能，與Nyquist 曲線(xiàn)結(jié)果一致[41]。

圖5 鎂合金基體、Na-MMT 和HS-MMT 涂層的Nyquist曲線(xiàn) Fig.5 Nyquist plots of the magnesium substrate, Na-MMT and HS-MMT coatings

所得涂層樣品的析氫速率曲線(xiàn)如圖7 所示，從圖7 中可以看出，浸泡初期A(yíng)Z31 鎂合金的析氫速率較 大且下降速度較快，大約30 h 后析氫速率降低到較低水平，下降速度也變得緩慢。這可能是由于Cl 離子等腐蝕性離子的腐蝕作用導(dǎo)致AZ31 鎂合金在浸泡初期的析氫速率較快，然后由于腐蝕產(chǎn)物Mg(OH)2對(duì)AZ31 鎂合金產(chǎn)生保護(hù)作用[40,42-43]，腐蝕速率大大降低。由圖7 可知，Na-MMT 涂層與HS-MMT 涂層的析氫速率變化不大，平均析氫速率分別為0.024、0.016 mL/(cm·h)，說(shuō)明兩種涂層對(duì)AZ31 鎂合金起到了保護(hù)作用，而HS-MMT 涂層的保護(hù)作用更明顯，這除了與涂層的物理隔離作用有關(guān)外[44]，還可能與帶負(fù)電荷肝素的持續(xù)析出有關(guān)。

圖6 鎂合金基體、Na-MMT 和HS-MMT 涂層的極化曲線(xiàn) Fig.6 Polarization curves of the magnesium substrate, Na-MMT and HS-MMT coatings

表1 極化曲線(xiàn)的電化學(xué)參數(shù) Tab.1 Electrochemical parameters of the polarization curve

圖7 鎂合金基體、Na-MMT 和HS-MMT 涂層析氫速率 Fig.7 Hydrogen evolution rates as a function of time for the magnesium substrate, Na-MMT and HS-MMT coatings

進(jìn)一步分析Na-MMT 涂層的形成機(jī)理：在堿性條件下，Na-MMT 發(fā)生水化反應(yīng)后，其硅氧四面體表面具有的活性O(shè)H–可與鎂合金水化反應(yīng)產(chǎn)生的OH–在水熱條件下脫去H2O，形成氧橋，使Na-MMT 與AZ31 鎂合金緊密結(jié)合，形成Na-MMT 涂層，如圖8所示。Na-MMT 與AZ31 鎂合金可能發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)見(jiàn)式(1)—(4)。

蒙脫石發(fā)生水化反應(yīng)：

蒙脫石與NaOH 的反應(yīng)：

鎂合金發(fā)生水化反應(yīng)：

蒙脫石與Mg(OH)2反應(yīng)：

圖8 Na-MMT 涂層制備機(jī)理示意圖 Fig.8 Schematic illustration of Na-MMT coated Mg alloy AZ31

3 結(jié)論

1）采用水熱法在A(yíng)Z31 鎂合金表面制備了Na- MMT 涂層，在此基礎(chǔ)上通過(guò)浸泡法成功制備了致密的HS-MMT 復(fù)合涂層。

2）通過(guò)電化學(xué)試驗(yàn)和析氫速率測(cè)定對(duì)HS-MMT涂層的耐蝕性能進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，HS-MMT 涂層的自腐蝕電位（–1.20 V）高于 AZ31 鎂合金（–1.49 V），腐蝕電流密度降低了2 個(gè)數(shù)量級(jí)，且其平均析氫速率為0.016 mL/(cm·h)，明顯低于A(yíng)Z31 鎂合金的平均析氫速率。這表明AZ31 鎂合金HS-MMT涂層具有良好的耐腐蝕性能。